葛根素對棕櫚酸誘導(dǎo)胰島MIN6細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

陳 銘，莫廣艷，葉 溪，徐小惠，高雨桐，張曉琳，吳婭妮，韋秀莎，黃仁彬，梁 韜

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，3.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，4.廣西醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，5.廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生健康委員會口腔感染性疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530021)

隨著人類生活水平的不斷提高，2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)已經(jīng)成為嚴(yán)重影響人類健康生活質(zhì)量的公共衛(wèi)生問題，而且T2DM的發(fā)病呈現(xiàn)逐年年輕化[1]。T2DM是一種病因復(fù)雜的慢性全身性疾病，以胰島素抵抗、血液中葡萄糖水平升高和胰島β細(xì)胞功能障礙為主要特征[2]。其中，肥胖是導(dǎo)致T2DM的主要影響因素之一，高水平的游離脂肪酸對胰島β細(xì)胞可產(chǎn)生明顯毒性作用，并可誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生胰島素抵抗。研究表明，長期暴露于高濃度的游離脂肪酸則可導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能受損，胰島素分泌絕對或相對不足，從而引發(fā)糖尿病[3-4]。因此，探討抑制游離脂肪酸誘導(dǎo)的胰島功能損傷和胰島β細(xì)胞凋亡的策略，對T2DM的防治具有非常重要的意義。

葛根素(puerarin，PR)是從豆科植物野葛PuerarinLobata(Wild) Ohwi根部中提取的異黃酮類生物活性成分。在我國已被廣泛應(yīng)用于T2DM、糖尿病腎病、糖尿病心肌病等糖尿病并發(fā)癥的治療[5]。前期研究發(fā)現(xiàn)，葛根素可明顯改善鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病小鼠糖尿病前期狀態(tài)，改善胰腺超微組織損傷[6]。但目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)明確葛根素對胰島細(xì)胞的體外保護(hù)作用機(jī)制，因此，本研究將采用體外培養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞株(MIN6細(xì)胞)，觀察葛根素對棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞損傷和凋亡的影響，并從NF-κB信號通路及凋亡相關(guān)因子的角度探究其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞MIN6細(xì)胞株購于武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號：CL-0674 。

1.2 藥品與試劑葛根素注射液(山東方明藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，批號：H20033292)、棕櫚酸鈉(鯤創(chuàng)科技股份有限公司，批號：KCSJ002)、胎牛血清(Gemini公司，批號：A58G00J)、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Giboco公司，批號：8119267)、0.25%含EDTA胰酶(北京索萊寶公司，批號：20201217)、青霉素/鏈霉素(北京索萊寶公司，批號：20201101)、β-巰基乙醇(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號：WH01112009XP)、LDH試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20200613)、MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20200411)、GSH試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號：20200510)、GAPDH多克隆抗體(中國Proteintech公司，批號：10494-1-AP)、NF-κB抗體(美國Cell Signaling Technology公司，批號：CN89330)、p-NF-κB抗體(美國Cell Signaling Technology 公司，批號：16)、Bax抗體(中國Proteintech公司，批號：50599-2-lg)、Bcl-2抗體(中國Proteintech公司，批號：26593-1-AP)、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體(Invitrogen中國公司，批號：VC303853)

1.3 主要儀器二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma公司，型號：31111)、超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備總廠，型號：1450型)、小型高速冷凍離心機(jī)(德國ThermoIEC公司，型號：Micro CL17R)、熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯株式會，型號：奧林巴斯CKX-41)、連續(xù)光譜掃描式酶標(biāo)儀(香港分子儀器公司，型號：SpectraMaxPlus384)、垂直電泳儀(美國Bio-Rad中國有限公司)、雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國Li-COR OdysseClx公司)。

1.4 MIN6細(xì)胞的培養(yǎng)將MIN6細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中(含1%青霉素-鏈霉素、50 μmol·L-1β-巰基乙醇)，置于含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，待細(xì)胞生長至接近融合時，用0.25%胰酶消化、傳代培養(yǎng)，繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 MTT法檢測MIN6細(xì)胞的存活率將MIN6細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，計數(shù)，以5×103/孔的密度接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為正常組( Normal control )，模型組(Model control )，葛根素高、中、低劑量組(PR 5、2.5、1.25 mg·L-1)，分別加入相應(yīng)濃度的含藥培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基預(yù)處理2 h后，除正常組外，其余各組加入120 μmol·L-1的棕櫚酸，共同培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL MTT試劑和90 μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后，酶標(biāo)儀490 nm處檢測各孔吸光度值(A值)，計算細(xì)胞存活率。

1.6 細(xì)胞LDH、MDA和GSH的測定細(xì)胞分組及藥物處理見“1.5”項(xiàng)，各組細(xì)胞處理結(jié)束后，收集細(xì)胞上培養(yǎng)清液，根據(jù)LDH含量檢測試劑盒說明書，檢測并計算細(xì)胞上清中LDH含量。采用超聲破碎法破碎細(xì)胞，細(xì)胞破碎完畢后離心取上清，根據(jù)MDA含量檢測試劑盒和GSH檢測試劑盒說明書進(jìn)行檢測和計算。

1.7 細(xì)胞AOEB染色及形態(tài)觀察將對數(shù)生長期的細(xì)胞按每孔5×104/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞分組及藥物處理見“1.5”項(xiàng)，各組給藥處理結(jié)束后，棄除完全培養(yǎng)基或含藥培養(yǎng)基，用PBS輕柔清洗1遍細(xì)胞，每孔再加入500 μL的PBS，然后將配置好的AOEB工作液(將AO和EB兩種溶液按照1 ∶1混合配置)，5 μL/孔加入各組細(xì)胞中，室溫避光染色5 min，染色結(jié)束后，棄去熒光染液，用PBS清洗1遍細(xì)胞，采用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞凋亡情況并拍照記錄。

1.8 Western blot法檢測各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白表達(dá)情況細(xì)胞分組及藥物處理見“1.5”項(xiàng)，各組細(xì)胞處理結(jié)束后，用PBS沖洗1～2次，各組加入含PMSF的RIPA裂解液裂解細(xì)胞，12 000g離心15 min，取上清即為各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液，根據(jù)目的蛋白分子量的大小采用不同濃度的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜，TBST溶液洗膜3次后，4 ℃冰箱孵育按1 ∶500或1 ∶1 000稀釋的一抗過夜，TBST重新洗膜3次，每次5 min室溫?fù)u床孵育加HRP標(biāo)記的山羊兔二抗0.5～1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，雙色紅外熒光成像系統(tǒng)曝光掃膜，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白校正，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用ImageJ分析軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 葛根素對MIN6細(xì)胞存活率的影響120 μmol·L-1棕櫚酸孵育MIN6細(xì)胞24 h后可以誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞損傷(P<0.01)；與模型組相比，不同濃度葛根素預(yù)處理2 h后，120 μmol·L-1棕櫚酸共同孵育24 h可減輕棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(P<0.01或P<0.05)。提示葛根素可有效改善棕櫚酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(Tab 1)。

Tab 1 Effects of PR on viability of palmitic

2.2 各組細(xì)胞上清液LDH含量的比較結(jié)果顯示，模型組LDH釋放量，MDA含量明顯增加，GSH活性明顯下降(P<0.01或P<0.05)，說明此時棕櫚酸對MIN6細(xì)胞造成了損傷。當(dāng)加入不同濃度葛根素預(yù)處理2 h后,120 μmol·L-1棕櫚酸共同孵育24 h時，隨著葛根素濃度的增加，MIN6細(xì)胞中LDH釋放量呈現(xiàn)明顯(P<0.01或P<0.05)劑量依賴性下降趨勢，葛根素高、中劑量組MDA含量明顯降低，GSH活性明顯增加(P<0.01或P<0.05)。結(jié)果表明，葛根素能夠減輕棕櫚酸造成的細(xì)胞損傷(Tab 2)。

Tab 2 Effects of PR on level of LDH，MDA and GSH in palmitic acid-induced MIN6 cells

2.3 細(xì)胞AOEB染色及形態(tài)觀察如Fig 1所示，正常組細(xì)胞生長良好，貼壁情況良好，呈現(xiàn)亮綠色熒光，模型組細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，發(fā)出橘紅色熒光，對于葛根素給藥組，高劑量組的呈現(xiàn)黃綠色熒光，中劑量開始出現(xiàn)早期凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)橘黃色熒光，低劑量組壞死細(xì)胞最多，呈現(xiàn)橘紅色熒光。結(jié)果提示，葛根素可以改善棕櫚酸引起的MIN6細(xì)胞凋亡。

Fig 1 Effects of PR on apoptosis of palmitic acid-induced MIN6 cells (200×)A: Normal control; B: Model group; C: PR 5 mg ·L-1; D: PR 2.5 mg·L-1；E: PR 1.25 mg·L-1

2.4 葛根素對MIN6細(xì)胞Bcl-2、Bax、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響各組細(xì)胞中目的蛋白表達(dá)結(jié)果如Fig 2所示。與正常組相比，模型組中NF-κB p-p65、Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，葛根素高、中劑量組NF-κB p-p65、Bax蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.01或0.05)。提示葛根素能減少炎癥因子NF-κB p-p65蛋白和促凋亡因子Bax蛋白的表達(dá)，同時促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2蛋白的表達(dá)。

Fig 2 Effects of PR on Bax，Bcl-2，p65 and p-p65 expression of palmitic acid-induced MIN6 cells

3 討論

T2DM的發(fā)病因素眾多，近年來，脂毒性在T2DM的發(fā)生發(fā)展中的作用受到廣泛關(guān)注。研究表明，長期暴露于高水平的游離FFA中，一方面會減少葡萄糖刺激的胰島素分泌，引起胰島素抵抗;另一方面可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生凋亡，激活炎癥因子，導(dǎo)致胰島細(xì)胞損傷[7-8]。因此，抑制脂毒性誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞損傷有望成為治療T2DM的有效途徑之一。本研究采用棕櫚酸作為造模刺激物，從細(xì)胞水平來探討葛根素對脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MTT法、LDH、MDA和GSH試劑盒均提示葛根素具有改善棕櫚酸引起的MIN6細(xì)胞損傷的作用，AOEB熒光染色法結(jié)果提示葛根素具有抑制MIN6細(xì)胞凋亡的作用。

NF-κB是重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一，在細(xì)胞炎癥、損傷中具有重要的調(diào)節(jié)作用[9]。當(dāng)刺激因素激活后，NF-κB核轉(zhuǎn)移過程增強(qiáng)，其與相應(yīng)的靶基因結(jié)合，參與調(diào)控一系列炎癥因子等促炎基因的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞功能受損甚至凋亡的發(fā)生。大量研究顯示[10-12]，NF-κB信號通路的激活與糖尿病發(fā)生的胰島β細(xì)胞凋亡及損傷密切相關(guān)，抑制NF-κB信號通路的活化可以有效保護(hù)胰島β細(xì)胞。Western blot結(jié)果表明，與正常組相比，模型組NF-κB p-p65表達(dá)明顯上調(diào)，說明造模成功。與模型組相比，葛根素高劑量組NF-κB p-p65表達(dá)明顯下調(diào)，提示葛根素有較好的抑制NF-κB通路活性，改善MIN6細(xì)胞損傷的作用。

β細(xì)胞凋亡在T2DM的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要的作用，T2DM患者的胰島β細(xì)胞數(shù)量明顯減少[13-14]。Bcl-2家族的凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax是調(diào)控胰島β細(xì)胞凋亡的重要因子。其中，Bcl-2是抑制細(xì)胞凋亡的基因蛋白，為線粒體膜的整合蛋白，可通過線粒體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑抵抗細(xì)胞凋亡；Bax是促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因蛋白，當(dāng)接收到凋亡信號刺激被激活后，分子構(gòu)象發(fā)生改變，形成Bax/Bax二聚體，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15-16]。Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組Bax表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，說明造模成功。與模型組相比，葛根素高、中劑量組Bax表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)，提示葛根素有明顯的抑制棕櫚酸引起的MIN6細(xì)胞凋亡的作用。

綜上所述，葛根素可改善棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島MIN6細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而抑制凋亡和炎癥反應(yīng)而改善胰島細(xì)胞的功能。因此，葛根素對胰島MIN6細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)及抑制NF-κB信號通路有關(guān)。