NBED對鈾的促排效果及HK-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用

周文華，高 潔，尹晶晶，黃立群，李曙芳，李建國

(1. 山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619；2. 中國輻射防護(hù)研究院，藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點實驗室，中核放射毒理與放射性藥物臨床前評價重點實驗室，山西 太原 030000)

近年來隨著核技術(shù)的廣泛應(yīng)用，核安全問題受到廣泛關(guān)注。環(huán)境中的鈾主要通過吸入、傷口等途徑隨血液進(jìn)入全身循環(huán)并造成一定的毒性[1]。流行病學(xué)和實驗室研究發(fā)現(xiàn)，鈾毒性主要體現(xiàn)在腎臟(36.22%)、骨骼(19.48%)、肝臟(17.58%)、生殖系統(tǒng)(13.90%)、肺(7.24%)、神經(jīng)系統(tǒng)(5.58%)[2]。腎臟中的鈾主要沉積在腎近端小管S3段[3]，胞吞進(jìn)入細(xì)胞與磷酸根離子結(jié)合形成磷酸鈾酰針形結(jié)晶，沉淀在細(xì)胞質(zhì)中破壞細(xì)胞，造成近端腎小管損傷或壞死[4-5]。而使用促排劑形成穩(wěn)定可排泄的絡(luò)合物是治療鈾內(nèi)污染的唯一實用方法。

放射性核素促排劑研究至今，F(xiàn)DA僅批準(zhǔn)Ca/Na-DTPA、普魯士藍(lán)、碘化鉀3種藥物可以治療放射性核素中毒，其余尚在結(jié)構(gòu)優(yōu)化、藥效確證和臨床前研究階段。而目前臨床治療鈾內(nèi)污染的對策為靜脈注射1.4%碳酸氫鈉直至尿液pH達(dá)到8.0～9.05，并持續(xù)3 d，但低劑量效果并不明顯，臨床用量過多極易造成體內(nèi)酸堿不平衡和電解質(zhì)紊亂[6]。中國輻射防護(hù)研究院設(shè)計合成的鄰苯二酚類促排劑(FZ-82-4)對钚、銅、鉛等具有較好的促排效果[7]。近年來，本研究所為提高藥物穩(wěn)定性、改善水溶性自主設(shè)計合成了N1，N2-雙(2，3-二羥基-4，6-二磺酸芐基)亞乙基二胺鈉鹽(N1,N2-bis (2,3-dihydroxy-4,6-disulfonic acid benzyl) ethylenediamine sodium salt , NBED)(FZ-82-4鈉鹽)。本研究將從動物、細(xì)胞水平研究NBED對鈾的促排效果，采用鈾誘導(dǎo)的人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)損傷模型，研究NBED對HK-2急性鈾損傷的保護(hù)作用，并與目前臨床使用的廣譜核素促排劑DTPA-CaNa3進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 SPF級ICR ♂小鼠48只，體質(zhì)量(18～22)g(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，質(zhì)量合格證號：110011200110859381，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。實驗單位為中國輻射防護(hù)研究院藥物安全評價中心SPF級動物房。

1.1.2細(xì)胞 人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)，購自BNCC細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素溶液的DMEM/F12的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合至80%～90%時，胰酶消化傳代并進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.1.3試劑 NBED由本所合成，相對分子量為712.52。該化合物為黃色粉末，相對純度大于95%[7]。促排靈注射液(DTPA-CaNa3，批號：20190605)購自軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所；醋酸鈾酰[C4H6O6U(H2O)2，批號：U3873101B]購自上海吉至生化科技有限公司；胎牛血清(批號：2138109RP)、DMEM/F12培養(yǎng)基(批號：8121244)購自美國Gibco公司；細(xì)胞增殖毒性檢測(CCK-8)試劑盒(批號：BJ05203090)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(批號：BA01283496)、細(xì)胞周期檢測試劑盒(批號：BA04278147)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：20201226)、還原型谷胱甘肽(GSH，批號：20210126)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(批號：20201124)購自南京建成生物工程研究所；活性氧檢測試劑盒(批號：20201212)購自北京索萊寶科技有限公司；硝酸(優(yōu)級純，批號：20200911)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；H2O2(分析純，批號：20200531)購自天津歐博凱化工有限公司；超純水(Milli-Q超純水處理系統(tǒng))。

1.1.4儀器 LY26-1FD型超凈工作臺(上海龍躍儀器設(shè)備有限公司)，F(xiàn)orma 3111型直熱式CO2培養(yǎng)箱、Countess Ⅱ型全自動細(xì)胞計數(shù)儀、Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀、5424R高速冷凍離心機(Thermo Fisher)；Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國Millipore)；FC500型流式細(xì)胞分析儀(Beckman coulter)。NexION-5000電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(PerkinElmer)。ICP-MS測定主要條件：射頻入射功率：1 600 W，霧化氣流速：1.03 L·min-1，輔助氣流速：1.3 L·min-1，等離子氣流速：16.25 L·min-1，重復(fù)采集3次，溶液穩(wěn)定時間50 s。

1.2 方法

1.2.1動物分組及給藥 實驗動物分為6組：空白對照組、鈾染毒組[U(VI)](0.03mg)[8]、鈾染毒+DTPA-CaNa3組(300 mg·kg-1)、鈾染毒+NBED組(300、150、75 mg·kg-1)。

給藥，實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，d 8開始給藥，小鼠尾靜脈注射醋酸鈾酰后立即灌胃不同劑量NBED，DTPA-CaNa3作為陽性對照；鈾染毒組于染鈾后灌胃等體積生理鹽水；空白對照組小鼠尾靜脈注射生理鹽水后立即灌胃生理鹽水。給藥前禁食過夜，給藥2 h后給食與飲水。注射螯合劑后24 h脫臼處死小鼠，取兩側(cè)腎臟、股骨、脾臟、肝臟和肌肉。80 ℃烘至恒重，研磨均勻后，分別取0.02 g于燒杯中(因肝、脾、肌肉中鈾蓄積量較少，所以肝、脾、肌肉作為一組樣本處理)，加入5 mL硝酸、150 ℃消解澄清后，加入1 mL H2O2繼續(xù)消解至無色透明，約剩0.5～1.0 mL左右，經(jīng)稀硝酸稀釋后，采用ICP-MS測定各個樣本中的鈾含量，并轉(zhuǎn)化為μg·g-1干組織。

1.2.2醋酸鈾酰誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型 取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(融合至50%～60%)，去掉培養(yǎng)基。分別加入20、40、80、160、320、640 μmol·L-1的醋酸鈾酰作用48 h，以及80 μmol·L-1的醋酸鈾酰作用24、48、72 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入含10%的CCK-8培養(yǎng)基100 μL，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，酶標(biāo)儀450 nm測每孔的吸光度A并計算存活率。細(xì)胞存活率/%=(OD測定孔-OD空白孔)/(OD對照孔-OD空白孔)×100%。

1.2.3NBED對鈾損傷的HK-2細(xì)胞活性影響 取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，以5×103/孔接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(融合至50%～60%)，去掉培養(yǎng)基。實驗分為空白對照組、鈾(80 μmol·L-1)模型組、80 μmol·L-1鈾分別與不同濃度NBED(10、20、40、80、160、320 μmol·L-1)組，各組處理細(xì)胞48 h后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活性。

1.2.4NBED對鈾損傷的HK-2細(xì)胞形態(tài)變化的影響 取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。根據(jù)“1.2.2”、“1.2.3”結(jié)果選用醋酸鈾酰、NBED最適宜濃度，后續(xù)實驗分為空白對照組、鈾模型組(80 μmol·L-1)、陽性對照組(80 μmol·L-1U+80 μmol·L-1DTPA-CaNa3)、80 μmol·L-1鈾分別與不同濃度NBED(80、40、20 μmol·L-1)組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照。

1.2.5NBED對HK-2細(xì)胞內(nèi)吞和外排鈾的影響 取對數(shù)生長期的HK-2細(xì)胞，以5×105/孔接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實驗分組同“1.2.4”。內(nèi)吞實驗：細(xì)胞染鈾后立即給藥后作用48 h；外排實驗：除對照組外各組別用80 μmol·L-1鈾作用24 h后，棄去培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，對照組和鈾模型組，加無血清培養(yǎng)基，其余各組加不同濃度含藥培養(yǎng)基作用細(xì)胞24 h。藥物作用結(jié)束后，分別收集各組培養(yǎng)上清和細(xì)胞，置燒杯中，加入5 mL硝酸、150 ℃消解澄清后，加入1 mL H2O2繼續(xù)消解至無色透明，約剩0.5～1.0 mL左右，經(jīng)稀硝酸稀釋后，用ICP-MS測樣本中鈾含量，將測得的各處理組的數(shù)值減去空白對照組的本底值，乘以稀釋倍數(shù)得各樣本鈾含量。內(nèi)吞率/%=細(xì)胞鈾含量/(細(xì)胞+培基鈾總量)，外排率/%=培基鈾含量/(細(xì)胞+培基鈾總量)。

1.2.6檢測細(xì)胞SOD、GSH、ROS水平和上清LDH活力 收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞,根據(jù)LDH活性測定試劑盒說明書在450 nm處檢測LDH活性。細(xì)胞冰水浴中制備勻漿，按照SOD和GSH說明書檢測SOD活力和GSH水平。流式法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS，棄去細(xì)胞上清液。收集細(xì)胞加入DCFH-DA使其終濃度為10 μmol·L-1，置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)20 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次后，采用流式細(xì)胞儀在488 nm、525 nm處檢測熒光強度即反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)ROS含量。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 各組別藥物作用結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶消化收集5×105個細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，重懸于100 μL binding buffer中，每組分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI，37 ℃避光反應(yīng)15 min后，冰上加400 μL binding buffer，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.8流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 各組別藥物作用結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，重懸于70%乙醇中，-20 ℃固定過夜，檢測前離心，棄乙醇，PBS洗滌后加入PI，37 ℃避光反應(yīng)30 min后，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 NBED對鈾中毒小鼠的促排效果與鈾染毒組相比，300、150 mg·kg-1NBED和300 mg·kg-1DTPA-CaNa3可明顯降低腎內(nèi)鈾含量，300 mg·kg-1NBED和DTPA-CaNa3可明顯降低骨內(nèi)鈾含量(P<0.05)。300 mg·kg-1NBED分別減少腎、骨內(nèi)44.3%、18.8%的鈾含量，而同濃度DTPA-CaNa3則減少16.6%和13.9%的腎、骨內(nèi)鈾含量，見Fig 1。

Fig 1 Efficacy of uranium removal from mice by

2.2 醋酸鈾酰對HK-2細(xì)胞生長的影響與對照組相比，20、40、80、160、320、640 μmol·L-1的醋酸鈾酰作用HK-2細(xì)胞48 h，以及80 μmol·L-1的醋酸鈾酰作用HK-2細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞活性明顯下降(P<0.01)，且呈濃度和時間依賴性(Fig 2)。當(dāng)醋酸鈾酰濃度為80 μmol·L-1，作用時間為48 h時，細(xì)胞存活率為60.51%左右，本實驗選用80 μmol·L-1、48 h作為后續(xù)誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷模型的濃度。

Fig 2 Effect of C4H6O6(H2O)2 on growth of HK-2

2.3 NBED對鈾損傷的HK-2細(xì)胞活性影響以及形態(tài)的變化與鈾模型組相比，NBED(40、80 μmol·L-1)處理組提高了細(xì)胞存活率(P<0.01)，見Fig 3A。因此，選擇20、40、80 μmol·L-1作為NBED給藥濃度，80 μmol·L-1作為DTPA-CaNa3給藥濃度。如Fig 3B所示，與空白對照組比較，鈾模型組細(xì)胞數(shù)目減少、部分細(xì)胞碎片以及損傷細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中，部分細(xì)胞變成不規(guī)則長條形。與鈾模型組相比，陽性對照組和40、20 μmol·L-1NBED處理組，細(xì)胞損傷在鏡下未見明顯改善。80 μmol·L-1NBED組細(xì)胞數(shù)量明顯比鈾模型組和陽性對照組多，且大部分細(xì)胞形態(tài)正常，培養(yǎng)基中漂浮的損傷細(xì)胞或碎片均減少。

Fig 3 Effect of NBED on activity and morphology of HK-2 cells

2.4 NBED對HK-2細(xì)胞內(nèi)吞和外排鈾的影響醋酸鈾酰和不同濃度藥物作用細(xì)胞48 h，由Fig 4A可知，陽性藥組和NBED組明顯抑制鈾內(nèi)吞(P<0.05)。與鈾模型組69%的內(nèi)吞率相比，陽性藥組和80、40、20 μmol·L-1NBED組鈾內(nèi)吞率分別為56%、27%、49%、58%。醋酸鈾酰作用細(xì)胞24 h后，不同濃度藥物作用細(xì)胞24 h，由Fig 4B可知，NBED組顯著促進(jìn)鈾外排(P<0.01)，而陽性藥組沒有促排效果。與鈾模型組12%的外排率相比，80、40、20 μmol·L-1NBED組鈾外排率分別為60%、44%、30%。以上結(jié)果表明，NBED可以抑制細(xì)胞對鈾的攝取，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈾的釋放。

Fig 4 Effect of NBED on endocytosis and exocytosis of

2.5 NBED對細(xì)胞SOD、GSH、ROS水平和上清LDH活力的影響由Fig 5可知，與鈾模型組相比，80 μmol·L-1NBED組的SOD、GSH釋放量明顯升高(P<0.01)，ROS的表達(dá)水平和LDH活力明顯下降(P<0.01)；陽性對照組的SOD、GSH釋放量無明顯差異，ROS的表達(dá)水平升高(P<0.05)，LDH活力明顯升高(P<0.01)。與陽性對照組相比，80 μmol·L-1NBED組的SOD、GSH釋放量明顯升高(P<0.01)，ROS的表達(dá)水平、LDH活力明顯下降(P<0.01)；40、20 μmol·L-1NBED組的SOD、GSH釋放量升高(P<0.05)，ROS的表達(dá)水平和LDH活力明顯下降(P<0.01)。由此可見，80 μmol·L-1的NBED對鈾誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，而同濃度陽性藥DTPA-CaNa3并沒有發(fā)揮保護(hù)作用，反而加劇了細(xì)胞的損傷。

2.6 NBED對鈾誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響與對照組相比，80 μmol·L-1的鈾作用HK-2細(xì)胞48 h后，有(15.80±0.51)%的細(xì)胞發(fā)生凋亡。而80 μmol·L-1的DTPA-CaNa3和80、40、20 μmol·L-1的NBED和鈾作用48 h后(30.8±1.2)%、(12.6±0.6)%、(21.0±0.7)%、(20.9±0.4)%的細(xì)胞發(fā)生凋亡。陽性藥組凋亡率顯著高于鈾模型組(P<0.01)，80 μmol·L-1NBED組凋亡率明顯低于鈾模型組和陽性藥組(P<0.01)(Fig 6)。由此可見，鈾誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，80 μmol·L-1DTPA-CaNa3處理后加劇了細(xì)胞的凋亡，80 μmol·L-1NBED明顯降低了細(xì)胞凋亡率。

2.7 NBED對鈾誘導(dǎo)細(xì)胞周期的影響各組分別作用HK-2細(xì)胞48 h后，流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示如Fig 7所示，與對照組相比，鈾模型組S期細(xì)胞比例增加，G0/G1、G2/M期細(xì)胞比例下降。40、80 μmol·L-1的NBED可明顯降低S期細(xì)胞比例(P<0.01)，而80 μmol·L-1的DTPA、20 μmol·L-1的NBED與模型組相比差異無顯著性。

Fig 7 Effect of NBED on cell cycle of HK-2 n=3)

3 討論

鈾進(jìn)入機體后會產(chǎn)生腎毒性、肝毒性、骨毒性、肺毒性等，并造成器官損傷、壞死和癌癥等一系列疾病，除手術(shù)切除治療外，藥物螯合是目前最有效的治療途徑[9]。本所自主設(shè)計合成的NBED(FZ-82-4鈉鹽)，前期實驗表明對钚、銅、鉛等具有良好的促排效果，但未見報道對鈾的促排效果。本實驗首次在動物水平證實NBED對鈾具有較好的促排效果，且效果優(yōu)于FDA批準(zhǔn)用藥DTPA-CaNa3。動物水平研究發(fā)現(xiàn)，300 mg·kg-1NBED對腎、骨具有較好的促排效果，可顯著減少腎、骨內(nèi)44.3%、18.8%的鈾含量，而300 mg·kg-1DTPA-CaNa3則減少16.6%和13.9%的腎、骨內(nèi)鈾含量。

細(xì)胞水平采用醋酸鈾酰誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞急性損傷模型，研究發(fā)現(xiàn)醋酸鈾酰作用HK-2細(xì)胞后，20、40和80 μmol·L-1的NBED立刻給藥共同作用48 h，分別比模型組減少了11%、20%、42%的鈾進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；20、40和80 μmol·L-1的NBED延遲24 h后給藥，分別比模型組增加了18%、32%、48%的排放量。而DTPA-CaNa3僅減少了13%的鈾進(jìn)入細(xì)胞，外排無效果。動物、細(xì)胞水平促排研究結(jié)果顯示，NBED對急性鈾損傷HK-2細(xì)胞具有較好的促排效果，而DTPA-CaNa3僅在細(xì)胞外發(fā)揮螯合作用，對細(xì)胞內(nèi)的鈾無促排效果。這可能與DTPA-CaNa3對鈾和釷幾乎無效，并且口服DTPA-CaNa3后大量存在于體液或血液中，很少能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用有關(guān)[10-11]。

腎是鈾的主要靶器官之一，研究表明，胞吞進(jìn)入腎近端小管S3段細(xì)胞內(nèi)的鈾酰離子，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、抑制LDH來抑制細(xì)胞ATP含量和糖異生，并通過消耗細(xì)胞內(nèi)酶類或非酶類抗氧化劑，增加活性氧含量，使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[12-13]。并通過誘導(dǎo)凋亡因子Bcl-2、Bid、Bax和caspase家族的表達(dá)，引起細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致DNA降解和細(xì)胞死亡[14]。本研究還發(fā)現(xiàn)NBED與醋酸鈾酰1 ∶1作用時，對鈾誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，可以提高HK-2細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞膜損傷，降低活性氧產(chǎn)生，增加抗氧化物SOD、GSH含量，減輕細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期S期的阻滯。而DTPA-CaNa3與醋酸鈾酰1 ∶1作用時，加劇了細(xì)胞的損傷。NBED屬于鄰苯二酚類化合物，且有研究報道含有鄰苯二酚基團(tuán)的螯合劑體外抗氧化實驗表明具有較高的自由基清除率[15]。而DTPA-CaNa3屬于多胺多羧酸類化合物，未見研究報道其具有清除自由基作用，且因其不能透過細(xì)胞膜，加之藥物本身的細(xì)胞毒性使之加劇了細(xì)胞的損傷。

綜上所述，新型促排劑NBED能明顯降低腎、骨內(nèi)鈾含量，對急性鈾損傷的HK-2細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，且優(yōu)于FDA批準(zhǔn)用藥DTPA-CaNa3，通過抑制細(xì)胞對鈾的攝取，并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈾的釋放，提高細(xì)胞存活率，抑制細(xì)胞內(nèi)ROS生成，提高抗氧化物SOD、GSH含量發(fā)揮抗氧化作用，并減輕鈾誘導(dǎo)細(xì)胞損傷后S期的阻滯和凋亡。本研究首次證實NBED對鈾中毒具有較好的促排效果，且能清除氧自由基，對鈾損傷的HK-2細(xì)胞具有保護(hù)作用，并為后續(xù)的研究提供一定的依據(jù)。