大黃蟲丸調(diào)控ASIC1a/VEGF通路緩解肝纖維化

曹 銳，朱月琴，林慧敏，李洋洋，聞祥瑞，莫文汐，程欣然，吳 麗，黃 艷

[安徽醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院、2.重大自身免疫性疾病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗室、3.炎癥免疫性疾病安徽省實(shí)驗室，安徽 合肥 230032；4.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)藥劑科，安徽 合肥 230002；5.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023]

肝纖維化是由多種病因引起的肝臟修復(fù)反應(yīng)，主要表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSC)的持續(xù)激活，以及細(xì)胞外基質(zhì)(extra cellular matrix，ECM)的過度沉積[1]。其重要病理特征為肝內(nèi)病理性血管的重構(gòu)促進(jìn)纖維間隔的產(chǎn)生，以及ECM過度沉積擠壓血管，導(dǎo)致氧氣輸送受阻[2]，肝臟局部產(chǎn)生低氧環(huán)境。HSC緊鄰肝竇內(nèi)皮細(xì)胞，激活后可在缺氧誘導(dǎo)因子的參與下轉(zhuǎn)錄、分泌血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等血管生成因子，加強(qiáng)與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞旁分泌通訊，驅(qū)動病理性血管的產(chǎn)生，破壞肝臟結(jié)構(gòu)，加劇肝臟病理性損傷[3]。

酸敏感離子通道(acid-sensitive ion channels，ASICs)是廣泛表達(dá)于細(xì)胞膜上的一類蛋白復(fù)合體，可感受胞外pH變化，通透陽離子。當(dāng)胞外pH降低，ASICs通道開放，引起Ca2+、Na+內(nèi)流，進(jìn)而參與伴有缺氧和組織酸化的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥、腫瘤等病理進(jìn)程中[4]。ASIC1a作為通透Ca2+的主要亞基，激活后開放通道介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流[5]。課題組前期研究表明[6]，在肝臟纖維化早期階段伴隨著炎癥反應(yīng)和局部組織酸化，ASIC1a表達(dá)上調(diào)，通過介導(dǎo)PI3K/Akt和ERK通路的激活，引起HSC的增殖與活化，加速肝纖維化的進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[7]，活化的HSC中ASIC1a激活，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，促進(jìn)鈣調(diào)素依賴蛋白激酶β(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase kinase，CaMKKβ)活化并高表達(dá)。CaMKKβ是一種由Ca2+激活的酶蛋白，廣泛分布于肝臟和大腦，在炎癥、造血、血管生成等生理過程中具有重要作用。有研究顯示[8]，ASIC1a可通過促進(jìn)大鼠滑膜成纖維細(xì)胞VEGF的釋放，調(diào)節(jié)大鼠滑膜血管翳的產(chǎn)生，進(jìn)而參與大鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗動物 60只SPF級♂SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，購于鄭州市華興實(shí)驗動物養(yǎng)殖場，生產(chǎn)許可證編號：SCXK(豫)2019-0002，飼養(yǎng)于室內(nèi)。溫度(25±2) ℃，濕度60%，通風(fēng)良好。

1.1.2藥品與試劑 CCl4(汕頭西隴化工廠公司)；橄欖油(上海源葉公司)DHZCP(北京同仁堂公司，批號：國藥準(zhǔn)字Z11021241)；秋水仙堿(西雙版納版納藥業(yè)公司，批號：國藥準(zhǔn)字H53021369)；RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑 (上海碧云天公司)；Rabbit mAb anti-α-SMA、Rabbit mAb anti-VEGF、Rabbit mAb anti-Collagen-I、Rabbit mAb anti-β-actin (北京博奧森公司)；Rabbit mAb anti-ASIC1a(美國Affinity公司)；Rabbit mAb anti-CaMKKβ(武漢博士德公司)；TRIzol裂解液(湖南艾科瑞公司)；天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aminotransferase，ALT)、 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)試劑盒(深圳邁瑞醫(yī)療器械公司)。

1.1.3主要儀器 Tissue-prp-03型組織破碎儀(上海凈信公司)；Western blot設(shè)備(美國Biorad公司)；4 ℃低溫冰箱 (青島海爾公司)；-20 ℃醫(yī)用低溫保存冰箱(安徽中科都菱)；-80 ℃醫(yī)用低溫保存箱(日本Panasonic)；、CFX Connect實(shí)時定量PCR儀(美國Biorad公司)、Microfuge 20R高速離心機(jī)(美國Beckman公司)。

1.2 方法

1.2.1分組及模型制備 60只雄性SD大鼠，隨機(jī)均分成6組：對照組(n=10)、模型組(n=10)、DHZCP低劑量組(n=10)、DHZCP中劑量組(n=10)、DHZCP高劑量組(n=10)、秋水仙堿組(n=10)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組及藥物處理組大鼠腹腔注射30%CCl4植物油混合溶液，每周2次，連續(xù)8周，對照組腹腔注射相同體積的植物油溶液。末次注射3d后，隔夜禁食，麻醉處死后取腹下腔靜脈血以及肝組織留存。

1.2.2DHZCP給藥方式 將DHZCP藥物磨成粉末狀，溶解于適量生理鹽水中。以成人60 kg體重折算等效劑量。DHZCP高劑量組(1 200 mg·kg-1); DHZCP 中劑量組(600 mg·kg-1); DHZCP低劑量組(300 mg·kg-1)；秋水仙堿組(0.2 mg·kg-1)。造模同時，不同劑量給藥組大鼠每天灌胃300、600、1 200 mg·kg-1的DHZCP，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)8周。

1.2.3血清學(xué)指標(biāo)檢測 大鼠麻醉后剖腹，腹部下腔靜脈取血，4 ℃、3 000×g，離心20 min，取上層血清，根據(jù)試劑盒的說明書測定AST、ALT。

1.2.4肝組織病理染色 取大鼠肝臟右葉相同位置組織，4%多聚甲醛固定2 d后，石蠟包埋，切片，HE、Masson染色法，封片，玻片掃描儀下觀察肝組織結(jié)構(gòu)病理變化并拍照。

1.2.5免疫組化檢測肝組織中ASIC1a、α-SMA蛋白表達(dá) 對肝組織右葉標(biāo)本進(jìn)行染色，微波抗原修復(fù)。封閉，PBS液沖洗，滴加一抗，放置4 ℃冰箱過夜。洗脫后滴加二抗，室溫孵育1 h，DAB反應(yīng)適量時間，流水沖洗，蘇木精復(fù)染，切片烘箱烤干，樹脂封片，鏡檢。

1.2.6q-PCR檢測肝組織中目的基因的表達(dá) 取30 mg大鼠肝組織，組織研磨儀中剪碎，加入1 mL TRIzol試劑提取總RNA。使用定量儀測定各組 RNA 濃度，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，以10 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，進(jìn)行以下程序擴(kuò)增：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，87 ℃ 10 s;以此循環(huán)55次。以GAPDH 作為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算各樣本ASIC1a、CaMKKβ、α-SMA、Collagen-I、VEGF的相對表達(dá)量，引物序列如Tab 1所示。

Tab 1 RNA primer sequence

1.2.7Western blot檢測肝組織中α-SMA、Collagen-I、ASIC1a、CaMKKβ、VEGF蛋白表達(dá) 切取30 mg大鼠肝組織，組織研磨儀中剪碎，加入1 mL含PMSF的RIPA裂解液提取總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒對各組的蛋白濃度進(jìn)行定量，調(diào)整蛋白濃度加入上樣緩沖液。進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離：80 V 30 min，120 V 60 min。電泳結(jié)束，采用濕轉(zhuǎn)200 mA恒流60 min轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。TBST清洗，加入一抗，4 ℃孵育過夜(孵育8 h以上)。次日，TBST清洗PVDF膜后，室溫下與山羊抗兔二抗孵育1 h。1 ∶1配制適量ECL顯影液，經(jīng)化學(xué)成像系統(tǒng)成像，使用ImageJ軟件進(jìn)行定量分析，將各蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin比較，衡量各組蛋白的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST水平變化如Fig 1顯示，模型組與對照組相比，血清ALT、AST水平均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，DHZCP高、中、低治療組和秋水仙堿治療組ALT含量(P<0. 05或P<0. 01)和AST含量(P<0.01)明顯降低，差異具有顯著性。

Fig 1 Serum ALT and AST levels of rats in each

2.2 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化Fig 2所示，對照組大鼠肝細(xì)胞正常，排列整齊，肝組織結(jié)構(gòu)完整。模型組肝組織結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，肝細(xì)胞索排列異常，出現(xiàn)假小葉結(jié)構(gòu)。肝細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)多個大小不等的圓形空泡，將核擠于一邊，此外細(xì)胞出現(xiàn)廣泛的脂肪變性，炎性壞死。Fig 2及Fig 3均顯示，模型組有明顯的纖維條索形成，膠原沉積明顯。而DHZCP各劑量治療組和秋水仙堿組相較于模型組肝細(xì)胞壞死及脂肪空泡明顯減少，纖維組織增生及纖維間隔的形成有所減輕。

Fig 2 HE staining results of rat liver tissues in each group (100×)

Fig 3 Masson staining results of rat liver tissues in each group(100×)

2.3 各組大鼠肝組織中ASIC1a 、α-SMA的表達(dá)免疫組化結(jié)果如Fig 4和Fig 5顯示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織ASIC1a、α-SMA抗原陽性表達(dá)明顯增加，DHZCP處理組可明顯降低模型組大鼠肝組織ASIC1a、α-SMA表達(dá)水平，以中、高劑量組最為明顯，提示DHZCP治療肝纖維化的作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)ASIC1a的表達(dá)有關(guān)。

Fig 4 Immunohistochemistry of α-SMA in rat liver tissues of all groups(200×)

2.4 各組大鼠肝組織中ASIC1a、CaMKKβ、VEGF、α-SMA、Collagen-Ⅰ基因mRNA表達(dá)變化如Fig 6所示，模型組大鼠肝組織中ASIC1a、CaMKKβ、VEGF、α-SMA、Collagen-Ⅰ基因mRNA表達(dá)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組比較，DHZCP低劑量組對ASIC1a、VEGF基因mRNA表達(dá)基本無影響，中、高劑量組ASIC1a、VEGF基因 mRNA的表達(dá)水平均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。DHZCP低、中、高治療組CaMKKβ、α-SMA、Collagen-Ⅰ基因mRNA表達(dá)相較于模型組均有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05或P<0. 01)。

Fig 6 Expression of ASIC1a，CaMKKβ，VEGF，α-SMA，Collagen-Ⅰ，mRNA in rat liver tissues of various

2.5 Western blot 法檢測各組大鼠肝組織 α-SMA、Collagen-Ⅰ、ASIC1a、CaMKKβ、VEGF蛋白表達(dá)變化如Fig 7所示，與對照組相比，模型組肝組織α-SMA、Collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05或P<0. 01)。與模型組相比，低劑量組α-SMA蛋白表達(dá)水平基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。中劑量組、高劑量組和秋水仙堿組α-SMA蛋白表達(dá)低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0. 05或P<0. 01)。與模型組相比，低劑量組和中劑量組Collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)基本持平，不具有統(tǒng)計學(xué)差異，高劑量組和秋水仙堿組Collagen-Ⅰ蛋白表達(dá)下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果證實(shí)DHZCP對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化有明顯的治療作用。

Fig 7 Expression of α-SMA and Collagen-Ⅰprotein in rat liver tissues of different

Fig 8顯示，相較于對照組，模型組肝組織ASIC1a、CaMKKβ、VEGF蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)。與模型組相比，DHZCP不同劑量給藥組可呈劑量依賴性降低肝組織ASIC1a、CaMKKβ、VEGF的蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。(P<0.05或P<0.01)。

Fig 8 Expression of ASIC1a，CaMKKβ and VEGF protein in rat liver tissues of each

3 討論

肝纖維化的鮮明特征是HSC的活化和以α-SMA和Collagen-I為主要成分的細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[12]。多項研究指出，HSC的活化在肝內(nèi)血管重構(gòu)，肝纖維化進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)顯示HSC活化所引起的細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，可壓迫肝內(nèi)血管，造成氧氣輸送受阻，為HSC分泌及釋放促血管生成類因子如VEGF、血管生成素1(angiopoietin-1，Ang-1)等刺激病理性血管的生成創(chuàng)造缺氧前提[3]。同時，肝纖維條索、纖維間隔的產(chǎn)生可改變原有肝臟的小葉結(jié)構(gòu)，常與新血管的生成并行，改變肝內(nèi)血流流向，加重肝纖維化的病理性損傷。本實(shí)驗采用經(jīng)典的CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型，血清ALT、AST結(jié)果及病理染色結(jié)果顯示，CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化組大鼠肝組織損傷嚴(yán)重，肝纖維化模型成功復(fù)制，并伴有假小葉及纖維索條產(chǎn)生等現(xiàn)象。DHZCP低、中、高治療組肝纖維條索及假小葉結(jié)構(gòu)均有不同程度減少，劑量依賴性降低血清ALT、AST水平，表明DHZCP可緩解CCl4誘導(dǎo)的肝臟病理性損傷，對肝纖維化有明顯的治療作用。

以往的研究多認(rèn)為，缺氧是誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的主要原因。低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α可上調(diào)VEGF的表達(dá)促進(jìn)腫瘤疾病中的血管增生[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)[14]，抑制ASIC1a表達(dá)及活性后，可減輕缺氧所致的神經(jīng)元損傷。如之前所述，缺氧、局部組織酸化是肝纖維化前期階段炎癥反應(yīng)的常見現(xiàn)象，炎癥、缺氧不僅為增強(qiáng)ASIC1a的表達(dá)及活性創(chuàng)造了條件，也為ASIC1a參與肝組織VEGF表達(dá)及血管重構(gòu)這一觀點(diǎn)提供了一定的理論依據(jù)。課題組在前期研究發(fā)現(xiàn)[15]，CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型中，ASIC1a表達(dá)顯著增加。體外研究顯示，HSC活化后，ASIC1a表達(dá)及通道活性增加，Ca2+內(nèi)流增多[5]。Ca2+作為重要的細(xì)胞信使，參與了胞間信息傳遞及包括血管生成在內(nèi)的多種生理進(jìn)程。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，ASIC1a可調(diào)節(jié)HSC中CaMKKβ/ERK通路，誘導(dǎo)HSC自噬發(fā)揮促纖維化作用[7]。CaMKKβ與Ca2+聯(lián)系緊密，且研究已表明，CaMKKβ可上調(diào)強(qiáng)有效的促纖維化因子VEGF的表達(dá)水平，影響組織血管生成[16]。這表明：一方面ASIC1a的表達(dá)及活性上調(diào)與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，另一方面ASIC1a可能是調(diào)節(jié)VEGF釋放、血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)?；诖?，本實(shí)驗探究了DHZCP對肝纖維化大鼠的治療作用及其ASIC1a/VEGF相關(guān)機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，模型組ASIC1a及VEGF蛋白與mRNA水平明顯上升，DHZCP治療組能夠有效逆轉(zhuǎn)ASIC1a 、VEGF蛋白水平的上調(diào)。此外，肝纖維化標(biāo)志物α-SMA和Collagen-I的表達(dá)也隨DHZCP劑量升高而逐漸降低，并與ASIC1a 、VEGF的表達(dá)變化呈相似趨勢，進(jìn)一步證實(shí)了DHZCP發(fā)揮治療肝纖維化的作用可能與調(diào)控ASIC1a/VEGF的表達(dá)有關(guān)。中藥因其循證、多組分、多渠道、多環(huán)節(jié)的綜合治療作用，在醫(yī)治肝病方面可發(fā)揮獨(dú)特的作用。既往研究指出[17]本方含有多種“活血化瘀”藥味成分如大黃、地黃、水蛭等，且君藥大黃中所富含的黃酮類物質(zhì)如大黃酸、大黃素、大黃酚等，均可抑制血管生成類蛋白表達(dá)。但由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，藥味間不同配伍可產(chǎn)生不同的治療作用，傳統(tǒng)藥理學(xué)方法不足以解釋復(fù)方中所起效單體成分。因此，ASIC1a如何調(diào)控VEGF表達(dá)及DHZCP復(fù)方單體成分的篩選和機(jī)制仍需后續(xù)實(shí)驗深入研究。

綜上所述，DHZCP可緩解CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，其機(jī)制可能與調(diào)控ASIC1a/VEGF通路有關(guān)。后續(xù)將在體外分子水平上篩選DHZCP的活性成分，更加深入細(xì)致的研究肝纖維化、ASIC1a和VEGF間的聯(lián)系。實(shí)驗的研究結(jié)果將為纖維化的治療和新的藥物靶點(diǎn)篩選提供新的思路和依據(jù)。