基于腸道菌群探討復(fù)方黑骨藤有效成分組對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠的調(diào)節(jié)作用

王 博，張 宏,2，洪文靜，李晨陽(yáng)，陳 健，沈 磊，李 琪,2

(四川師范大學(xué)1.生命科學(xué)學(xué)院、2. 植物功能基因組及生物信息研究中心，四川 成都 610101)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是以關(guān)節(jié)軟骨及滑膜為靶器官的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)滑膜增生、襯里層增厚以及多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征，患病率高，可漸進(jìn)性破壞關(guān)節(jié)軟骨，嚴(yán)重可致殘[1]。有一民間經(jīng)典組方——復(fù)方黑骨藤可用于治療RA，由黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)、秦艽(GentianamacrophyllaPall.)和延胡索(RhizomaCorydalis)按一定比例混合而成，黑骨藤具有祛風(fēng)除濕、活血消癰的功效[2]，秦艽具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛、退虛熱之功效，延胡索可活血、行氣、止痛[3]。本課題組前期研究[4-6]已確定黑骨藤中的綠原酸類、黃酮類和杠柳毒苷類，秦艽中的環(huán)烯醚帖類具有抗炎活性，延胡索中的生物堿類起鎮(zhèn)痛作用?；谏鲜鲇行ЫM分，分別制得三味藥的有效片段，綠原酸類、黃酮類和杠柳毒苷類占黑骨藤有效片段質(zhì)量比的0.55，環(huán)烯醚帖類占秦艽有效片段質(zhì)量比的0.51，生物堿類分別占延胡索30%乙醇洗脫片段、95%乙醇洗脫片段質(zhì)量比的0.46、0.54。此外，分別完成黑骨藤、秦艽、延胡索有效片段的最佳抗炎實(shí)驗(yàn)，確定出它們各自的最佳劑量，最后根據(jù)三味藥物的最佳有效成分組配伍為復(fù)方黑骨藤有效成分組，并對(duì)其進(jìn)行量效關(guān)系考察確立最佳配比[7]。

隨著微生態(tài)的發(fā)展，越來(lái)越多的證據(jù)表明，腸道微生物的組成和功能變化與RA發(fā)病密切相關(guān)，腸道菌群起到維護(hù)胃腸道屏障、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力的作用，若腸道菌群紊亂，腸道菌群多樣性改變，致病菌增加，優(yōu)勢(shì)菌群減少，便會(huì)影響機(jī)體的正常生理功能，導(dǎo)致疾病發(fā)生。研究表明使用抗風(fēng)濕藥后可一定程度上改善腸道菌群失衡，菌群結(jié)構(gòu)與炎癥程度具有一定的聯(lián)系[8]，腸道菌群改善后可減少相關(guān)炎癥因子的表達(dá)以減輕關(guān)節(jié)炎病變[9]。

目前，研究復(fù)方黑骨藤與其有效成分組對(duì)RA的治療作用多采用生物指標(biāo)判定和病理組織切片觀察等方法，成本高且耗時(shí)長(zhǎng)，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用16s rRNA高通量測(cè)序技術(shù)探究CIA大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，觀察復(fù)方黑骨藤有效成分組對(duì)大鼠腸道菌群的影響，分析差異物種并預(yù)測(cè)其功能，以新的角度評(píng)判其治療作用與效果，以期提升人們對(duì)復(fù)方黑骨藤有效成分組與腸道微生物關(guān)系的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)♂SD大鼠30只，體質(zhì)量(120±10)g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，許可證號(hào)為SCXK(川)2015-030。飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1)℃，濕度(50%～60%)，自然光暗循環(huán)，自由攝食飲水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 藥材及試劑黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)2018年購(gòu)自西昌藥材市場(chǎng)，秦艽(Gentianamacrophyllapall.，批號(hào)：20180527)及延胡索(Rhizomacorydalis，批號(hào)：20180629)均購(gòu)自北京同仁堂股份有限公司，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)張藝教授鑒定為合格藥材。雷公藤多苷片(批號(hào)：20180501，國(guó)藥準(zhǔn)字Z42021212，規(guī)格10 mg/片，遠(yuǎn)大醫(yī)藥黃石飛云制藥有限公司)，弗氏完全佐劑(Sigma-aldrich，批號(hào)：F5881)，牛Ⅱ型膠原(上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S12008)，乙醇(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)，生理鹽水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：L218112202)；D-101大孔樹(shù)脂(分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，土壤DNA提取試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)，Qubit dsDNA Assay Kit(美國(guó)Life Technologies公司)，TaKaRa Ex Taq(日本TaKaRa公司)，TNF-α、IL-6試劑盒(上海邦奕生物科技有限公司，批號(hào)：201903)。

1.3 儀器580BR10905 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，Centrifuge 5418臺(tái)式高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，QIAxtractor(SN 002358，德國(guó)QIAGEN公司)，生物分析儀(美國(guó)Agilent公司)，MISEQ測(cè)序儀(美國(guó)Illumina公司)，YRE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(予華儀器有限責(zé)任公司)，Mill-Q去離子水發(fā)生器(美國(guó)Millipore公司)，BP211D型電子天平(德國(guó)Sartorius公司)，冷凍干燥機(jī)(美國(guó)VIRTIS公司)。

1.4 藥物制備

1.4.1黑骨藤、秦艽和延胡索有效片段的制備 參照實(shí)驗(yàn)室前期提取方法[5-6]，黑骨藤、50%乙醇按料液比1 ∶20的比例50 ℃超聲提取，秦艽、50%乙醇按料液比1 ∶20的比例80 ℃回流提取，延胡索、50%乙醇按料液比1 ∶25的比例75 ℃超聲提取，三味藥經(jīng)濃縮后分別上樣于D101大孔樹(shù)脂洗脫，均先棄去水片段，黑骨藤用20%乙醇洗脫并收集，秦艽用10%乙醇洗脫并收集，延胡索依次用30%乙醇、95%乙醇洗脫并收集合并，3種洗脫片段分別經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥至干粉，即為黑骨藤有效片段(得率4.0%)、秦艽有效片段(得率9.9%)、延胡索有效片段(得率2.5%)。

1.4.2傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤的制備 將黑骨藤、秦艽和延胡索以2.5 ∶1 ∶1的比例混合均勻，打磨成粉后過(guò)篩，與50%乙醇按1 ∶40的料液比80 ℃回流提取，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥至干粉，即為傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤藥物(得率25.1 %)。

1.5 造模、分組及給藥隨機(jī)取6只大鼠作為空白對(duì)照組(K)，其余參照前期方法[7]以牛Ⅱ型膠原乳化液制備CIA大鼠模型，1周后進(jìn)行二次免疫，隨機(jī)分為模型組(M)、陽(yáng)性對(duì)照組(Y)、復(fù)方黑骨藤有效成分組(G)、傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組(C)，每組6只。d 21給藥，K、M組均灌胃蒸餾水，Y組灌胃雷公藤多苷(40.0 mg·kg-1)，G組灌胃復(fù)方黑骨藤有效成分組(265.7 mg·kg-1，其中含黑骨藤有效片段84.0 mg·kg-1，秦艽有效片段175.0 mg·kg-1，延胡索有效片段6.7 mg· kg-1，以各有效片段干粉重量計(jì))，C組灌胃?jìng)鹘y(tǒng)復(fù)方黑骨藤(226.3 mg·kg-1，以傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤藥物干粉重量計(jì))，其中C、G組劑量為前期實(shí)驗(yàn)[7,10]篩選出的最佳劑量。每天灌胃1次，連續(xù)28 d。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)及取樣于造模前1 d及造模后d 7、14、21、28、35、42、49測(cè)定大鼠體重和足趾厚度，采用五級(jí)評(píng)分法評(píng)定關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index,AI)。鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨和滑膜的組織形態(tài)，分別對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的細(xì)胞狀態(tài)、潮線狀態(tài)以及滑膜中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜組織增生等情況進(jìn)行評(píng)分。d 49時(shí)，取各組大鼠的盲腸及內(nèi)容物至凍存管，液氮保存3 h后移至-80 ℃，用于測(cè)序分析。無(wú)菌環(huán)境下取大鼠右腿踝關(guān)節(jié)，10%甲醛固定，制備組織切片。剔除大鼠右腿的皮膚和肌肉組織后粉碎，生理鹽水浸泡1 h，離心取上清，用于免疫組化檢測(cè)。

1.7 Illumina測(cè)序提取樣本的基因組DNA并檢測(cè)其純度和濃度，取適量樣品，用無(wú)菌水稀釋至1 mg·L-1，以其為模板，使用帶Barcode的特異引物，Takara Ex Taq高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)檢測(cè)、純化后作為模板進(jìn)行二輪擴(kuò)增，再經(jīng)檢測(cè)純化后進(jìn)行Qubit定量，根據(jù)其濃度進(jìn)行等量混樣，并上機(jī)測(cè)序。

使用Vsearch 2.4.2軟件對(duì)優(yōu)質(zhì)序列按照97%的相似度進(jìn)行OTU聚類，基于分類學(xué)信息進(jìn)行α多樣性(Chao1、Goods coverage等物種豐富度統(tǒng)計(jì)，Shannon等物種多樣性統(tǒng)計(jì)，Goods coverage反映樣本的低豐度OTU覆蓋情況，物種累積曲線和豐度等級(jí)圖)和β多樣性分析[PCoA、NMDS分析，利用R語(yǔ)言(version 3.2.3)進(jìn)行ANOSIM分析]，再采用多級(jí)物種差異判別分析(LEfSe)及線性判別分析(LDA)尋找組間差異菌屬(LDA>2為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)，最后根據(jù)OTU計(jì)算出各功能類別的豐度進(jìn)行功能預(yù)測(cè)(KEGG)。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量、足腫脹度及AI評(píng)分結(jié)果如Fig 1A、B、C所示，二次致炎后至給藥前(d 7～21)，與K組相比，造模組大鼠體質(zhì)量明顯降低(P<0.01)，足腫脹度和AI評(píng)分明顯升高(P<0.01)，說(shuō)明造模成功。給藥后，各給藥組大鼠體質(zhì)量、足腫脹度及AI評(píng)分均有不同程度的恢復(fù)。給藥21 d后(d 42)，與M組相比，Y、G組AI評(píng)分明顯降低(P<0.01)，C組明顯降低(P<0.05)，且Y、G組與C組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥28 d后(d 49)，與M組相比，各給藥組足腫脹度和AI評(píng)分均明顯降低(P<0.01)，且G組足腫脹度與K組無(wú)明顯差異，而Y、C組較K組差異明顯(P<0.05)。

2.2 IL-6及TNF-α含量結(jié)果如Fig 1D所示，與K組相比，M組IL-6和TNF-α明顯增加，差異有顯著性(P<0.01)；與M組相比Y、G、C組TNF-α和IL-6水平明顯減少(P<0.05，P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Y、G、C組TNF-α和IL-6水平與空白組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Fig 1 Effect of different medicines with CIA rats

2.3 病理學(xué)指標(biāo)關(guān)節(jié)軟骨與滑膜病理切片如Fig 1E、F所示，K組大鼠軟骨及滑膜組織形態(tài)正常。與K組相比，M組大鼠淺層軟骨細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)輕微纖維化，滑膜內(nèi)襯層明顯增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，滑膜襯里下層可見(jiàn)纖維組織大量增生。與M組相比，各給藥組均具極明顯差異：Y組關(guān)節(jié)軟骨基本完整，部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部纖維組織輕度增生；C組關(guān)節(jié)軟骨基本完整，炎性細(xì)胞有不同程度的浸潤(rùn)，局部纖維組織輕度增生；G組關(guān)節(jié)軟骨基本完整，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.4 菌群多樣性分析

2.4.1α多樣性分析 結(jié)果如Tab 1所示，與K組相比，M組Shannon值明顯增加(P<0.05)，Observed spieces和Chao1值也有所增加，提示CIA大鼠腸道菌群多樣性明顯增加、菌群總數(shù)增多；與M組相比，各給藥組所有指數(shù)均呈下降趨勢(shì)，其中，G組Shannon值明顯降低(P<0.05)，各組Goods coverage值均較高，表明樣本中序列沒(méi)有被測(cè)出的概率較低。如Fig 2A、B所示，物種積累曲線趨于平緩，豐度等級(jí)圖的曲線水平方向較寬，下降趨勢(shì)較平緩，說(shuō)明抽樣充分且細(xì)菌的豐度和均勻度合理。如Fig 2C所示，各組共用OTU數(shù)為2 420，與K組相比，M組小鼠腸道細(xì)菌OTU增加；較于M組，各給藥組OTU均減少。

Fig 2 Diversity analysis of gut microbiota in rats

2.4.2β多樣性分析 從PCoA分析結(jié)果可看出各組菌群整體結(jié)構(gòu)發(fā)生不同程度的變化(Fig 3)。NMDS分析結(jié)果如Fig 4所示，Stress值均小于0.1，說(shuō)明降維效果較好，樣本點(diǎn)均具有很好的代表性，圖中同一組的樣本距離較近，且組間樣本具有明顯距離，說(shuō)明組內(nèi)生物重復(fù)好，組間具有不同程度差異。ANOSIM分析表明，K-M(R=0.387 0，P=0.006)和M-G(R=0.425 9，P=0.003)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)存在極明顯差異，M-Y(R=0.203 7，P=0.040)以及M-C(R=0.361 1，P=0.016)存在明顯差異。

Fig 3 Multiple sample PCoA analysis

Fig 4 Multiple sample NMDS analysis

2.5 菌群的豐度變化

2.5.1造模對(duì)大鼠腸道菌群的影響 門水平上(Fig 5A)，主要以擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)為主，與K組相比，M組的擬桿菌門明顯減少(P<0.05)，厚壁菌門具有增加的趨勢(shì)，K組厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)值為0.62，造模后上升至0.86。屬水平上(Fig 5B)，與K組相比較，M組擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)明顯減少(P<0.05)，普雷沃氏菌屬(Prevotella_9、Prevotellaceae_UCG-003)減少，擬桿菌屬(Bacteroides)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcus_1和Rumino-coccaceae_UCG-005)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、顫桿菌屬(Oscillibacter)、假節(jié)桿菌屬(Parasutterella)和理研菌屬(Rikenellaceae_RC9_gut_group)有增加的趨勢(shì)。

2.5.2實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)大鼠腸道菌群的影響 門水平上(Fig 5A)，與M組相比，Y、G、C組擬桿菌門和厚壁菌門兩種菌門均具有恢復(fù)趨勢(shì)，F(xiàn)/B值分別為Y組0.83、G組0.69、C組0.72，G組更接近于K組水平。屬水平上(Fig 5B)，Y組擬普雷沃菌屬、毛螺菌屬、顫桿菌屬、理研菌屬和Prevotella_9增加，擬桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、瘤胃球菌屬、Prevotellaceae_UCG-003和乳酸桿菌屬有減少的趨勢(shì)；G組擬普雷沃菌屬明顯增加(P<0.05)，與空白組無(wú)明顯差異，Prevotella_9增加，毛螺菌屬、擬桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、瘤胃球菌屬、Prevotellaceae_UCG-003、乳酸桿菌屬、顫桿菌屬和理研菌屬均有減少的趨勢(shì)；C組擬普雷沃菌屬明顯增加(P<0.05)，與空白組無(wú)明顯差異，毛螺菌屬和乳酸桿菌屬具有增加的趨勢(shì)，擬桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、瘤胃球菌屬、Prevotellaceae_UCG-003、Prevotella_9、顫桿菌屬和理研菌屬均減少。

Fig 5 Relative abundance of bacteria community at phylum (A) and genus (B) levels

2.6 菌群的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析如Fig 6所示，與K組相比，M組杜氏桿菌屬(Dubosiella)、mouse_gut_metagenome、Afifella、Negadavirga、Negativibacillus、Clade_la、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae_UCG_009)、Pseudarthrobacter明顯增加，Staphylococcus、Saccharospirillum、Thalassobaculum明顯減少。與M組相比，Y、G、C組Afifella明顯減少，G、Y組Negativibacillus明顯減少，G組杜氏桿菌屬、Negadavirga明顯減少，且與K組均無(wú)明顯差異。

Fig 6 LDA-based distribution histogram of K-M group (A), M-Y group (B), M-G group (C) and M-C group (D)

2.7 菌群功能預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)6條通路具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：輔因子和維生素的代謝、硝基甲苯降解、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和生物降解、蛋白質(zhì)的消化和吸收、電子傳遞載體、細(xì)胞凋亡，如Fig 7所示。與K組相比，M組蛋白質(zhì)的消化和吸收和細(xì)胞凋亡通路均明顯減少(P<0.05)，其余四條通路均明顯增加(P<0.05)；與M組相比，給藥組前五條通路均有不同程度的恢復(fù)趨勢(shì)，在細(xì)胞凋亡通路上，Y、C組無(wú)明顯差異，G組明顯增加(P<0.05)。

Fig 7 Prediction of gut microbiota function in rats of five groups

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥7 d后，與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組和復(fù)方黑骨藤有效成分組AI評(píng)分明顯降低(P<0.01)，傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組明顯降低(P<0.05)；給藥28 d后，與模型組相比，各給藥組足腫脹度均明顯降低(P<0.01)，且復(fù)方黑骨藤有效成分組與空白組無(wú)顯著性差異，而陽(yáng)性對(duì)照組和傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組與空白組均具有明顯差異(P<0.05)，表明復(fù)方黑骨藤有效成分組可能改善CIA大鼠關(guān)節(jié)滑膜中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，保護(hù)和修復(fù)其受損的軟骨組織，在減輕大鼠足趾腫脹方面效果更明顯。從病理切片中可看出，各給藥組關(guān)節(jié)病變情況均有所改善，且復(fù)方黑骨藤有效成分組在關(guān)節(jié)滑膜中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織增生等方面的治療作用更加明顯。

腸道菌群結(jié)構(gòu)圖顯示，CIA大鼠的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)和豐度與空白組大鼠存在明顯差異，擬桿菌門、擬普雷沃菌屬、普雷沃氏菌屬均具有維持腸道正常生理、促進(jìn)機(jī)體正常發(fā)育等功能，其豐度在造模后均明顯降低，說(shuō)明CIA大鼠正常生理被破壞。杜氏桿菌屬為腸道炎癥相關(guān)菌屬，造模后其豐度明顯增加(P<0.05)，表明CIA大鼠腸道失衡。毛螺菌屬、乳酸桿菌屬、顫桿菌屬、理研菌屬、假節(jié)桿菌屬和瘤胃球菌屬等有益菌豐度增加可能是由于造模藥物激活大鼠機(jī)體免疫反應(yīng)所導(dǎo)致，其中毛螺菌屬、顫桿菌屬、假節(jié)桿菌屬產(chǎn)生的短鏈脂肪酸可抑制關(guān)節(jié)炎病癥[11]，乳酸桿菌可提升機(jī)體免疫，這些菌屬的變化為腸道菌群紊亂引起腸道屏障功能的失調(diào)，進(jìn)而引發(fā)炎癥性疾病的理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

給藥后，陽(yáng)性對(duì)照組、復(fù)方黑骨藤有效成分組和傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組分別有9種(擬普雷沃菌屬、Afifella、Negativibacillus、Pseudarthrobacter、Prevotella_9、擬桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、瘤胃球菌屬和乳酸桿菌屬)、13種(擬普雷沃菌屬、Afifella、Negadavirga、Negativibacillus、杜氏桿菌屬、Prevotella_9、擬桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、瘤胃球菌屬、乳酸桿菌、顫桿菌屬、理研菌屬和毛螺菌屬)、8種(擬普雷沃菌屬、Afifella、Pseudarthrobacter、擬桿菌屬、假節(jié)桿菌屬、瘤胃球菌屬、顫桿菌屬和理研菌屬)菌屬均具有恢復(fù)到空白組的趨勢(shì)。復(fù)方黑骨藤有效成分組擬普雷沃菌屬、Afifella、Negadavirga、Negativibacillus和杜氏桿菌屬較模型組差異均明顯(P<0.05)，且與空白組均無(wú)明顯差異，表明復(fù)方黑骨藤有效成分組大鼠腸道恢復(fù)正常生理功能。同時(shí)，從腸道菌群結(jié)構(gòu)圖也可看出復(fù)方黑骨藤有效成分組菌群結(jié)構(gòu)較傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤組更接近于空白組，說(shuō)明復(fù)方黑骨藤有效成分組可通過(guò)修復(fù)CIA大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，使其恢復(fù)自身免疫，這與抗類風(fēng)濕藥物可使腸道菌群得以部分恢復(fù)結(jié)果一致[8]。

TNF-α參與軟骨破壞等關(guān)節(jié)炎致病機(jī)制，IL-6能促進(jìn)其釋放，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)。研究表明，TNF-α、IL-6與炎癥相關(guān)菌屬關(guān)系密切，普雷沃氏菌屬與超敏C反應(yīng)蛋白和IL-6等炎癥標(biāo)志物呈負(fù)相關(guān)[12]，擬桿菌屬與TNF-α和IL-1β等炎癥因子呈正相關(guān)[13]，造模后普雷沃氏菌屬豐度減少、擬桿菌屬豐度增加，這與CIA大鼠TNF-α和IL-6明顯增加(P<0.05)相符，提示這兩種菌屬均與CIA大鼠炎癥的發(fā)生有關(guān)。復(fù)方黑骨藤有效成分組可使CIA大鼠的IL-6和TNF-α明顯減少(P<0.05)，恢復(fù)到正常水平，這與改善腸道菌群可抑制炎癥因子表達(dá)的結(jié)論吻合[9]。

功能預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，造模后①輔因子和維生素的代謝、②次級(jí)代謝物的合成和分解、③蛋白質(zhì)的消化和吸收、④電子傳遞載體豐度明顯增加(P<0.05)、⑤細(xì)胞凋亡通路豐度明顯減少(P<0.05)。給藥后，各給藥組均有一定的恢復(fù)趨勢(shì)，且復(fù)方黑骨藤有效成分組細(xì)胞凋亡通路的豐度明顯增加(P<0.05)。復(fù)方黑骨藤的有效成分之一原花青素對(duì)輔因子Fe3+具有極強(qiáng)的還原能力[14]；可與前體蛋白或生物活性肽相互作用，對(duì)其消化和吸收、代謝及功能產(chǎn)生影響[15]；可抑制NAD(P)H氧化酶的活化，影響生物過(guò)程中的電子傳遞作用[16]。上述研究結(jié)果提示復(fù)方黑骨藤有效成分組對(duì)關(guān)節(jié)炎大鼠病理改變的作用可能與①③④通路有關(guān)。復(fù)方黑骨藤的有效成分之一綠原酸可抑制B16黑色素瘤細(xì)胞中黑色素生成[17]，提示復(fù)方黑骨藤有效成分組的抗炎藥效可能與②通路有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)秦艽能阻斷與凋亡相關(guān)的含CARD的斑點(diǎn)樣蛋白，還可抑制人RA成纖維滑膜細(xì)胞的增殖以減輕RA癥狀[18]，此外，本課題組前期發(fā)現(xiàn)，復(fù)方黑骨藤有效成分組可激活凋亡因子caspase-3[7]，提示復(fù)方黑骨藤有效成分組可能影響⑤通路。有關(guān)細(xì)胞凋亡通路與復(fù)方黑骨藤有效成分組的抗炎機(jī)制還需做進(jìn)一步的探究。

綜上所述，復(fù)方黑骨藤有效成分組可通過(guò)減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和組織增生，減輕關(guān)節(jié)腫脹，以及降低IL-6和TNF-α的水平來(lái)發(fā)揮抗炎功效，相對(duì)于傳統(tǒng)復(fù)方黑骨藤，其更能修復(fù)CIA大鼠紊亂的腸道菌群譜以恢復(fù)機(jī)體免疫，進(jìn)一步說(shuō)明腸道菌群在復(fù)方黑骨藤有效成分組對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療中發(fā)揮作用。功能預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)復(fù)方黑骨藤有效成分組可能影響細(xì)胞凋亡，提示復(fù)方黑骨藤有效成分組可能通過(guò)抑制滑膜細(xì)胞增殖、促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡來(lái)緩解關(guān)節(jié)炎，為全面闡釋其治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其他疾病的作用提供一定參考。