基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體外研究探究瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制

馮 利,莊安琪,李軼維,王 月,楊 科

(1.國家開放大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院,北京 100039；2.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310018)

動(dòng)脈粥樣硬化是一種主要發(fā)生在大中型動(dòng)脈的慢性疾病,以脂質(zhì)的積累,平滑肌細(xì)胞的增殖,細(xì)胞凋亡、壞死和纖維化,以及局部炎癥為特征。動(dòng)脈粥樣硬化可造成冠狀動(dòng)脈狹窄,引起心肌梗死和心力衰竭；動(dòng)脈粥樣硬化斑塊引起的動(dòng)脈狹窄或破裂可導(dǎo)致腦部短暫性缺血、缺血性中風(fēng)或出血性中風(fēng)的發(fā)作。采用阿托伐他汀降血脂或阿司匹林抗血小板聚集是目前臨床上治療動(dòng)脈粥樣硬化的常規(guī)方法。但因動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,這些方法并不能達(dá)到良好治療效果。中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn),在防治動(dòng)脈粥樣硬化方面具有自身獨(dú)特優(yōu)勢(shì),因此越來越受到人們的關(guān)注。

瓜蔞薤白半夏湯最早記載于《金匱要略》,主治痰盛瘀阻胸痹證。胸痹指胸部悶痛、喘息不得臥,即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)上的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病。已有文獻(xiàn)報(bào)道[1-2],瓜蔞薤白半夏湯聯(lián)合西藥治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病、心絞痛患者的總有效率可達(dá)96.77%,且可通過升高NO含量治療缺氧性肺動(dòng)脈高壓。已有研究發(fā)現(xiàn)[3-7],瓜蔞薤白半夏湯對(duì)抗動(dòng)脈粥樣硬化可能與抗炎、減輕氧化損傷、保護(hù)血管內(nèi)皮、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、降低病變動(dòng)脈壁硫酸軟骨素蛋白聚糖、硫酸皮膚素蛋白聚糖含量有關(guān)?；谥兴幎喟悬c(diǎn)、多通路的治療特點(diǎn),瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制值得進(jìn)一步探究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了生物學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)等多學(xué)科的相關(guān)知識(shí),可從整體角度探討藥物與疾病的相關(guān)性,符合中醫(yī)學(xué)整體觀與辨證原則[8]。從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度研究瓜蔞薤白半夏湯主要關(guān)注的疾病是冠心病[7,9]、慢性阻塞性肺病[10],其作用機(jī)制與其調(diào)節(jié)血小板活化及炎癥通路等相關(guān)。此外,還有未經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的瓜蔞薤白半夏湯臨床治療器官定位和藥效成分預(yù)測(cè)[11]相關(guān)的研究。但是,盡我們最大所能,我們未檢索到基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的優(yōu)勢(shì)與方法分析各目標(biāo)點(diǎn)之間的潛在關(guān)系并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖,探究瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1瓜蔞薤白半夏湯化合物及靶點(diǎn)檢索 本研究以“瓜蔞”、“薤白”、“半夏”為檢索詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(TCMSP,https：//tcmspw.com/tcmsp.php)中檢索瓜蔞薤白半夏湯的所有化學(xué)成分,然后以藥物口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為篩選條件檢索相關(guān)化學(xué)成分及相應(yīng)靶點(diǎn)。

1.1.2動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn)檢索與篩選 以“Atherosclerosis”為檢索詞在OMIM(https：//omim.org/)、GeneCards(https：//www.genecards.org/)、DrugBank(https：//go.drugbank.com/)和TTD數(shù)據(jù)庫(http：//db.idrblab.net/ttd/)檢索并去重得到動(dòng)脈粥樣硬化的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.1.3瓜蔞薤白半夏湯與動(dòng)脈粥樣硬化共同靶點(diǎn)篩選 將以上檢索得到的瓜蔞薤白半夏湯與動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)上傳于Venn圖制作平臺(tái)(http：//www.ehbio.com/ImageGP/ index.php/Home/Index/VennDiagram.html)得到二者的交集靶點(diǎn),即瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。

1.1.4中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cytoscape 3.6.1軟件以三味中藥(瓜蔞、薤白、半夏)篩選得到的化合物分子、交集靶點(diǎn)以及動(dòng)脈粥樣硬化為靶點(diǎn),構(gòu)建“中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.1.5蛋白相互作用圖構(gòu)建 將瓜蔞薤白半夏湯與動(dòng)脈粥樣硬化的交集靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)中,并將條件物種設(shè)置為“Homo sapiens”,最小相互作用分?jǐn)?shù)設(shè)置為0.400 0。然后將獲得的蛋白相互作用圖導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中利用Network Analyzer模型進(jìn)行可視化分析。

1.1.6富集分析 將獲得的瓜蔞薤白半夏湯和動(dòng)脈粥樣硬化共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫中(https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp),得到靶點(diǎn)相應(yīng)的功能及在信號(hào)通路中的作用；限定物種條件為“Homo sapiens”,閾值設(shè)定為P<0.05,進(jìn)行Gene ontology(GO)生物過程分析和Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG)通路富集分析,并利用GraphPad prism 8.0繪制柱狀圖并在ImageGp平臺(tái)上(http：//www.ehbio.com/Cloud_Platform/front/)制作氣泡圖。

1.2 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1藥物與試劑 β-谷甾醇(B21972)購自上海源葉生物有限公司；氧化型低密度脂蛋白(XS20201007,Oxidized low-density lipoprotein, Ox-LDL)購自北京協(xié)生生物科技有限責(zé)任公司；白細(xì)胞介素-1β(EK0392,interleukin 1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(EK0410,interleukin 6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(EK0525,tumor necrosis factor-α,TNF-α)試劑盒購自Boster 生物技術(shù)公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(C2006,JC-1)、吡咯烷二硫代甲酸銨鹽(S1808,Ammonium pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)和噻唑藍(lán)溴化四唑(ST1537,MTT)購自碧云天生物技術(shù)有限公司；NF-κB抗體(10745-1-AP)、IL-1β抗體(16806-1-AP)、IL-6抗體(21865-1-AP)、TNF-α抗體(17590-1-AP)購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2.2細(xì)胞來源與培養(yǎng) HAEC細(xì)胞購自美國ATCC細(xì)胞庫,細(xì)胞由含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),并置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.3MTT法測(cè)定細(xì)胞活力 HAEC細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中,置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。首先在Ox-LDL造模濃度實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞分為8組,分別加入0、40、50、60、70、80、90、100 mg·L-1的Ox-LDL,孵育24 h后移除細(xì)胞液并加入1 g·L-1的MTT溶液,孵育4 h后，加入100 μL的DMSO,然后,在570 nm波長下測(cè)定OD值。在β-谷甾醇毒性實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞分為6組,分別加入0、0.25、0.5、1、2、4 mg·L-1的β-谷甾醇,在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后,采用上述Ox-LDL造模濃度實(shí)驗(yàn)中所述方法,利用MTT溶液測(cè)定每孔細(xì)胞的OD值；在β-谷甾醇對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)中,將細(xì)胞分為7組,Control、Model及5個(gè)β-谷甾醇組(0.25、0.5、1、2、4 mg·L-1),β-谷甾醇組預(yù)給藥不同濃度梯度的β-谷甾醇,孵育12 h后,除Control組外,其他組別均加入40 mg·L-1的Ox-LDL,最后,采用上述Ox-LDL造模濃度實(shí)驗(yàn)中所述方法,測(cè)定細(xì)胞OD值。

1.2.4JC-1法測(cè)定細(xì)胞凋亡情況 將HAEC細(xì)胞接種于24孔板,分為Control、Model和β-谷甾醇組,當(dāng)細(xì)胞處理結(jié)束后,移除細(xì)胞液,然后每孔加入1 mL的JC-1染色工作液,在37 ℃黑暗條件下孵育30 min,吸去上清,用JC-1染色緩沖液洗滌5次,并加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液,最后在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.5酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子的表達(dá) 將HAEC細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔的密度接種于24孔板,培養(yǎng)24 h后,將細(xì)胞分為Control、Model、β-谷甾醇組和PDTC組,然后按上述方法處理各組細(xì)胞,其中PDTC組細(xì)胞加入0.125 g·L-1的PDTC,孵育2 h后加入40 mg·L-1的Ox-LDL進(jìn)行細(xì)胞造模；培養(yǎng)結(jié)束后,將細(xì)胞培養(yǎng)液收集于無菌EP管中,在1 000 r·min-1的條件下離心5 min后,移入新的EP管中備用,最后,根據(jù)ELISA試劑盒說明書所述的檢測(cè)步驟檢測(cè)細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。

1.2.6蛋白印跡法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的表達(dá) 首先采用RIPA緩沖液提取細(xì)胞蛋白,使用BCA測(cè)定其蛋白濃度,然后用10%和8%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后在5%脫脂牛奶中封閉2 h,然后與p-NF-κB抗體(1 ∶1 000)、NF-κB抗體(1：1 000)、IL-1β抗體(1 ∶1 000)、IL-6抗體(1 ∶1 000)、TNF-α抗體(1 ∶1 000)在4 ℃條件下孵育過夜,次日,用PBS洗滌3次后與辣根過氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG(H+L)孵育2 h,最后利用特超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯影觀察,并利用Image Lab軟件進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 瓜蔞薤白半夏湯活性化合物通過TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索到瓜蔞薤白半夏湯的化合物共293個(gè),在OB≥30%和DL≥0.18的條件下篩選得到可用于分析的化合物30個(gè),其中,瓜蔞、薤白、半夏分別有10、11和10個(gè)化合物分子,薤白和半夏有1個(gè)共同化合物分子(Tab 1)。

Tab 1 Active ingredients of Gualou Xiebai Banxia decoction

2.2 瓜蔞薤白半夏湯和動(dòng)脈粥樣硬化共同靶點(diǎn)將上述獲得的瓜蔞薤白半夏湯的30個(gè)活性成分進(jìn)行反向?qū)ふ业玫?36個(gè)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn),在GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫中檢索動(dòng)脈粥樣硬化靶點(diǎn),其中在GeneCards數(shù)據(jù)庫中得到780個(gè)靶點(diǎn),OMIM數(shù)據(jù)庫中得到200個(gè)靶點(diǎn),TTD數(shù)據(jù)庫中得到34個(gè)靶點(diǎn),去重后得到803個(gè)靶點(diǎn)。將兩者的靶點(diǎn)制作成Venn圖后發(fā)現(xiàn)其共同靶點(diǎn)為78個(gè),即瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化有78個(gè)潛在靶點(diǎn)(Fig 1)。

Fig 1 Venn diagram of common targets of Gualou Xiebai

2.3 中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖將瓜蔞薤白半夏湯和對(duì)應(yīng)的30個(gè)活性化合物分子、78個(gè)交集靶點(diǎn)以及動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件中進(jìn)行可視化分析(Fig 2)。由Fig 2可見,中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖中共有112個(gè)節(jié)點(diǎn)(1種疾病、3味中藥、30個(gè)化合物活性分子、78個(gè)潛在靶點(diǎn))。此外,瓜蔞薤白半夏湯的活性成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn),1個(gè)靶點(diǎn)也對(duì)應(yīng)多個(gè)活性化合物分子,其中槲皮素(MOL000098,Quercetin)、豆甾醇(MOL000449,Stigmasterol)、β-谷甾醇(MOL000358,Beta-sitosterol)、卡文定堿(MOL002670,Cavidine)、黃芩素(MOL002714,Baicalein)分別對(duì)應(yīng)52、16、15、14、12個(gè)活性靶點(diǎn),而靶點(diǎn)PTGS2、PRKACA、ADRB2、PGR、SCN5A分別對(duì)應(yīng)19、11、10、9、7個(gè)化合物分子。

Fig 2 Network diagram of TCM-compound-target-disease

2.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)將瓜蔞薤白半夏湯和動(dòng)脈粥樣硬化共同靶點(diǎn)制作為蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(protein protein interaction,PPI)(Fig 3),發(fā)現(xiàn)IL-6、MAPK3、TP53、TNF、VEGFA、MAPK1的Degree值均在45以上(Degree：IL-6=52、MAPK3=51、TP53=48、TNF-α=47、VEGFA=46、MAPK1=46),且顯著高于其他靶點(diǎn),以上靶點(diǎn)與炎癥通路、細(xì)胞凋亡和增殖等有密切關(guān)系。

Fig 3 Diagram of protein interaction network

2.5 GO富集分析為進(jìn)一步探究瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用機(jī)制,將上述得到的共同靶點(diǎn)在DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO分析,結(jié)果共得到GO分析條目417條(P<0.05),其中229條生物過程(BP)條目、49條細(xì)胞組成(CC)條目、69條分子功能條目,分別占比54.92%、11.75%、16.55%,各類占比前10的條目如Fig 4所示,BP條目涉及到的有positive regulation of cell proliferation、oxidation-reduction process、apoptotic process等過程。這提示瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)主要與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、氧化和蛋白結(jié)合等有關(guān)。

Fig 4 Results of gene function GO enrichment analysis

KEGG通路富集分析得到14條相關(guān)信號(hào)通路,例如PI3K-Akt、MAPK、TNF等,并涉及IL-6、TNF等炎癥因子以及MAPK3、MAPK1等絲裂原活化蛋白激酶,這表明瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化可能與抗炎、細(xì)胞凋亡等機(jī)制有密切關(guān)系(Fig 5)。

Fig 5 Results of gene KEGG pathway enrichment analysis

2.6 β-谷甾醇對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC細(xì)胞凋亡的影響由中藥-化合物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 2)及Tab 1可知,槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、卡文定堿、黃芩素這幾種化合物是瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的主要的潛在活性分子。而上述物質(zhì)中,槲皮素和黃芩素治療動(dòng)脈粥樣硬化已有相關(guān)報(bào)道,豆甾醇、β-谷甾醇、卡文定堿未檢索到調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的報(bào)道,但有他們?cè)谡{(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、炎癥等基礎(chǔ)病理方面的相關(guān)報(bào)道。因此,我們初步選擇β-谷甾醇為研究對(duì)象來驗(yàn)證我們網(wǎng)絡(luò)藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性。Ox-LDL造模濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 6A所示,由Fig 6A可見,HAEC細(xì)胞活力在40～100 mg·L-1濃度梯度的Ox-LDL的作用下呈顯著下降趨勢(shì),其中,在Ox-LDL濃度為40 mg·L-1時(shí),細(xì)胞活力較control組明顯(P<0.05)降低,且大約為control組細(xì)胞活力的50%。因此,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇濃度為60 mg·L-1的Ox-LDL進(jìn)行細(xì)胞造模。對(duì)β-谷甾醇的毒性研究發(fā)現(xiàn),其濃度在0.25,0.5,1,2及4 mg·L-1時(shí),HAEC細(xì)胞的活力無顯著變化(Fig 6B)。β-谷甾醇的細(xì)胞保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如Fig 6C所示,與control組相比,模型組HAEC細(xì)胞活力明顯(P<0.01)下降,但濃度為1,2,4 mg·L-1的β-谷甾醇可以明顯(P<0.05,0.01,0.01)提高HAEC細(xì)胞的活力。利用JC-1熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況時(shí)發(fā)現(xiàn),與control組細(xì)胞相比,模型組細(xì)胞的紅色熒光較強(qiáng),綠色熒光較弱,而β-谷甾醇可以逆轉(zhuǎn)模型組細(xì)胞的上述趨勢(shì)(Fig 6D)。提示β-谷甾醇可阻止Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Fig 6 Effect of β-sitosterol on ox-LDL induced apoptosis of

2.7 β-谷甾醇對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC細(xì)胞損傷的抗炎作用從蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 3)可知,瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)主要涉及IL-6、TNF-α等炎癥因子,因此對(duì)Ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC細(xì)胞損傷的炎癥因子進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(Fig 7),與control組相比,模型組細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯增高(P<0.01)；與模型組相比,β-谷甾醇組細(xì)胞中的IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低(P<0.05,0.01),這說明β-谷甾醇可對(duì)抗Ox-LDL誘導(dǎo)的HAEC細(xì)胞損傷而發(fā)揮抗炎作用。

Fig 7 Anti-inflammatory effect of β-sitosterol on

2.8 β-谷甾醇對(duì)炎癥因子及其相關(guān)通路的影響對(duì)瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)其主要涉及炎癥通路(Fig 5)。因此利用Western blot法對(duì)相關(guān)通路蛋白進(jìn)行探測(cè)。結(jié)果顯示(Fig 8),與control組細(xì)胞相比,模型組細(xì)胞的p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平明顯增加(P<0.01),但在β-谷甾醇的作用后,HAEC細(xì)胞中p-NF-κB/NF-κB、IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)量明顯降低(P<0.05,0.01),這提示瓜蔞薤白湯可通過作用于炎癥通路治療動(dòng)脈粥樣硬化。

Fig 8 Effects of β -sitosterol on inflammatory factors and NF-κB signaling n=4)

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化在中醫(yī)雖無此名,但根據(jù)其臨床表現(xiàn),醫(yī)家將其歸于“胸痹、中風(fēng)”等范疇[12]。對(duì)于動(dòng)脈粥樣硬化的病機(jī)各路醫(yī)家眾說紛紜,有學(xué)者認(rèn)為毒邪可致臟腑功能紊亂,津液代謝失常,最終形成痰瘀痹阻血脈的病理狀態(tài),從而形成動(dòng)脈粥樣硬化。因此祛瘀化痰、清熱解毒為治療動(dòng)脈粥樣硬化的治則之一。瓜蔞薤白半夏湯最早記載于《金匱要略》,是由蔞實(shí)、薤白和半夏三味中藥組成,方中,瓜蔞清熱滌痰、薤白行氣導(dǎo)滯、半夏燥濕化痰,三藥合用行通陽散結(jié)、清熱祛痰之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究亦表明,瓜蔞薤白半夏湯可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制氧化應(yīng)激、減輕炎癥反應(yīng)等有效延緩動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展[6]。中藥成分復(fù)雜、作用靶點(diǎn)多,其治療疾病的確切機(jī)制不容易闡明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)整合了生物學(xué)、藥理學(xué)、計(jì)算生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的知識(shí),可從整體角度探討藥物與疾病的相關(guān)性,符合中醫(yī)學(xué)整體觀與辨證原則,有助于闡明中藥發(fā)揮藥效作用的機(jī)制。

從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度研究瓜蔞薤白半夏湯主要關(guān)注的疾病是冠心病[7,9]、慢性阻塞性肺病[10],以及未經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證的瓜蔞薤白半夏湯臨床治療器官定位和藥效成分預(yù)測(cè)[11]等研究。本研究試圖從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度探究瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在作用機(jī)制。

本研究顯示,瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化有30個(gè)活性化合物分子以及78個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。張雯等[11]基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析了瓜蔞薤白半夏湯的藥效成分并得到了鄰苯二甲酸、甲基丁香酚等潛在化合物。本研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇作為半夏和薤白共有的活性化合物分子,可能是治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在有效物質(zhì),其具有抗氧化、降脂、抗炎等藥理作用。大量研究表明,攝入富含β-谷甾醇的食物可降低低密度脂蛋白在血液中的濃度[13]。氧化型低密度脂蛋白是引起動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素之一,可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,繼而導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生、炎癥細(xì)胞浸潤、脂質(zhì)沉積和斑塊破裂。因此抑制Ox-LDL誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是治療動(dòng)脈粥樣硬化的重要手段。本研究中采用Ox-LDL誘導(dǎo)HAEC細(xì)胞損傷,發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可明顯降低Ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。初步證明了β-谷甾醇是瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的藥效分子。

動(dòng)脈粥樣硬化與LDL等脂蛋白在動(dòng)脈內(nèi)膜沉積,形成局部炎癥,炎癥招募單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞,巨噬細(xì)胞在攝取LDL后死亡、破裂有密切關(guān)系。本研究的蛋白網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示,IL-6、TNF-α是瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn)。IL-6是巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞在炎癥早期產(chǎn)生的促炎因子,已有研究[14]顯示,抑制IL-6信號(hào)傳導(dǎo)可降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。TNF-α的特異性單克隆抗體和抑制劑也可抑制動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn),β-谷甾醇可明顯降低Ox-LDL誘導(dǎo)的IL-6及TNF水平升高。此外,研究發(fā)現(xiàn)[16],IL-1β在動(dòng)脈粥樣硬化病變中的表達(dá)也明顯增高,被認(rèn)為是臨床治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶點(diǎn),本研究證實(shí)了這一點(diǎn),且β-谷甾醇也可明顯降低Ox-LDL誘導(dǎo)的升高的IL-1β水平。以上表明,瓜蔞薤白半夏湯可通過減輕炎癥導(dǎo)致的細(xì)胞損傷發(fā)揮治療動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

通過GO和KEGG分析證實(shí),瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化是通過多途徑、多方式介導(dǎo)。金宏飛等[7]利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討瓜蔞薤白半夏湯治療冠心病的作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn),其機(jī)制主要與血小板活化通路、FoxO信號(hào)通路相關(guān)。NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)上述炎癥因子的重要途徑,在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制,炎癥和細(xì)胞死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Hajra等[17]研究發(fā)現(xiàn),低密度脂蛋白受體(LDLR)-/-小鼠在長期喂食高脂飼料后,內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB活性顯著增加,這導(dǎo)致了其動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生幾率增加。韋磊等[18]也證實(shí),在高脂喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠后,NF-κB磷酸化水平增加。本研究也發(fā)現(xiàn),Ox-LDL可顯著升高p-NF-κB在HAEC細(xì)胞中的表達(dá)量,但β-谷甾醇可以明顯降低其活化水平。這進(jìn)一步說明瓜蔞薤白半夏湯可通過抗炎作用治療動(dòng)脈粥樣硬化,其分子機(jī)制可能與調(diào)控NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述,瓜蔞薤白半夏湯可通過多靶點(diǎn)、多途徑治療動(dòng)脈粥樣硬化。本研究結(jié)果初步顯示,β-谷甾醇是瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的活性藥效分子,其分子機(jī)制與調(diào)節(jié)抗炎、細(xì)胞凋亡信號(hào)通路有關(guān)。后續(xù)研究將進(jìn)一步篩選其他潛在化合物以探究瓜蔞薤白半夏湯治療動(dòng)脈粥樣硬化的其他可能機(jī)制。