定點醫(yī)院新型冠狀病毒肺炎患者核酸檢測工作的實踐和探索

陳長強(qiáng)，孟 俊，金佩佩，戴 菁

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025）

2022 年3 月以來，以奧密克戎變異株為主要流行株的新型冠狀病毒(新冠)感染在上海流行，截至5 月22 日，已有62 余萬例感染者。為徹底、快速阻斷疫情傳播，盡早實現(xiàn)社會面清零，部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)緊急轉(zhuǎn)型為定點醫(yī)院、增建方艙醫(yī)院。

核酸檢測工作作為新冠肺炎臨床診療和疫情防控中的重要一環(huán)，其檢測質(zhì)量是保障疫情防控工作順利進(jìn)行的關(guān)鍵。國家衛(wèi)生健康委員會(衛(wèi)健委)辦公廳和國家中醫(yī)藥管理局辦公室于2022 年3 月14 日頒布了《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第九版)》(下稱第九版方案)[1]，其中對感染者的解除隔離標(biāo)準(zhǔn)和出院標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了更新，使新冠核酸檢測循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct 值)作為重要的臨床診療轉(zhuǎn)歸指標(biāo)，被廣泛提及。然而，Ct 值受分析前、分析中和分析后的多種因素影響，涵蓋了受檢者準(zhǔn)備、樣本采集、樣本運輸、樣本處理及結(jié)果審核等各個環(huán)節(jié)[2-5]。加之實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)與第九版方案中解除隔離及出院標(biāo)準(zhǔn)不一致，對臨床和實驗室都產(chǎn)生了較大的困擾。在此背景下，新冠肺炎患者的核酸檢測工作在結(jié)果審核、復(fù)檢流程及報告方式等方面，均應(yīng)與人群篩查時有所不同。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院瑞金醫(yī)院北部院區(qū)作為較早轉(zhuǎn)型的定點醫(yī)院之一，經(jīng)過一段時間的實踐和探索，對于新冠肺炎患者的核酸檢測工作積累了相關(guān)經(jīng)驗，現(xiàn)總結(jié)如下。

材料與方法

一、材料

選取2022 年4 月1 日至10 日期間，瑞金醫(yī)院北部院區(qū)收治的新冠肺炎患者共462 例，統(tǒng)計其入院時核酸檢測的基礎(chǔ)Ct 值，分析患者住院期間Ct值隨時間變化的規(guī)律。整理分析3 月20 日至3 月31 日(轉(zhuǎn)型前期)和4 月1 日至4 月10 日(轉(zhuǎn)型后期)2 個時間段內(nèi)的核酸檢測記錄和復(fù)檢記錄，統(tǒng)計分析因樣本采集不合格導(dǎo)致檢測結(jié)果假陰性的情況。

二、方法

1.比較試劑A 和試劑B 檢測性能的差異：選取213 份住院新冠肺炎患者的核酸檢測樣本，采用2 種不同試劑進(jìn)行平行檢測，由不同實驗人員、不同儀器，分3 d 完成實驗。觀察真實工作場景中2 種試劑的應(yīng)用情況，分析比較2 種試劑的差異。2 種試劑的基本參數(shù)見表1。

表1 2 種檢測試劑的基本參數(shù)

2.制定臨床樣本復(fù)檢的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序(standard operation procedure，SOP)文件：根據(jù)相關(guān)規(guī)章要求，結(jié)合臨床工作實際，制定本實驗室臨床樣本復(fù)檢的SOP 文件。

3.制備弱陽性質(zhì)控品，加強(qiáng)室內(nèi)質(zhì)量控制：根據(jù)國家和上海市臨床檢驗中心的相關(guān)要求，結(jié)合實際工作情況，本實驗室將陽性質(zhì)控品用樣本保存液進(jìn)行稀釋，使其檢測Ct 值在35 左右。將該自制的弱陽性質(zhì)控品分裝后，置于-20 ℃下冷凍保存，每天復(fù)融后分別檢測5 次，連續(xù)檢測4 d，獲得20 組數(shù)據(jù)。

結(jié)果

一、新冠肺炎患者住院期間Ct 值變化趨勢

462 例新冠肺炎患者入院時的核酸檢測基礎(chǔ)Ct 值見表2 和圖1A。患者ORF1ab 和N 基因Ct值＜30 的比例分別為69.26%(320 例) 和70.78%(327 例)。分析184 例ORF1ab 和N 基因Ct 值均＜30 的患者，發(fā)現(xiàn)其Ct 值升至30 以上所需的時間為4～8 d，中位時間為6 d(見圖1B)。63.04%(116 例)的患者在6 d 內(nèi)ORF1ab 和N 基因Ct 值即開始＞30，轉(zhuǎn)陰時間與基礎(chǔ)Ct 值成負(fù)相關(guān)(見圖1C、1D)。

圖1 462 例患者入院基礎(chǔ)Ct 值和184 例患者Ct 值隨時間變化情況

表2 462 例患者入院時ORF1ab 和N 基因Ct 值基本情況[中位數(shù)(P25～P75)]

二、樣本采集不合格率

在我院轉(zhuǎn)型前期，工作人員相對人手不足，工作任務(wù)重，壓力大，各病區(qū)的樣本采集不合格率較高。且由于不同病區(qū)間的工作任務(wù)差異，人員配置不同等，不同病區(qū)間的采樣不合格率差異有統(tǒng)計意義(P＜0.05)。轉(zhuǎn)型后期隨著采樣相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)工作的開展及工作人員的補(bǔ)充，各病區(qū)的采樣不合格率均明顯下降(P＜0.01)(見表3)。

表3 不同病區(qū)間樣本采集不合格率的差異

三、2 種試劑檢測臨床樣本間的差異

將213 份住院新冠肺炎患者的核酸檢測樣本分別用2 種不同的檢測試劑進(jìn)行檢測，結(jié)果見表4、5。對于ORF1ab 和N 基因Ct 值＜30 的樣本，2 種試劑檢測結(jié)果間的一致性較好，R 值分別為0.959 8和0.959 4(見圖2A、2B)。但對于Ct 值在30～40 范圍內(nèi)的樣本，兩者檢測結(jié)果間的一致性下降。尤其Ct 值在35～40 的樣本，試劑B 檢測ORF1ab 和N基因均存在20 余例漏檢的情況(見圖2C、2D)。

圖2 213 份臨床核酸檢測樣本用2 種試劑檢測的結(jié)果分析

表4 2 種試劑檢測213 份樣本ORF1ab 基因Ct 值的比較

四、弱陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果

實驗室自制弱陽性質(zhì)控品和2 個商品化弱陽性質(zhì)控品的檢測結(jié)果見表6。自制弱陽性質(zhì)控品ORF1ab 和N 基因Ct 值在35 左右，2 個商品化質(zhì)控Ct 值均在31 左右，能較好覆蓋臨床上弱陽性樣本的檢測范圍。

表5 2 種試劑檢測213 份樣本N 基因Ct 值的比較

表6 3 個弱陽性質(zhì)控品ORF1ab 和N 基因Ct 值統(tǒng)計()

表6 3 個弱陽性質(zhì)控品ORF1ab 和N 基因Ct 值統(tǒng)計()

討 論

一、規(guī)范樣本采集、轉(zhuǎn)運流程，合理安排患者檢測頻次

研究表明，在疾病的不同階段和機(jī)體不同部位存在的病毒載量有所不同，多種樣本類型均可用于新冠肺炎的核酸檢測，如肺泡灌洗液、深咳痰、鼻咽拭子、口咽拭子、唾液、血液及糞便等[2-6]。但考慮到實際工作中操作的方便性和患者的接受度，以及現(xiàn)有實驗室檢測方法的靈敏度對于非上呼吸道標(biāo)本的不適用性等，目前呼吸道樣本(口咽拭、鼻咽拭)應(yīng)用最為廣泛。

樣本采集的質(zhì)量是保證后續(xù)檢測結(jié)果準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵。由不規(guī)范的采樣程序(如使用錯誤的拭子、采樣部位不準(zhǔn)確、分泌物吸取量不足，交叉污染等)獲得的不合格樣本是產(chǎn)生假陰性、假陽性檢測結(jié)果的主要原因[2-4]。經(jīng)過初步統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在我院轉(zhuǎn)型前期，工作人員人手不足，工作任務(wù)重，壓力大；核酸陽性患者呼吸道樣本的采集過程中會增加采樣人員的暴露風(fēng)險，采樣人員難免會有心理負(fù)擔(dān)，也是導(dǎo)致部分患者樣本采集不合格產(chǎn)生假陰性的原因。各病區(qū)間工作任務(wù)的差異，工作人員配置的差異等，同樣也會導(dǎo)致樣本采集不合格率的差異，宜應(yīng)引起足夠的重視。隨著后期相關(guān)培訓(xùn)工作的開展，工作人員的補(bǔ)充，各病區(qū)的樣本采集質(zhì)量顯著提高，不合格率明顯降低。

實驗室方面，核酸陽性樣本的檢測量越大，實驗室污染的風(fēng)險越高，假陽性率越高。尤其部分實驗室還承擔(dān)著大量的社區(qū)篩查任務(wù)，需引起足夠的重視。另外，還要兼顧到社會醫(yī)療資源的經(jīng)濟(jì)性，所以，新冠陽性患者合理的核酸檢測頻次，在降低實驗室污染風(fēng)險、保證檢測質(zhì)量、節(jié)省社會醫(yī)療資源等方面，具有重要的意義。通過對部分患者入院基礎(chǔ)Ct 值和時間變化規(guī)律的分析，患者ORF1ab 和N基因的基礎(chǔ)Ct 值與轉(zhuǎn)陰間隔呈負(fù)相關(guān)，與其他研究[6-7]相似，建議可將此類患者(Ct 值＜30)的核酸檢測頻次定為3 d 或4 d 檢測1 次，Ct 值大于30 以后可每2 d 檢測1 次。

二、評估檢測試劑性能，制定復(fù)檢規(guī)范和流程

實驗室檢測環(huán)節(jié)(分析中)是整個核酸檢測工作中的重中之重，檢測試劑的穩(wěn)定性能、儀器設(shè)備的良好運轉(zhuǎn)，是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提。根據(jù)國家衛(wèi)健委的相關(guān)要求，實驗室應(yīng)常備2 種及以上的檢測試劑用于初檢和復(fù)檢。實驗室在選用前，都應(yīng)對檢測試劑的性能進(jìn)行驗證，包括但不限于精密度、準(zhǔn)確度及靈敏度等。但實驗室往往受限于真實臨床樣本的不足，性能驗證樣本一般選用科研質(zhì)?；蛸|(zhì)控品等，很難對檢測試劑的檢測性能進(jìn)行全面的評價。

目前，市面上可供選擇的試劑越來越多，試劑質(zhì)量也較疫情初期有明顯提升，但不同品牌試劑間的差異仍然存在[8]。Evans 等[9]的研究也表明，對于同一室間質(zhì)評樣本，使用不同檢測試劑，在不同的實驗室，測得的Ct 值會有明顯差異。本研究發(fā)現(xiàn)，2 種試劑對病毒載量較高的陽性樣本的檢測結(jié)果間一致性較好，而試劑B 對病毒載量處于臨界值的弱陽性標(biāo)本檢出能力欠佳，試劑A 在此范圍內(nèi)更有優(yōu)勢。在質(zhì)量控制方面，試劑A 采用的外源性內(nèi)標(biāo)，若實驗過程中出現(xiàn)人員操作失誤、核酸提取儀器故障或檢測試劑擴(kuò)增效率下降等問題，擴(kuò)增結(jié)束后可觀察到內(nèi)標(biāo)曲線的離散度增大、熒光峰值降低、檢測Ct 值相較以往偏倚較大等，能夠幫助實驗人員及時發(fā)現(xiàn)問題。而試劑B 的內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)(RNase P 基因)除具有上述監(jiān)測效果外，還能更好地監(jiān)控樣本采集過程。事實上，本實驗室中發(fā)現(xiàn)的因樣本采集不合格而導(dǎo)致的假陰性，也多是通過試劑B 內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)的監(jiān)控。所以，實驗室在選擇試劑前應(yīng)充分對其進(jìn)行性能驗證，了解各試劑盒的優(yōu)缺點，綜合評估，不同的試劑盒在臨床工作中可相互補(bǔ)充，更好地完成檢測任務(wù)。

鑒于樣本采集差異、實驗室人員操作差異及不同試劑差異等對檢測結(jié)果影響，實際工作中應(yīng)嚴(yán)格對可疑樣本進(jìn)行復(fù)檢。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，工作人員先對陰性質(zhì)控和弱陽性質(zhì)控的檢測結(jié)果進(jìn)行審核，如無失控情況，則進(jìn)一步分析各樣本檢測結(jié)果，重點觀察樣本檢測的熒光曲線是否典型。將檢測Ct值導(dǎo)入LIS 系統(tǒng)中，結(jié)合該患者歷次檢測結(jié)果，對本次檢測結(jié)果進(jìn)行審核發(fā)放。對于新冠肺炎患者檢測Ct 值首次出現(xiàn)≥35 或NoCt 的樣本，為排除假陰性，需結(jié)合歷次檢測結(jié)果判斷是否應(yīng)進(jìn)行復(fù)檢，復(fù)檢時優(yōu)先選擇試劑A(見圖3)。而對于患者前次檢測Ct 值≥35 或陰性(NoCt)，而本次檢測Ct 值＜35的樣本，更應(yīng)慎重審核，以排除假陽性，復(fù)檢時采用試劑A 和試劑B 平行檢測(見圖4)。

圖3 陽性患者陰性樣本的復(fù)檢流程

圖4 患者疑似假陽性樣本的復(fù)檢流程

三、規(guī)范工作流程，加強(qiáng)室內(nèi)質(zhì)量控制、儀器設(shè)備的管理和人員培訓(xùn)考核

目前，雖然核酸檢測的自動化程度越來越高，各種儀器設(shè)備層出不窮，一定程度上緩解了實驗室工作人員的壓力。但大部分實驗室的核酸檢測工作，從反應(yīng)試劑的配制，到原始樣本整理和提取核酸產(chǎn)物的加樣，再到檢測結(jié)果的分析、檢驗報告的審核等全過程仍高度依賴于工作人員的手工操作。所以，實驗室應(yīng)規(guī)范操作流程，嚴(yán)格設(shè)置室內(nèi)質(zhì)控的同時，還應(yīng)加強(qiáng)對實驗室工作人員的培訓(xùn)和考核。

實驗室工作人員的操作能力，很大程度上影響了核酸檢測的質(zhì)量。我科定期對工作人員進(jìn)行培訓(xùn)，包括但不限于理論知識、操作技能等，更結(jié)合實際工作中的情況，及時反饋溝通存在的問題，不斷提升實驗室工作人員的理論知識水平和實踐操作技能。

根據(jù)國家和上海市臨床檢驗中心的相關(guān)要求，每塊反應(yīng)板中室內(nèi)質(zhì)控設(shè)置3 個陰性和2 個弱陽性。第九版診療規(guī)范出臺后，臨床上對Ct 值35 范圍內(nèi)的檢測結(jié)果更為關(guān)注。目前，本實驗室購買的2 個品牌弱陽性質(zhì)控品ORF1ab 和N 基因檢測Ct值均在31～32 范圍內(nèi)。為保證實驗室檢測結(jié)果的一致性，更好地監(jiān)控Ct 值在35 左右的樣本檢測結(jié)果。本實驗室加入了自制的弱陽性質(zhì)控品，將每塊反應(yīng)板的弱陽性質(zhì)控增加為3 個，參考定量試驗的室內(nèi)質(zhì)控方法，在LIS 系統(tǒng)質(zhì)控軟件中導(dǎo)入弱陽性質(zhì)控檢測結(jié)果，實時對2 個水平的弱陽性質(zhì)控進(jìn)行監(jiān)控。當(dāng)然，此質(zhì)控方式的實際應(yīng)用效果，還要經(jīng)過大量的實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行驗證和優(yōu)化，也是本實驗室以后工作中需要不斷探索的內(nèi)容[10]。

四、嚴(yán)格審核分析檢測結(jié)果，及時發(fā)現(xiàn)并解決問題

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，實驗結(jié)果的判讀是核酸檢測質(zhì)量保證的最后一道關(guān)卡，宜由經(jīng)驗豐富的工作人員進(jìn)行，必要時需2 人對結(jié)果進(jìn)行審核判讀[10]。陰性和弱陽性質(zhì)控均在控的情況下，逐一對樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行審核。需重點關(guān)注每批反應(yīng)的基線設(shè)置，每份樣本各靶基因通道的熒光曲線情況。對于實驗結(jié)果中出現(xiàn)的不同問題，應(yīng)根據(jù)實際情況分析可能原因，排除干擾因素后，根據(jù)復(fù)檢規(guī)則對可疑的樣本結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢。

此區(qū)工作人員應(yīng)對整個實驗過程具有較深的理解，熟練掌握本實驗室所用檢測試劑的性能和優(yōu)缺點，合理應(yīng)用室內(nèi)質(zhì)控和試劑盒內(nèi)標(biāo)監(jiān)控實驗過程，并能嫻熟地分析處理實驗過程中的異常結(jié)果。實際工作中，往往會存在某些不易及時發(fā)現(xiàn)并排除的問題，如工作人員不規(guī)范的操作習(xí)慣、核酸提取儀和擴(kuò)增儀系統(tǒng)性故障等。在對檢測結(jié)果進(jìn)行分析時，不應(yīng)只關(guān)注擴(kuò)增曲線是否檢出，其他如內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增曲線的離散度、各靶基因擴(kuò)增曲線的熒光峰值、指數(shù)期的斜率、同一樣本各靶基因Ct 值的差異等，也應(yīng)著重關(guān)注。如此才能及早發(fā)現(xiàn)問題，避免對檢測結(jié)果產(chǎn)生更大的影響。

五、結(jié)語與展望

目前，新冠肺炎核酸檢測主要依賴實時熒光定量PCR 技術(shù)在專用的基因擴(kuò)增實驗室中完成。作為定性試驗，檢測結(jié)果易受分析前、分析中和分析后多種因素影響。第九版診療規(guī)范頒布以來，檢測Ct 值的概念廣為人知，核酸檢測也因此在新冠肺炎患者的臨床診斷和轉(zhuǎn)歸判讀中扮演著越來越重的角色。實驗室面臨著巨大的壓力和挑戰(zhàn)，如何降低樣本檢測結(jié)果的假陰性率和假陽性率，如何實現(xiàn)新冠核酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，保證實驗室檢測結(jié)果的一致性，如何解決目前實驗室診斷標(biāo)準(zhǔn)和臨床判讀標(biāo)準(zhǔn)不一致等問題，將是未來一段時間內(nèi)，國家相關(guān)機(jī)構(gòu)、臨床實驗室和試劑生產(chǎn)廠商需要尤為關(guān)注的問題。