PPARβ調控硝化應激參與高糖對內皮細胞的損傷

陽 創(chuàng)，熊寶萍，鄭雲(yún)丹，李斯曼，周上鈞，蔣青松

(重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，重慶藥物代謝學重點實驗室，重慶 400016)

長期慢性高血糖是糖尿病的主要特征。持續(xù)血糖水平升高破壞血管內皮結構和功能，是糖尿病血管病變最重要的病理基礎之一[1]。在內皮細胞中，高血糖誘導應激反應，包括氧化應激和硝化應激，產(chǎn)生過量的活性氧和活性氮，使自由基清除平衡被破壞，從而引起DNA、蛋白質和細胞膜的損傷?，F(xiàn)有研究表明，抑制氧化應激反應可以改善血管內皮損傷[2]，但對硝化應激在糖尿病內皮細胞損傷中的作用研究則相對較少。在病理過程中，過量活性氮物質如過氧亞硝酸鹽(OONO-)的生成是硝化應激反應的重要特征，最終導致一氧化氮(nitric oxide，NO)生物利用度降低。既往研究表明，活性氮物質也可引起DNA損傷，損害內皮細胞功能[3]。因此，硝化應激在內皮損傷中相關機制的研究對糖尿病血管并發(fā)癥的防治可能具有重要意義。過氧化物酶體增殖物激活受體β(peroxidase proliferator activated receptor，PPARβ)是核受體超家族成員之一，可能是預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥的潛在靶標[4]。研究發(fā)現(xiàn)，激活PPARβ 可以減輕氧化應激，改善糖尿病小鼠的內皮功能[5-6]。然而，目前國內外尚未見PPARβ與硝化應激在高糖引起內皮細胞損傷中關系的研究。

本研究擬利用高糖孵育人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，分別給予PPARβ激動劑GW0742、PPARβ拮抗劑GSK0660和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制劑亞硝基左旋精氨酸甲酯(NG-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME)，初步觀察PPARβ與硝化應激在高糖損傷內皮功能中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞 HUVECs(SWEXB11506)購于武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.1.2試劑 DMEM低糖培養(yǎng)基(C11885500BT)購于美國Gibco公司；胎牛血清(SMK110.01)購于賽米克生物技術公司；BCA蛋白定量測定試劑盒(B09900190)購自北京鼎國昌盛生物公司；peroxynitrite assay試劑盒(ab233468)購自美國Abcam公司；EdU-488細胞增殖檢測試劑盒(C0071)、NO檢測試劑盒(S0023)、L-NAME(S0006)、D-葡萄糖(D-glucose，ST1127)均購自上海碧云天生物技術有限公司；GW0742(HY-13928)、GSK0660(HY-12377) 均購于美國MCE公司；eNOS小鼠單克隆抗體(SC-136977)、PPARβ小鼠單克隆抗體(SC-74517)購自美國Santa Cruz公司；CCK-8細胞活力及毒性檢測試劑盒(BA00208)、3-nitrotyrosine兔多克隆抗體(bs-8551R)購自博奧森生物科技公司；iNOS兔多克隆抗體(18985-1-AP)、GAPDH小鼠單克隆抗體(60004-1-Ig)購自武漢Proteintech公司；ECL化學發(fā)光顯影液(BL520A)購自北京Biosharp公司。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3儀器 細胞培養(yǎng)箱(Thermo)；細胞培養(yǎng)超凈臺(安泰技術有限公司)；倒置熒光顯微鏡(Nikon)；低溫離心機(Thermo)；濕式轉膜儀(Bio-Rad)；垂直電泳槽(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)；酶標儀(Thermo)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HUVECs細胞在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每48 h換液，待細胞生長達到80%～90%可進行傳代，取第3～6代細胞進行實驗。

1.2.2細胞活力檢測 將HUVECs細胞以5×103個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每組4個復孔，待細胞貼壁后換為無血清的低糖DMEM同步化24 h，隨后以含葡萄糖30、40、50 mmol·L-1以及甘露醇30 mmol·L-1(滲透壓對照組)的培養(yǎng)液處理48 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養(yǎng)箱孵育1 h后，在酶標儀450 nm處測定吸光度。

1.2.3實驗分組 將細胞在不含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基中同步化24 h后，給予相應藥物干預48 h后檢測。分組如下：① 正常葡萄糖對照組(NG，glucose 5.5 mmol·L-1)；② 高葡萄糖組(HG，glucose 30 mmol·L-1)；③ 高糖+PPARβ激動劑組(HG+GW0742 1 μmol·L-1)；④ 高糖+PPARβ激動劑+PPARβ拮抗劑組(HG+GW0742 1 μmol·L-1+GSK0660 1 μmol·L-1)；⑤ 高糖+PPARβ激動劑+NOS抑制劑組(HG+GW0742 1 μmol·L-1+L-NAME 10 μmol·L-1)。

1.2.4細胞增殖檢測 將細胞以5×104個/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板中，根據(jù)實驗分組采用相應藥物干預后，去除培養(yǎng)液，按照EdU-488細胞增殖檢測試劑盒說明書操作，將細胞與EdU染液于37 ℃孵育2 h，用4%多聚甲醛固定，使用Hoechst 33342進行細胞核染色，采用熒光顯微鏡觀察結果，計算細胞陽性染色百分率作為增殖率。

1.2.5Western blot檢測蛋白的表達 收集細胞，加入裂解液后冰上裂解30 min，14 000×g離心15 min，取上清，BCA法測蛋白濃度。蛋白上樣量為30 μg。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳，轉至PVDF膜后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入相應抗體，即抗PPARβ(1 ∶500)，抗eNOS(1 ∶500)，抗3-nitrotyrosine(1 ∶500)，抗iNOS(1 ∶1 000)，抗GAPDH(1 ∶10 000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后加入相應二抗(1 ∶5 000)室溫孵育2 h，再次洗膜，通過ECL顯影，采用化學發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。

1.2.6OONO-水平檢測 將HUVEC以2×104個/孔接種于黑色透明底的96孔酶標板中，過夜待細胞貼壁后，根據(jù)Peroxynitrite Assay試劑盒操作說明，按照實驗分組，加入90 μL相應分組的培養(yǎng)液，與10 μL Peroxynitrite Sensor Green工作液共同在37 ℃孵育2 h后，在Ex/Em=490/530 nm處測量熒光強度，以相對熒光單位(relative fluorescence units，RFU)代表OONO-的水平。

1.2.7NO含量檢測 將HUVEC以2×105個/孔接種于6 cm細胞培養(yǎng)皿中，按實驗分組給予相應藥物干預48 h，取培養(yǎng)液上清，按試劑盒操作說明，加入Griess Reagent I，Griess Reagent Ⅱ混勻，于酶標儀測定540 nm處吸光度，根據(jù)標準曲線計算NO濃度。

2 結果

2.1 高糖對HUVECs細胞活力的影響如Fig 1所示，高濃度葡萄糖(30、40、50 mmol·L-1)使細胞活力明顯降低。與正常葡萄糖濃度(5.5 mmol·L-1)比較，分別降低至(79.95±2.36)%、(72.32±5.17)%和(65.05±3.60)% (P<0.01)。甘露醇(30 mmol·L-1)對細胞活力沒有明顯影響(P>0.05)。

Fig 1 Effect of glucose at different concentrations on cell viability of HUVECs

2.2 高糖對HUVECs細胞增殖的影響綜合文獻[7]及細胞活力結果，以葡萄糖30 mmol·L-1為高糖(HG)進行后續(xù)實驗。Fig 2結果顯示，高糖處理明顯抑制HUVEC的增殖能力(P<0.01)。GW0742(1 μmol·L-1)可恢復被高糖損傷的HUVECs的增殖能力(P<0.01)。GSK0660(1 μmol·L-1)和L-NAME(10 μmol·L-1)均可取消GW0742的作用(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 2 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG)on cell proliferation of HUVECs

2.3 高糖對PPARβ、eNOS、iNOS、3-nitrotyrosine蛋白表達的影響如Fig 3所示，高糖孵育使HUVECs的PPARβ及eNOS蛋白表達明顯降低(P<0.05)，但iNOS和3-nitrotyrosine表達增加(P<0.05)。GW0742(1 μmol·L-1)可上調PPARβ及eNOS蛋白的表達(P<0.05)，并下調iNOS和3-nitrotyrosine蛋白的表達(P<0.05)。GSK0660(1 μmol·L-1)和L-NAME (10 μmol·L-1)均可取消GW0742的作用(P<0.05)(Fig 3)。

Fig 3 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG) on protein expression of PPARβ，eNOS，iNOS，and 3-nitrotyrosine )

2.4 高糖對OONO-水平的影響高糖刺激明顯使OONO-水平增加(P<0.01)。GW0742(1 μmol·L-1)明顯減少OONO-的水平(P<0.01)，且該作用可被GSK0660(1 μmol·L-1)和L-NAME(10 μmol·L-1)阻斷(P<0.01)(Fig 4)。

Fig 4 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG) on peroxynitrite (OONO-) level

2.5 高糖對NO含量的影響高糖孵育明顯降低HUVEC中NO的含量(P<0.01)。GW0742(1 μmol·L-1)可增加NO含量，GSK0660(1 μmol·L-1)或L-NAME(10 μmol·L-1)均可阻斷GW0742的作用(P<0.05)(Fig 5)。

Fig 5 Effect of glucose at 30 mmol·L-1 (HG) on

3 討論

糖尿病是一種累及微血管和大血管的多系統(tǒng)疾病，血管并發(fā)癥是Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病患者死亡的主要原因[8]。內皮細胞損傷可能是糖尿病血管并發(fā)癥最早的病理事件[9]。長期高血糖狀態(tài)引起內皮功能障礙、血小板高反應性、氧化應激和慢性炎癥等病理變化，破壞血管壁[1]。本實驗結果表明，隨葡萄糖濃度增加(30、40、50 mmol·L-1)，HUVEC細胞活力呈劑量依賴性下降，提示高濃度葡萄糖可損傷內皮細胞活性。同時，等滲透壓的甘露醇(30 mmol·L-1)對HUVEC細胞活力沒有影響，提示該損傷不是來自于滲透壓的改變。30～50 mmol·L-1的葡萄糖常被用于模擬糖尿病時機體的高血糖環(huán)境，以建立糖尿病離體實驗模型[7，10]。本實驗條件下，30 mmol·L-1葡萄糖即明顯損傷HUVECs活力，故以30 mmol·L-1為高濃度葡萄糖進行后續(xù)實驗。本研究中，高糖作用也使HUVECs細胞增殖能力下降，提示高糖可能抑制HUVECs的增殖，引起內皮細胞損傷。大量臨床前和臨床數(shù)據(jù)表明，內皮功能障礙在糖尿病血管并發(fā)癥中有重要作用[11-12]。因此，探索高糖狀態(tài)下內皮細胞損傷的參與因素及相關調控機制對于預防或延緩糖尿病患者血管并發(fā)癥具有重要意義。

現(xiàn)有研究表明，PPARs參與了多種慢性疾病(如糖尿病、癌癥、炎癥和動脈粥樣硬化)的發(fā)生、發(fā)展。PPARβ是PPARs的亞型之一，廣泛表達于全身各組織，在調節(jié)脂肪酸攝取、運輸和 β-氧化以及胰島素分泌和敏感性方面均有重要意義[13]。PPARβ受體激活可以改善小鼠的內皮功能障礙[14]。增加PPARβ表達和活性可保護氧化應激誘導HUVEC的凋亡[15]。這些研究顯示，PPARβ在維持血管內皮結構和功能完整性方面可能也有重要作用。我們的結果顯示，高糖作用使PPARβ蛋白表達下調；PPARβ激動劑GW0742上調PPARβ蛋白水平的同時，也改善高糖條件下HUVEC的細胞增殖能力；而PPARβ拮抗劑GSK0660可以取消GW0742的保護作用。上述結果提示，PPARβ可能參與了高糖對內皮細胞增殖的損傷作用。但PPARβ作用的相關分子機制，目前尚未完全清楚。

綜上所述，PPARβ參與了高糖引起的血管內皮細胞損傷，該作用可能是由硝化應激途徑介導的。本研究結果有助于進一步闡明糖尿病血管并發(fā)癥相關信號通路的調控機制，為糖尿病血管病變的防治提供潛在的作用靶點。