液相芯片技術(shù)在東莞市腹瀉病原體檢測中的應(yīng)用

李艷芬 葉雪儀 陳永迪 張莉萍 黃勇 劉璇

腹瀉是全球公共衛(wèi)生問題,造成嚴(yán)重的疾病負(fù)擔(dān),每年約有200 萬人因?yàn)楦篂a而死亡［1］。感染性腹瀉的主要病因?yàn)榧?xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等病原微生物［2］。由于臨床上難以區(qū)分致病病原體,實(shí)驗(yàn)室的傳統(tǒng)診斷方法,如培養(yǎng)、顯微鏡檢測、免疫診斷等方法,靈敏度低且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,而且一般無法覆蓋較多的病原體,可能出現(xiàn)花費(fèi)了大量時(shí)間卻沒有找到致病原因的情況。因此,了解感染性腹瀉病原譜情況,提高病原體的檢測速度與能力,是控制和降低腹瀉在本地區(qū)居民中發(fā)生和流行的重要基礎(chǔ)。近年來高通量多重檢測病原體分子診斷方法受到極大關(guān)注,其中的液相芯片技術(shù)為腸道感染病原調(diào)查提供了強(qiáng)有力的手段［3］。Luminex 公司生產(chǎn)的腹瀉病原檢測試劑盒(xTAG,GPP)可在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲等15 種腹瀉病原體［1,3］。該技術(shù)與常規(guī)傳染病病原體檢測方法比較,高通量、高速度、多重檢測的優(yōu)勢尤為明顯［4］。本文采用液相芯片技術(shù),于2019 年1 月～2021 年4 月檢測了251 例腹瀉病例標(biāo)本,以了解近年來東莞地區(qū)腹瀉病原種類及分布情況,為臨床實(shí)驗(yàn)室選擇該地區(qū)病原體檢測種類以及醫(yī)生實(shí)施針對性治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2019 年1 月～2021 年4 月東莞市東華醫(yī)院門診腹瀉患者251 例。樣本選取參照腹瀉判定標(biāo)準(zhǔn)：大便次數(shù)≥3 次/d,且大便性狀有改變(呈稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等)。其中,男154 例(61.4%),女97 例(38.6%)；年齡1 個(gè)月～83 歲,中位年齡1 歲。

1.2 儀器與試劑 儀器：西安天隆NP968 提取儀、ABI ProFlex PCR 擴(kuò)增儀、Luminex MAGPIX 液相懸浮芯片檢測儀。試劑：上海伯杰核酸提取及純化試劑,美國Luminex GPP 試劑盒。

1.3 標(biāo)本采集和處理 腹瀉患者留取糞便,-80℃分裝保存。取約2 g 標(biāo)本加入離心管中,每管加入1 ml 完全PBS、10 μl MS2、100 μl 氯仿和2 g 玻璃珠機(jī)械震蕩器劇烈震蕩20 min,4℃,3000 r/min 離心30 min,吸取200 μl 上清用于核酸提取。

1.4 核酸擴(kuò)增和病原體檢測方法 根據(jù)試劑說明書進(jìn)行,第一步PCR 擴(kuò)增體系25 μl,擴(kuò)增程序?yàn)椋?3℃逆轉(zhuǎn)錄20 min,95℃變性15 min,38 次循環(huán)(95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s),最后72℃延長20 min。第二步雜交：依次加入20 μl xTAG GPP Bead MiX、5 μl PCR產(chǎn)物和75 μl SA-PE reporter solution 混勻,65℃ 30 min和45℃ 45 min 雜交。液相懸浮芯片儀進(jìn)行檢測,檢測到內(nèi)標(biāo)MS2 和陰性對照成立表示檢測結(jié)果有效。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腹瀉病原體檢出情況 共檢出94 例陽性病例(13 種病原體),其中,細(xì)菌54 例(7 種病原體,檢出率為21.51%、54/251),分別為沙門菌、艱難梭菌毒素A/B型、空腸彎曲菌、腸毒素性大腸埃希菌 (ETEC) LT/ST 型、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌(STEC)stx1/stx2 型、大腸埃希菌O157 型、霍亂弧菌。志賀菌和小腸結(jié)腸炎耶爾森菌未檢出。檢出最多的3 種細(xì)菌為：沙門菌(13.94%、35/251)、艱難梭菌毒素A/B(7.97%、20/251)和空腸彎曲菌(3.98%、10/251)。病毒52 例(3 種病原體,檢出率為20.72%、52/251),分別為輪狀病毒A 型(13.15%、33/251)、諾如病毒GⅡ型(8.37%、21/251)和GⅠ型(3.59%、9/251)、腺病毒40/41 型(1.20%、3/251)。寄生蟲16 例(3 種病原體,檢出率為6.37%、16/251),分別為隱孢子蟲(5.18%、13/251)、賈第鞭毛蟲(1.60%、4/251)和痢疾阿米巴(0.40%、1/251)。

2.2 混合感染情況 94 例(37.45%、94/251)陽性病例中,至少檢出1 種病原體。其中,單一感染61 例(64.89%、61/94),同時(shí)檢出2 種病原體19 例(20.21%、19/94),同時(shí)檢出3 種病原體6 例(6.38%、6/94),同時(shí)檢出4 種以上病原體8 例(8.51%、8/94)?；旌细腥镜?3 例分別為：細(xì)菌多重感染7 例(7.45%、7/94),病毒多重感染7 例(7.45%、7/94),寄生蟲多重感染1 例(1.06%、1/94),細(xì)菌合并病毒感染6 例(6.38%、6/94),細(xì)菌合并寄生蟲感染2 例(2.13%、2/94),病毒合并寄生蟲感染2 例(2.13%、2/94),細(xì)菌病毒寄生蟲混合感染8 例(8.51%、8/94)。33 例混合感染的病原體檢出情況,見表1。

表1 33 例混合感染的病原體檢出情況(n,%)

2.3 病原體季節(jié)分布 根據(jù)廣東的氣候特征,各季節(jié)的檢出率分別為：春季44.90%(22/49),夏季22.39%(15/67),秋季41.67%(25/60),冬季42.67%(32/75)。不同季節(jié)的病原體檢出率比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.976,P<0.05),全年以夏季的檢出率最低。全年沙門菌(35 例)、輪狀病毒A 型(33 例)和諾如病毒GⅡ(21 例)/GⅠ型(9 例)最常見。沙門菌全年均可檢出,感染高峰期在春-夏-秋季(3～11 月)；輪狀病毒A 型感染高峰期為冬-春季(12～次年3 月),夏天沒有檢出；諾如病毒GⅡ型和GⅠ型感染全年均可檢出,高峰期為秋-冬季(9～次年2 月)。見表2。

表2 不同季節(jié)病原體檢出結(jié)果

2.4 年齡特異的病原體分布 年齡特異分為嬰兒(<1 歲),幼兒(1～3 歲),兒童(4～17 歲),成人(≥18 歲)。沙門菌、輪狀病毒A 型、艱難梭菌毒素A/B 型嬰幼兒最常見。見表3。

表3 年齡特異的病原體檢出結(jié)果(n,%)

3 討論

采用液相芯片技術(shù)可同時(shí)檢測的腹瀉病原體多達(dá)15 種,可同時(shí)檢測空腸彎曲菌、沙門菌、艱難梭菌毒素A/B 型、腸毒性大腸埃希菌LT/ST 型、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希菌stx1/stx2、大腸埃希菌O157 型、志賀菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、霍亂弧菌、諾如病毒GⅡ/GⅠ型、輪狀病毒A 型、腺病毒40/41 型、隱孢子蟲、賈第鞭毛蟲、痢疾阿米巴,整個(gè)實(shí)驗(yàn)大概用時(shí)6 h。同時(shí)檢測15 種病原體,為病原譜調(diào)查提供了豐富信息,為患者的臨床治療和流行病學(xué)監(jiān)測提供了更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。

本研究對251 例腹瀉患者進(jìn)行多重病原體檢測,共檢出94 例陽性13 種病原體,陽性率為37.45%,與其他地區(qū)情況差別不大［5,6］。細(xì)菌性病原中檢出率最高的是沙門菌,該結(jié)論與國內(nèi)部分研究結(jié)論吻合,提示夏季需要重點(diǎn)關(guān)注食品衛(wèi)生問題,特別是沙門菌污染的食物外觀沒有明顯的改變［7］。有研究顯示,細(xì)菌性腹瀉的主要病原體已由過去的志賀菌變成沙門菌和副溶血性弧菌［8］,原因可能是隨著社會(huì)的發(fā)展,人們生活水平提高,飲食習(xí)慣改變,蛋、肉類食物占比增多。有報(bào)道顯示,在沙門菌感染的病例中,超過80%的患兒年齡<1 歲［9］,而本研究結(jié)果顯示,1～3 歲兒童是易感人群,沙門菌陽性病例中該人群陽性率最高48.57%(17/35),1 歲以下嬰兒次之,陽性率為45.71%(16/35)。沙門菌感染季節(jié)性明顯,因此,夏季的腹瀉聚集性疫情查因可以重點(diǎn)考慮檢測沙門菌。

病毒性病原體中,輪狀病毒A 型和諾如病毒GⅡ型和GⅠ型是引起我市感染性腹瀉的主要原因,該結(jié)果與珠三角的情況相似［6］。其中輪狀病毒A 型引起的輪狀病毒腸炎是嬰幼兒腹瀉最常見的病因［9］,因輪狀病毒的強(qiáng)致病性,又沒有特效藥,因此推廣輪狀病毒疫苗是目前最經(jīng)濟(jì)和有效的控制感染措施。本研究結(jié)果顯示,輪狀病毒A 型感染主要發(fā)生在3 歲以下兒童,87.88%(29/33)的感染發(fā)生在0～3 歲嬰幼兒。輪狀病毒A 型感染具有明顯的時(shí)間分布特征,冬春季高發(fā)。

諾如病毒感染全年可見,秋季檢出率最高,為24.1%。目前最常見的諾如病毒感染為諾如病毒GⅡ型和GⅠ型。本研究結(jié)果顯示,諾如病毒感染主要以GⅡ型為主,偶爾發(fā)生GⅠ、GⅡ型混合感染。混合感染是否會(huì)導(dǎo)致腹瀉或嘔吐癥狀加劇尚待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn),94 例陽性病例中35.11%受到混合感染。過去由于檢測方法的限制,不容易發(fā)現(xiàn)混合感染的情況。本研究發(fā)現(xiàn)多種共同感染的情況,從19 例雙病原體感染的結(jié)果看,沒有發(fā)現(xiàn)比例很高的固定組合,出現(xiàn)最多的組合為沙門菌+艱難梭菌毒素A/B 型3 例(15.79%、3/19),其次是輪狀病毒A 型+諾如病毒GⅠ型2 例(10.53%、2/19)。3 重感染的病原體組合均不相同,沒發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢組合。有報(bào)道提出艱難梭菌毒素與另外的病原體一同被檢出的情況下,不一定是真正意義的混合感染。艱難梭菌毒素被認(rèn)為是人類腸道的正常菌群,若產(chǎn)毒素艱難梭菌由于抗菌藥物使用不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е逻^度繁殖,引起腹瀉的發(fā)生［10］。葉鴻雁等［11］研究顯示混合感染患兒的臨床癥狀多于單一感染群體。腹瀉重癥患者是否與共同感染有關(guān)有待進(jìn)一步的研究。

近年來,腹瀉引起的暴發(fā)疫情不斷出現(xiàn),病原體種類繁多,并且每年的流行種類和周期也不斷變化。液相芯片技術(shù)經(jīng)研究與常規(guī)方法符合度高,總體的靈敏度和特異性分別>94%和98%,時(shí)間上明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法,有利于應(yīng)急事件的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療［12］。液相芯片技術(shù)既可以使用已發(fā)售的商品化試劑,也可按照不同需求進(jìn)行自行定制。根據(jù)本地區(qū)出現(xiàn)的腹瀉疫情病原體情況,接下來可設(shè)計(jì)副溶血性弧菌、扎如病毒等更多病原體加入到腹瀉多重試劑盒,便于今后快速篩查工作全覆蓋。