MF59和甘油-3-磷酸復(fù)合佐劑對(duì)甲型H1N1流感抗原體液免疫效果的作用

王 珂 毛雙雙 馬心怡 李玉卓 李雅林

山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）臨床與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東泰安 271000

甲型H1N1流感是由甲型流感病毒感染引起的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，傳染性強(qiáng)且危害嚴(yán)重[1］。現(xiàn)行流感疫苗產(chǎn)能遠(yuǎn)不能滿足控制流感大流行的實(shí)際需求，且存在一定不良反應(yīng)和保護(hù)作用時(shí)間短等問題，因此開發(fā)更安全、更有效的新型甲型H1N1流感疫苗勢(shì)在必行[2］。佐劑具有增強(qiáng)疫苗免疫效果的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，有增強(qiáng)免疫反應(yīng)低下人群如嬰幼兒和老年人的免疫應(yīng)答效應(yīng)、增強(qiáng)抗原的免疫原性、加速對(duì)疫苗的反應(yīng)、節(jié)省劑量等優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)行流感疫苗使用的鋁佐劑、MF59和AS03是影響目前甲型H1N1疫苗效果的重要因素[3-5］。盡管MF59佐劑甲型H1N1疫苗在保護(hù)率方面優(yōu)于鋁佐劑和AS03佐劑疫苗，但保護(hù)率仍不理想。近年來，甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P）作為糖酵解和脂肪代謝過程的重要組成部分，被發(fā)現(xiàn)是一種安全、高效的佐劑[6］。鑒于MF59為佐劑的流感疫苗保護(hù)率不理想，以及G3P佐劑的安全性較好，本研究擬制備復(fù)合佐劑MF59和G3P，探討復(fù)合佐劑用于甲型H1N1流感疫苗的效果，為未來開發(fā)人用新型甲型H1N1流感疫苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康8周齡雌性BALB/c小鼠，50只，鼠齡8周，體質(zhì)量18~22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物均在山東第一醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。

1.2 試劑與儀器

Span-85購(gòu)自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。Tween-80和角鯊烯、胰酶均購(gòu)自于北京索萊寶科技有限公司。G3P購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。甲型H1N1流感裂解疫苗，購(gòu)自北京天壇生物制品有限公司，0.5 mL/支，總蛋白含量169μg/mL，血凝素（hemagglutinin，HA）含量30.2μg/mL。編碼全長(zhǎng)HA（A/California/05/2009）和NA（A/Ohio/07/2009）的cDNAs由人工合成，并克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pVRC的多克隆位點(diǎn)中，由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒所提供。受體破壞酶（receptor destroying enzymes，RDE），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。本研究用到的主要儀器有生物安全柜（香港力康生物醫(yī)療科技控股有限公司，HFSafe1200LC）、乳化機(jī)（南通博萊德機(jī)械科技有限公司，AYD-100）、酶標(biāo)儀（上海賽默飛世爾，Multiskan FC）、熒光顯微鏡（日本奧林巴斯，BX53）。

1.3 方法

1.3.1 制備MF59佐劑[7］將Tween?80、Span 85、角鯊烯和10 nM檸檬酸鈉分別按照體積比0.5%（2.5 mL）、0.5%（2.5 mL）、4.3%（21.5 mL）和94.7%（473.5 mL）進(jìn)行混合，用乳化劑乳化10 min，變成乳白色勻質(zhì)狀，制成MF59乳劑，用0.22μm濾膜過濾除菌備用。

1.3.2 制備MF59和G3P復(fù)合佐劑甲型H1N1流感疫苗 分別將MF59（250μL）、G3P（2 mg），單獨(dú)或二者一起和甲型H1N1流感抗原（含2.5μg HA）按一定比例混合，制成0.5 mL體積，在2~8℃中保存或直接進(jìn)行免疫。

1.3.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及免疫方案 選取8周齡雌性BALB/c小鼠，將50只小鼠分5組：空白對(duì)照組、單純甲型H1N1流感抗原組、甲型H1N1流感抗原+MF59佐劑組（簡(jiǎn)稱MF59佐劑組）、甲型H1N1流感抗原+G3P佐劑組（簡(jiǎn)稱G3P佐劑組）、甲型H1N1流感抗原+MF59和G3P復(fù)合佐劑組（簡(jiǎn)稱復(fù)合佐劑組）。單純甲型H1N1流感抗原組腹腔注射甲型H1N1流感抗原0.5 mL，其他組進(jìn)行腹腔注射0.5 mL疫苗，空白組腹腔注射等量0.01 M PBS（pH 7.2~7.4）。于第0天和第28天進(jìn)行免疫2次。于初免后第28天和初免后第42天即第二次加強(qiáng)免疫后2周，于尾靜脈采血，分離血清待檢。

1.3.4 疫苗安全性檢測(cè)[8］接種后連續(xù)3 d觀察小鼠有無明顯異常，如蜷縮、流淚、體質(zhì)量減輕，重點(diǎn)觀察鼻孔及口腔處是否有炎癥、潰瘍及脫毛現(xiàn)象，并抽檢接種部位有無潰瘍。

1.3.5 抗H1N1特異性抗體ELISA檢測(cè)[9］將重組HA用包被液稀釋至2μg/mL，加至96孔酶標(biāo)板中，每孔100μL，4℃包被過夜。用洗液洗板3次，每孔加入100μL封閉液，37℃溫育1 h。用稀釋液將血清樣品從1∶100開始2倍系列稀釋，每孔100μL，37℃溫育1 h。用洗滌液洗板3次，每孔加入10μL HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，37℃溫育1 h。洗板3次，加入底物液100μL。顯色10 min，加入100μL終止液，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD492nm值。

1.3.6 血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)血凝抗體效價(jià)[9］按常規(guī)方法用生理鹽水將雞紅細(xì)胞配成1%溶液。分別取每個(gè)血清樣品4μL，加入RDE 16μL，混勻，37℃過夜。次日，將經(jīng)RDE處理后的血清于56℃水浴50 min以滅活多余的RDE。以2009 H1N1滅活全病毒（380μg/mL）為抗原，用生理鹽水稀釋至2μg/mL，從原液開始，按倍比稀釋法連續(xù)稀釋至1∶64稀釋度，每孔50μL加入96孔圓底板中。每孔再加入生理鹽水50μL，1%雞紅細(xì)胞50μL，室溫放置45 min。判定抗原的血凝效價(jià)，以出現(xiàn)完全凝集的HA最高稀釋度為1個(gè)血凝單位。將RDE處理的血清用生理鹽水從1∶100開始2倍系列稀釋，每孔50μL。用生理鹽水將抗原稀釋成4個(gè)血凝單位，每孔50μL，室溫作用1 h。每孔加入1%雞紅細(xì)胞50μL，室溫作用45 min后觀察結(jié)果。以出現(xiàn)完全抑制的血清最高稀釋度的倒數(shù)為血凝抗體效價(jià)。

1.3.7 流感病毒假病毒的制備及假病毒中和試驗(yàn) 按常規(guī)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法，將質(zhì)粒25μg（其中HA∶NA∶gag-MuLV∶EGFP-MuLV=3∶3∶10∶10）轉(zhuǎn)染50%融合的293 T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，3 000 r/min 4℃離心10 min，取上清凍存于-70℃。胰酶消化A549細(xì)胞，重懸于50 mL DMEM完全培養(yǎng)基，取100μL加入96孔細(xì)胞板，18~24 h后進(jìn)行中和試驗(yàn)。按1∶50的體積比向假病毒中加入10 mg/mL胰酶，37℃水浴1 h。用DMEM完全培養(yǎng)基在96孔細(xì)胞板上從1∶20開始倍比稀釋血清樣品，每孔50μL。將上述經(jīng)預(yù)處理的假病毒加入已稀釋的待測(cè)血清中，每孔50μL，室溫孵育1 h，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔GFP陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算90%中和抗體滴度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 疫苗安全性檢測(cè)

接種后連續(xù)3 d觀察各組小鼠均未發(fā)現(xiàn)小鼠有明顯異常，無蜷縮、流淚、體質(zhì)量減輕；鼻孔及口腔處均無明顯炎癥、潰瘍及脫毛現(xiàn)象；抽檢的接種部位未見潰瘍；生活習(xí)性均正常。表明制備的疫苗具有良好的安全性。

2.2 免疫后小鼠血清抗H1N1 IgG水平檢測(cè)

各實(shí)驗(yàn)組小鼠接受流感疫苗免疫接種后，小鼠血清中的抗H1N1 IgG抗體水平逐漸升高，而對(duì)照組小鼠無抗體產(chǎn)生。MF59佐劑組和G3P佐劑組抗H1N1 IgG均高于單純流感抗原組（P<0.05），而MF59和G3P復(fù)合佐劑組抗H1N1 IgG最高，高于MF59佐劑組和G3P佐劑組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），詳見表1。

表1 不同組小鼠血清中抗H1N1 IgG抗體滴度比較（±s）（GMT，Log10）

表1 不同組小鼠血清中抗H1N1 IgG抗體滴度比較（±s）（GMT，Log10）

注：G3P為甘油-3-磷酸；與空白對(duì)照組比較，a P<0.05；與流感抗原組比較，b P<0.05；與MF59佐劑組比較，c P<0.05；與G3P佐劑組比較，d P<0.05

組別空白對(duì)照組甲型H1N1流感抗原組MF59佐劑組G3P佐劑組復(fù)合佐劑組F P初免疫后天數(shù)28 0.00±0.00 2.32±0.29a 2.94±0.65ab 2.74±0.25ab 4.81±0.83abcd 66.140<0.001 42 0.00±0.00 3.32±0.53a 4.67±0.68ab 4.56±0.64ab 7.38±1.42abcd 72.840<0.001

2.3 血凝抑制（haemagglutination inhibition，HI）抗體測(cè)定結(jié)果

各實(shí)驗(yàn)組小鼠接受流感疫苗免疫接種后，小鼠血清中的抗H1N1 IgG HI抗體水平逐漸升高，而對(duì)照組小鼠無HI抗體產(chǎn)生。MF59佐劑組和G3P佐劑組HI水平均高于單純流感抗原組（P<0.05），而MF59佐劑組和G3P復(fù)合佐劑組HI水平最高，高于MF59佐劑組和G3P佐劑組（P<0.05）。詳見表2。

表2 不同組小鼠血清中流感病毒疫苗HI抗體滴度的比較（ ±s）（GMT，Log10）

表2 不同組小鼠血清中流感病毒疫苗HI抗體滴度的比較（ ±s）（GMT，Log10）

注：G3P為甘油-3-磷酸；與空白對(duì)照組比較，a P<0.05；與流感抗原組比較，b P<0.05；與MF59佐劑組比較，c P<0.05；與G3P佐劑組比較，d P<0.05

組別空白對(duì)照組甲型H1N1流感抗原組MF59佐劑組G3P佐劑組復(fù)合佐劑組F P初免疫后天數(shù)28 0.00±0.00 2.02±0.22a 2.44±0.46ab 2.35±0.46ab 3.81±0.64abcd 27.820<0.001 42 0.00±0.00 2.82±0.37a 3.46±0.59ab 3.25±0.45ab 4.85±0.64abcd 10.990<0.001

2.4 假病毒中和抗體測(cè)定結(jié)果

對(duì)上述免疫血清進(jìn)行流感病毒假病毒的中和抗體滴度的測(cè)定。結(jié)果顯示，與無佐劑單純流感抗原組相比，MF59佐劑或G3P佐劑在初次免疫28 d后并沒有提高中和抗體滴度，但加強(qiáng)免疫2周后可提高8倍。MF59和G3P復(fù)合佐劑誘導(dǎo)產(chǎn)生了更高滴度的中和抗體，初次免疫后可提高4~32倍，加強(qiáng)免疫后可提高16~64倍。詳見表3。

表3 不同組小鼠免疫血清對(duì)2009 H1N1流感病毒假病毒的90%中和抗體滴度的比較

3 討論

甲型H1N1流感病毒是人類最常見的流感病毒之一。在流感流行季節(jié)之前對(duì)人群進(jìn)行流感疫苗接種可有效減少接種者感染流感機(jī)會(huì)或減輕流感癥狀[4］。目前全球使用的流感疫苗包括全病毒滅活疫苗、裂解疫苗和亞單位疫苗等，盡管各類流感疫苗已經(jīng)能夠大批量生產(chǎn)，但流感的全球發(fā)病率和死亡率仍不容忽視[5］。因此開發(fā)高效、普適、安全的流感疫苗對(duì)于預(yù)防流感的發(fā)生以及應(yīng)對(duì)大流行性流感和季節(jié)性流感至關(guān)重要。

佐劑因具有增強(qiáng)疫苗免疫應(yīng)答的作用而廣泛用作疫苗的制備，MF59是一種水包油佐劑，它在許多國(guó)家被許可用于大流行性流感和季節(jié)性流感疫苗的生產(chǎn)。研究表明，MF59在人體內(nèi)安全且耐受性良好[10-12］。最初將MF59與CpG聯(lián)合使用是在流感領(lǐng)域，其誘導(dǎo)了高于單獨(dú)佐劑的抗體滴度和Th1應(yīng)答[13］。G3P是糖酵解和脂肪代謝過程的重要組成部分[14-15］。已有研究表明，G3P誘導(dǎo)甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）產(chǎn)生特異性的抗HAV抗體效果明顯好于鋁佐劑的誘導(dǎo)效果，能夠迅速產(chǎn)生免疫應(yīng)答，是一種安全、高效的佐劑[16］。本研究制備了MF59佐劑，在此基礎(chǔ)上制備了MF59和G3P復(fù)合佐劑流感疫苗、MF59流感佐劑疫苗、G3P佐劑流感疫苗以及單純流感疫苗，于初免和加強(qiáng)免疫后通過ELISA檢測(cè)抗H1N1 IgG抗體水平分析疫苗的體液免疫效果，通過HI試驗(yàn)檢測(cè)HI抗體滴度和假病毒中和試驗(yàn)評(píng)價(jià)體液免疫的保護(hù)效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各組小鼠均無不良反應(yīng)，表明疫苗有良好的安全性。MF59和G3P復(fù)合佐劑組通過腹腔免疫誘導(dǎo)抗H1N1 IgG的水平最高，HI抗體最高，假病毒中和抗體滴度最高，優(yōu)于MF59佐劑組和G3P佐劑組，表明復(fù)合佐劑疫苗具有增強(qiáng)甲型H1N1流感疫苗效果的顯著優(yōu)勢(shì)。本研究為開發(fā)用于人的新型甲型H1N1流感疫苗提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。盡管本研究取得初步結(jié)果，但由于實(shí)驗(yàn)條件限制，未深入研究復(fù)合佐劑流感疫苗誘導(dǎo)體液免疫作用的機(jī)理，在今后的工作中，將深入研究復(fù)合佐劑H1N1流感疫苗誘導(dǎo)體液免疫的作用機(jī)制。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突