基于多組學(xué)數(shù)據(jù)研究奧卡西平抗癇機(jī)制

徐 雯 呂玉芹 高 蕾 張敬軍

山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，山東泰安 271000

癲癇是神經(jīng)系統(tǒng)常見病，病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明[1］。奧卡西平是卡馬西平的10-酮類似物，通過抑制持續(xù)、高頻、重復(fù)神經(jīng)元放電，減少突觸傳遞興奮發(fā)揮抗癇作用[2］。70%～80%的癲癇患者由一個(gè)或多個(gè)遺傳因素導(dǎo)致，其余20%～30%由后天因素引起，如中風(fēng)、腫瘤或頭部損傷[4］。基因組技術(shù)和生物信息學(xué)的進(jìn)步促進(jìn)了全基因組范圍內(nèi)基因變異的發(fā)現(xiàn)[3］，本研究從遺傳學(xué)角度結(jié)合藥物靶點(diǎn)信息，利用生物信息學(xué)如單細(xì)胞測(cè)序、全基因組關(guān)聯(lián)分析（genome-wide association study，GWAS）等 研 究奧卡西平與癲癇基因的相關(guān)性，進(jìn)一步明確奧卡西平抗癲癇機(jī)制，為其臨床應(yīng)用及實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

DrugBank數(shù)據(jù)庫（http：//www.drugbank.ca/）；DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）；MAGMA軟件（https：//ctglab.nl/software/magma）；GWAS數(shù)據(jù)庫；EWCE包。

1.2 利用DrugBank獲取奧卡西平的靶基因

DrugBank是世界上使用最廣泛的參考藥物資源之一，涵蓋藥物靶點(diǎn)、藥物作用和藥物相互作用信息[5-6］。進(jìn)入DrugBank，輸入關(guān)鍵詞Oxcarbazepine進(jìn)行檢索，藥物靶點(diǎn)包括四個(gè)方面：Targets、Enzymes、Carriers、Transporters，展開靶點(diǎn)信息詳細(xì)頁面，下載、存儲(chǔ)并整理數(shù)據(jù)。

1.3 利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行奧卡西平25個(gè)靶基因的ID轉(zhuǎn)換

DAVID是一個(gè)整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具的生物信息數(shù)據(jù)庫，為大規(guī)模的基因或蛋白提供系統(tǒng)的功能注釋信息。DAVID可將大型基因列表壓縮為基因功能組，在基因/蛋白質(zhì)標(biāo)識(shí)符之間進(jìn)行轉(zhuǎn)換，可視化多基因?qū)Χ嘈g(shù)語的關(guān)系，將不同種類的術(shù)語聚集到組中，搜索相關(guān)基因或術(shù)語，動(dòng)態(tài)查看生物路徑列表中的基因[7］。進(jìn)入DAVID網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/），選擇shortcut to DAVID Tools進(jìn)入Gene ID conversion界面，upload界面輸入奧卡西平基因列表，Select Identifier列表下選擇Official-Gene-Symbol，List Type處選擇Gene List，然后點(diǎn)擊Submit List；List界面中List manager選擇List 1，Use，Species選擇Homo Sapiens，點(diǎn)擊select species；Background界面選擇Homo Sapiens，Use，Successfully submitted gene list；轉(zhuǎn)換成基因類型ENTREZ-GENE-ID（Default），submit to conversion Tool，點(diǎn)擊Download File，結(jié)果保存于文本文檔中，命名為set.txt文件。

1.4 奧卡西平靶基因與癲癇GWAS數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析

基于GWAS數(shù)據(jù)，將全基因組中的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide ploymorphism，SNP）作為分子遺傳標(biāo)記，進(jìn)行全基因組對(duì)照分析或相關(guān)性研究，利用MAGMA軟件將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲得奧卡西平治療癲癇的潛在作用靶點(diǎn)。應(yīng)用基因集分析方法，計(jì)算P值（P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義），證明奧卡西平靶基因在GWAS層面與癲癇致病基因存在關(guān)聯(lián)。

1.5 奧卡西平靶基因與稀有變異癲癇危險(xiǎn)基因的遺傳重疊

為研究奧卡西平靶點(diǎn)與稀有變異的癲癇危險(xiǎn)基因是否存在遺傳重疊，對(duì)稀有變異進(jìn)行了外顯子分析[8］，使用102個(gè)單基因癲癇基因作為已知疾病基因的集合，這些基因來源于1 165例患者和3 877名對(duì)照者的外顯子測(cè)序[9］。以人類全基因組（約20 000個(gè)基因）為背景，進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)，分析奧卡西平靶基因與單基因癲癇基因重疊的意義。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

1.6 奧卡西平靶基因表達(dá)加權(quán)細(xì)胞型富集分析

利用表達(dá)加權(quán)細(xì)胞類型富集（EWCE）方法探索奧卡西平靶基因是否能定位于特定腦細(xì)胞類型，使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，比較輸入基因列表的平均表達(dá)水平與隨機(jī)生成相同大小的每個(gè)細(xì)胞類型基因列表的平均表達(dá)水平。本研究采用Karolinska研究所的大腦scRNA-seq數(shù)據(jù)集（包括9 970個(gè)細(xì)胞），用24種細(xì)胞類型注釋來自小鼠大腦新皮質(zhì)、下丘腦、中腦、海馬和紋狀體以及富含少突膠質(zhì)細(xì)胞、多巴胺能神經(jīng)元的樣本；以及l(fā)innarsson實(shí)驗(yàn)室的另一個(gè)scRNA-seq數(shù)據(jù)集（包括3 005個(gè)細(xì)胞）?？紤]到物種之間差異，應(yīng)用了艾倫腦科學(xué)研究所的另一個(gè)人類單核RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集的結(jié)果，包括人類中顳皮層的4 401個(gè)細(xì)胞。使用小鼠單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)作為背景基因集，將人的奧卡西平靶基因轉(zhuǎn)換成小鼠的基因形式，使用EWCE計(jì)算奧卡西平靶基因在腦細(xì)胞中表達(dá)富集的顯著性，利用ggplot2生成圖形。

1.7 奧卡西平靶向富集途徑分析

為進(jìn)一步了解奧卡西平治療癲癇的潛在靶點(diǎn)基因功能及其在信號(hào)通路中的作用，將奧卡西平靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，將P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的篩選條件，將物種定義為homo sapiens，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析。GO富集選取生物過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 通過DrugBank查找奧卡西平靶基因

共獲取到25種奧卡西平靶基因，主要為鈉離子通道、細(xì)胞色素P450家族成員、醛酮還原酶家族成員、血清白蛋白、羰基還原酶家族成員，見表1。

表1 奧卡西平25種關(guān)鍵靶基因

2.2 利用DAVID數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換靶基因ID

利用DAVID數(shù)據(jù)庫獲取上述25種癲癇靶基因的ID信息，見表2。

表2 奧卡西平25種關(guān)鍵靶基因ID信息表

2.3 奧卡西平靶基因與癲癇GWAS數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)分析

基因集分析顯示，奧卡西平靶基因與癲癇存在關(guān)聯(lián)（P<0.001），其中藥物靶點(diǎn)SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B與癲癇GWAS關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)，見表3。

表3 奧卡西平靶基因與癲癇GWAS關(guān)聯(lián)分析

2.4 奧卡西平靶基因與稀有變異癲癇危險(xiǎn)基因的遺傳重疊

癲癇102個(gè)已知致病基因包括：ADSL、CHRNA2、CSTB、GABRA1、GRIN2B、KCNQ2、NHLRC1、PPT1、SCN9A、STX1B、WWOX、ALDH7A1、CHRNA4、CTSD、GABRB2、HCN1、KCNQ3、NR2F1、PRICKLE1、SIK1、STXBP1、ZEB2、ALG13、CHRNA7、DEPDC5、GABRB3、HNRNPU、KCNT1、NRXN1、 PRICKLE2、 SLC13A5、 SYNGAP1、ARHGEF9、CHRNB2、DNAJC5、GABRG2、IQSEC2、KCTD7、PCDH19、PRRT2、SLC25A22、TBC1D24、ARX、CLN2、DNM1、GAMT、KANSL1、LGI1、PIGA、QARS、SLC2A1、TCF4、ATP1A2、CLN3、DYRK1A、GATM、KCNA2、MAGI2、PIGO、SCARB2、SLC35A2、TPP1、ATP6AP2、CLN5、EEF1A2、GNAO1、KCNB1、MBD5、PIGV、SCN1A、SLC6A1、TSC1、CACNA1A、CLN6、EPM2A、GOSR2、KCNC1、MECP2、PNKP、SCN1B、SLC6A8、TSC2、CDKL5、CLN8、FOLR1、GRIN1、KCNJ10、MEF2C、PNPO、SCN2A、SLC9A6、UBE3A、CHD2、CNTNAP2、FOXG1、GRIN2A、KCNMA1、MFSD8、POLG、SCN8A、SPTAN1、WDR45。

運(yùn)用R語言對(duì)奧卡西平靶基因與102種單基因遺傳性癲癇研究發(fā)現(xiàn)，奧卡西平靶基因與102種單基因遺傳病靶基因重合基因有5種，分別是SCN1A、SCN2A、SCN8A、SCN9A、SCN1B。進(jìn)行Fisher確切檢驗(yàn)，得出P<0.001，證明奧卡西平靶基因與癲癇稀有變異基因存在關(guān)聯(lián)性。

2.5 奧卡西平靶基因EWCE分析

為評(píng)估奧卡西平靶基因集的表達(dá)是否顯著富集于特定腦細(xì)胞類型，通過EWCE進(jìn)行分析。基于Karolinska研究所數(shù)據(jù)集，得出奧卡西平靶基因集主要富集于兩種細(xì)胞類型（P<0.05），包括下丘腦GABA能神經(jīng)元（P=0.035）和中型多棘神經(jīng)元（medium spiny neuron，MSN）（P=0.046）。利用ggplot繪制柱狀圖，見圖1。

圖1 奧卡西平靶基因細(xì)胞型富集

2.6 奧卡西平靶向通路富集途徑分析

通過奧卡西平25個(gè)靶基因的路徑富集分析，GO功能富集分析結(jié)果顯示，BP、MF和CC相關(guān)條目分別為30、18、5條。BP主要涉及突觸后膜電位調(diào)節(jié)、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、動(dòng)作電位膜去極化、神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?、離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的調(diào)節(jié)、鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)的正向調(diào)節(jié)等，見圖2。MF主要包括電壓門控鈉通道活性、電壓門控鈉通道活動(dòng)參與心肌細(xì)胞動(dòng)作電位、鈉通道調(diào)節(jié)劑活性、離子通道活性，見圖3。CC主要集中在電壓門控鈉通道復(fù)合體、郎飛結(jié)、閏盤、Z板、T管，見圖4。KEGG通路富集分析共得到7條信號(hào)通路，主要涉及細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝、類固醇激素生物合成、花生四烯酸代謝、化學(xué)致癌作用、心肌細(xì)胞中的腎上腺素能信號(hào)，見圖5。這些重要途徑表明，奧卡西平靶基因在鈉離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

圖2 奧卡西平靶基因GO-BP富集

圖3 奧卡西平靶基因GO-MF富集

圖4 奧卡西平靶基因GO-CC富集

3 討論

通過DrugBank數(shù)據(jù)庫檢索到25個(gè)奧卡西平潛在靶點(diǎn)，鈉離子通道和細(xì)胞色素P450家族成員最為關(guān)鍵。SCN1A、SCN2A、SCN8A、SCN9A、SCN1B這5種靶基因與102種單基因遺傳病靶基因重合，表明奧卡西平靶基因與癲癇稀有變異基因存在顯著關(guān)聯(lián)。奧卡西平與鈉通道結(jié)合，抑制高頻重復(fù)神經(jīng)元放電，膜去極化激活鈉通道，引起電壓依賴的構(gòu)象變化，增加對(duì)鈉離子通透性，進(jìn)一步使細(xì)胞去極化。膜失活后通道關(guān)閉，對(duì)鈉離子通透性降低，膜電位恢復(fù)靜止?fàn)顟B(tài)[10］。KEGG通路富集分析共得到7條信號(hào)通路，主要涉及細(xì)胞色素P450對(duì)外源物質(zhì)的代謝。奧卡西平是一種窄譜酶誘導(dǎo)劑，影響細(xì)胞色素P450 3A4（CYP3A4）代謝[11］。CYP3A4在肝臟和腸道中含量最高，負(fù)責(zé)藥物及內(nèi)源性底物（如前列腺素、類固醇激素和脂肪酸）的代謝[12］。

基因集分析顯示，奧卡西平靶基因與癲癇顯著相關(guān)，其中與癲癇GWAS關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的藥物靶點(diǎn)是SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B。SCN1A位 于 染 色 體2q24.3[13］，編 碼NAV1.1通道的α亞基，與多種癲癇綜合征相關(guān)，其變異導(dǎo)致的癲癇中Dravet綜合征超過80%[14］。SCN1A突變導(dǎo)致抑制性GABA能中間神經(jīng)元鈉電流顯著減少，減弱GABA能抑制功能，使大腦興奮和抑制失衡，導(dǎo)致癲癇發(fā)作[15］。SCN7A基因編碼一個(gè)非典型鈉通道（Nax），為Na+濃度門控通道。該通道作為血液中Na+水平傳感器，通過改變神經(jīng)元興奮性控制鈉攝取[16］。癲癇發(fā)生過程中，SCN7A在海馬中表達(dá)明顯上調(diào)，其機(jī)制尚未完全闡明[17］。SCN9A在染色體2q24.3上有27個(gè)外顯子，編碼電壓門控鈉通道Nav1.7的α亞基，表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞[18］。Nav1.7在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，文獻(xiàn)報(bào)道了其在大腦中（特別是胚胎海馬體）表達(dá)；SCN9A基因突變導(dǎo)致Nav1.7通道中補(bǔ)體相關(guān)蛋白或二級(jí)信使變化，從而導(dǎo)致興奮閾值降低，重復(fù)放電增加，大腦鈉通道功能改變，神經(jīng)元之間連接受阻，導(dǎo)致癲癇發(fā)作[19］。SCN10A編碼電壓門控鈉通道Nav1.8的α亞基，NaV1.8鈉通道選擇性表達(dá)于初級(jí)感覺神經(jīng)元，如背根神經(jīng)節(jié)、三叉神經(jīng)節(jié)和結(jié)狀神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，因此被稱為特異性感覺神經(jīng)元[20］。在小鼠神經(jīng)元中，電流鉗記錄顯示長時(shí)程動(dòng)作電位的神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)，表明SCN10A在調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元活動(dòng)中發(fā)揮作用[21］。NaV1.8是電壓門控鈉通道，從失活狀態(tài)快速恢復(fù)，在背根神經(jīng)節(jié)和外周神經(jīng)軸突的無髓感覺神經(jīng)元中重復(fù)放電[22］。目前尚不明確Nav1.8疾病突變?nèi)绾握T導(dǎo)感覺神經(jīng)元過度興奮[23］。SCN11A定位于人類3號(hào)染色體（3p21-24），編碼鈉通道Nav1.9a/NaN，在背根神經(jīng)節(jié)和三叉神經(jīng)節(jié)的傷害性初級(jí)感覺神經(jīng)元中優(yōu)先表達(dá)[24］。炎癥介質(zhì)通過G蛋白偶聯(lián)途徑使持續(xù)鈉電流介導(dǎo)的NaV1.9幅度增加，NaV1.9通過延長閾下刺激的去極化效應(yīng)調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性[25］。SCN3B突變使NaV1.5的胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能受損，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表面NaV1.5的表達(dá)降低。NaV1.5在小膠質(zhì)細(xì)胞生理過程中發(fā)揮核心作用，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞，參與神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對(duì)癲癇的發(fā)生有重要作用[26］。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的全細(xì)胞膜片鉗記錄顯示，SCN3B突變顯著降低了鈉電流[27］。在無海馬硬化的顳葉癲癇患者中，SCN3B基因產(chǎn)物Navβ3表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而影響海馬區(qū)的微電路，影響興奮性，導(dǎo)致癲癇發(fā)生[28］。

通過單細(xì)胞測(cè)序及EWCE方法，得出奧卡西平主要富集于下丘腦GABA能神經(jīng)元和MSN。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，GABA受體在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中均有表達(dá)[29］。GABA能系統(tǒng)是腦內(nèi)神經(jīng)元興奮性的主要抑制因子，突變會(huì)干擾GABA受體的離子通道運(yùn)輸特性。GABA與GABA受體結(jié)合導(dǎo)致通道開放，允許氯離子流入，突觸后膜超極化，導(dǎo)致神經(jīng)元電活動(dòng)的快速抑制，奧卡西平通過增加GABA受體表達(dá)發(fā)揮作用[30］。在大腦發(fā)育過程中，胎兒端腦的外側(cè)神經(jīng)節(jié)隆起形成紋狀體神經(jīng)元。GABA能MSN是紋狀體的主要神經(jīng)元類型，約占90%以上，是以多巴胺和谷氨酸能輸入為主的投射神經(jīng)元。紋狀體的多巴胺能輸入來自黑質(zhì)致密部，谷氨酸能輸入來自皮質(zhì)和丘腦等區(qū)域[31］。MSN樹突營養(yǎng)不良破壞了突觸通信的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過延伸的皮質(zhì)紋狀體通路中斷信號(hào)。鑒于多巴胺和谷氨酸輸入共同到達(dá)一個(gè)MSN脊椎，需要完全了解這些遞質(zhì)及其下游信號(hào)靶點(diǎn)的同源受體的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，才能顯著提高治療癲癇的效果[32］。

綜上，本研究通過多組學(xué)數(shù)據(jù)的整合分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)奧卡西平藥物靶點(diǎn)共25種，與癲癇致病基因存在關(guān)聯(lián)性，其中藥物靶點(diǎn)SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B與癲癇GWAS關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)。奧卡西平可能通過作用于下丘腦GABA能神經(jīng)元、中型多棘神經(jīng)元中的鈉離子通道基因發(fā)揮抗癇作用。本研究為進(jìn)一步明確奧卡西平抗癇作用機(jī)制及其臨床用藥的有效性和安全性提供了理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突