FLT3-ITD等多種基因突變?cè)l(fā)性急性髓系白血病伴BCR-ABL1患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果分析

陳月梅，金詠梅，曾婷婷，蔣能剛，廖紅艷

（四川大學(xué)華西醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610041）

急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）是一組起源于造血前體細(xì)胞的惡性克隆性疾病，由基因突變導(dǎo)致的細(xì)胞增殖、分化及凋亡途徑異常是AML的發(fā)病基礎(chǔ)。費(fèi)城染色體（Philadelphia chromosome，Ph）是9號(hào)和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂易位，使9號(hào)染色體上的原癌基因ABL和22號(hào)染色體上的BCR基因組合成BCRABL1融合基因，是慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelognous leukemia，CML）的重要標(biāo)志；約20%的急性淋巴細(xì)胞白血病（acute lymphocytic leukemia，ALL）患者體內(nèi)存在Ph。BCR-ABL1陽(yáng)性的原發(fā)AML發(fā)病率極低，在AML中僅占0.9%～3.0%[1-2]，在BCR-ABL1陽(yáng)性的急、慢性白血病中所占比例＜1%[3-4]。在世界衛(wèi)生組織2016分類(lèi)中，AML伴BCR-ABL1被暫定為1個(gè)獨(dú)立亞型。其預(yù)后極差，患者平均生存期僅9個(gè)月[4]，大多數(shù)患者常規(guī)治療無(wú)法完全緩解，或緩解后復(fù)發(fā)概率很大。

基因突變是造成FLT3基因異?；罨闹饕?，其突變形式主要表現(xiàn)為近膜結(jié)構(gòu)域內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)（internal tandem duplication，ITD）突變和酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（tyrosine kinase domain，TKD）的點(diǎn)突變2種，F(xiàn)LT-ITD是FLT3突變的主要形式[5]。20%的AML患者會(huì)發(fā)生 FLT3-ITD基因突變，其預(yù)后不良，在治療緩解后應(yīng)盡快進(jìn)行骨髓移植[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，AML伴FLT-ITD、DNMT3A、RUNX1等多種基因同時(shí)突變患者的完全緩解率更低[7]。本研究對(duì)1例BCR-ABL1伴FLT3-ITD和多種基因錯(cuò)義突變的原發(fā)性AML患者的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果和臨床特征進(jìn)行分析，以加強(qiáng)檢驗(yàn)人員對(duì)這種罕見(jiàn)的AML亞型病例的認(rèn)識(shí)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

患者，男，52歲，因“舌體麻木5 d”入院，患者自述舌頭麻木、進(jìn)食無(wú)味、乏力漸加重、全身肌肉酸痛。無(wú)既往血液病病史，門(mén)診實(shí)驗(yàn)室檢查示：白細(xì)胞計(jì)數(shù)81.13×109/L，血紅蛋白81 g/L，血小板計(jì)數(shù)21×109/L，凝血酶原時(shí)間14.5 s，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值1.33，纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物5.4 mg/L，乳酸脫氫酶476 IU/L，糞常規(guī)正常。予以補(bǔ)液、羥基脲片1.0 g tid降白細(xì)胞等治療。為進(jìn)一步治療收入院。入院查體：體溫37.7 ℃，心率96次/min，呼吸頻率20次/min，血壓14.36/8.38 kPa；實(shí)驗(yàn)室檢查示白蛋白 35.4 g/L，γ-谷氨?；D(zhuǎn)移酶58 IU/L，乳酸脫氫酶432 IU/L，血紅蛋白68 g/L，血小板計(jì)數(shù)15×109/L，白細(xì)胞計(jì)數(shù)86.35×109/L，中性分葉核粒細(xì)胞絕對(duì)值1.73×109/L，原始細(xì)胞百分比95.0%。于2019年6月10日行骨髓穿刺和活檢術(shù)染色體核型分析。

1.2 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查

骨髓涂片經(jīng)瑞氏-吉姆薩染色，在光學(xué)低倍鏡下觀察骨髓增生程度并計(jì)數(shù)全片巨核細(xì)胞，在油鏡下分布均勻處計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞，分析各階段細(xì)胞形態(tài)和比例，并行組化染色觀察原始細(xì)胞。

1.3 流式細(xì)胞免疫表型分析

取患者骨髓細(xì)胞，稀釋至細(xì)胞濃度為10×109～20×109/L，采用單克隆抗體對(duì)髓系、干/祖細(xì)胞系、B淋巴細(xì)胞系、T淋巴細(xì)胞系抗原進(jìn)行免疫標(biāo)記，所有抗體（表1）和細(xì)胞質(zhì)抗原檢測(cè)所需破膜劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司。采用FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)50 000個(gè)細(xì)胞。

表2 AML四色熒光方案兩步法檢測(cè)方案

1.4 細(xì)胞遺傳學(xué)分析

取患者肝素抗凝的骨髓細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后收集有絲分裂中期分裂相細(xì)胞，按常規(guī)方法制備染色體后，用G帶方法進(jìn)行顯帶，每例樣本觀察50個(gè)中期細(xì)胞，根據(jù)人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制的方法進(jìn)行核型描述。

1.5 分子生物學(xué)檢查

取患者骨髓并分離單個(gè)核細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR）進(jìn)行BCR-ABL1融合基因的測(cè)定，試劑盒購(gòu)自上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司，檢測(cè)儀器為ABI 7500熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），嚴(yán)格按儀器和試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，并同時(shí)進(jìn)行內(nèi)參基因ABL拷貝數(shù)的定量檢測(cè)。以BCR-ABL1/ABL拷貝數(shù)×100%表示BCR-ABL1融合基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果

骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果示：骨髓有核細(xì)胞增生明顯活躍，原始粒細(xì)胞占93.5%，胞體大小不等，呈圓形、類(lèi)圓形，胞核圓形、類(lèi)圓形或扭曲，部分有切跡；部分可見(jiàn)小顆粒，呈急性白血病骨髓象，形態(tài)學(xué)考慮AML未成熟型。骨髓細(xì)胞過(guò)氧化物酶染色結(jié)果示髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）陽(yáng)性0.06（圖1）。

圖1 骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果（×1 000）

2.2 流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析結(jié)果

骨髓流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析結(jié)果示：原始細(xì)胞占有核細(xì)胞的95.9%，表達(dá)CD34（部分陽(yáng)性）、HLA-DR、CD117、CD64（部分陽(yáng)性）、CD13（部分陽(yáng)性）、CD33（部分陽(yáng)性）、cMPO（少數(shù)陽(yáng)性），不表達(dá)CD14、CD36、CD19、cCD79a、CD56、CD5、CD7、cCD3（圖2），考慮AML未成熟型。外周血流式細(xì)胞術(shù)分析示：原始細(xì)胞約占60%，表型與骨髓相似，考慮AML。

圖2 骨髓流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析

2.3 染色體核型分析結(jié)果

染色體核型分析結(jié)果示：46，XY，t（9；22）。見(jiàn)圖3。

圖3 染色體核型分析結(jié)果

2.4 基因檢測(cè)結(jié)果

基因檢測(cè)結(jié)果示：白血病融合基因檢測(cè)BCR-ABL1陽(yáng)性（P210型），相對(duì)表達(dá)量為122.98。AML高頻突變基因篩查示：FLT3-ITD陽(yáng)性，DNMT3A、BCOR、IDH2、BCORL1、RUNX1基因均檢測(cè)到錯(cuò)義突變。

2.5 治療及預(yù)后

患者入院后給予口服羥基脲降白細(xì)胞，伊馬替尼+地西他濱10 mg靜滴+（高三尖杉酯堿注射液1 mg靜滴+鹽酸阿糖胞苷50 mg靜滴）方案化療?；颊呤状位熀?，形態(tài)學(xué)分類(lèi)檢查示原始粒細(xì)胞1.5%，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示殘留異常表型原始粒細(xì)胞約占0.68%，BCR-ABL1融合基因相對(duì)表達(dá)量為0.098。鞏固化療1個(gè)療程后，2019年9月于外院行同胞全相合造血干細(xì)胞移植。2021年5月門(mén)診隨訪，一般狀況良好，細(xì)胞形態(tài)完全緩解，流式細(xì)胞術(shù)及基因檢測(cè)無(wú)微小殘留疾病。

3 討論

AML伴BCR-ABL1發(fā)病率低，但患者預(yù)后不良，中位生存期短[1]。由于BCR-ABL1融合基因最常出現(xiàn)在CML和ALL中，在骨髓增生異常綜合征中亦可出現(xiàn)，因此確診需與這些疾病進(jìn)行鑒別診斷。本病例確診前的歷史檢查結(jié)果示無(wú)明確血液病史，無(wú)外周血三系異常表現(xiàn)，無(wú)嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞增多，截至發(fā)病時(shí)無(wú)明顯肝脾腫大，原發(fā)AML伴BCR-ABL1的診斷可以明確。據(jù)報(bào)道，AML伴BCR-ABL1在所有AML中的所占比例極低[1]。目前，全球范圍內(nèi)對(duì)該亞型的病例報(bào)道不足200例，且絕大多數(shù)患者的實(shí)驗(yàn)室和臨床資料不全，對(duì)患者發(fā)病中位年齡、性別、偏好、臨床表現(xiàn)等描述也不一致，我國(guó)的文獻(xiàn)不足10例[8-9]。與以往文獻(xiàn)報(bào)道的病例不同，本病例同時(shí)伴FLT3-ITD及其他多種常見(jiàn)髓系突變基因突變。因此，本病例的報(bào)道能夠幫助臨床更全面地認(rèn)識(shí)AML伴BCR-ABL1亞型。

AML的診斷依賴(lài)于形態(tài)學(xué)、免疫分型、分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)的綜合判斷。AML伴BCR-ABL1的患者骨髓或外周血形態(tài)與其他AML相比不具有明顯可鑒別的特征。骨髓一般增生活躍或極度活躍，患者骨髓或外周血中的腫瘤細(xì)胞可呈現(xiàn)典型的原始髓細(xì)胞特征，亦可表現(xiàn)出向成熟階段分化的趨勢(shì)。在與CML急變期的鑒別中，AML伴BCR-ABL1通常骨髓細(xì)胞密度較低。流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析可為AML的診斷提供強(qiáng)有力的證據(jù)。有研究發(fā)現(xiàn)，AML伴BCRABL1原始細(xì)胞可表達(dá)單純髓系抗原（CD13、CD33等），也可交叉表達(dá)淋系抗原（CD7、CD19和TdT等）。此時(shí)，需與急性混合細(xì)胞白血病伴BCR-ABL1亞型進(jìn)行鑒別診斷[1，4]。本病例未見(jiàn)明顯跨系抗原的表達(dá)。由于FLT3-ITD突變會(huì)影響骨髓造血細(xì)胞的增殖、分化，抑制細(xì)胞凋亡，患者原始粒細(xì)胞表型出現(xiàn)特定改變。本例患者原始細(xì)胞CD34呈部分陽(yáng)性，符合文獻(xiàn)報(bào)道的FLT3-ITD突變的AML患者原始細(xì)胞造血干/祖細(xì)胞抗原CD34和CD117的表達(dá)降低的特征[10]。常見(jiàn)的AML相關(guān)基因突變，如NPM1、FLT3-ITD，在AML伴BCR-ABL1亞型中有報(bào)道，但在CML急變期患者中一般不會(huì)發(fā)生[3]。因此，若有該類(lèi)基因的突變，可輔助鑒別診斷原發(fā)AML伴BCR-ABL1和CML急變期。本病例FLT3-ITD、DNMT3A、BCOR、IDH2、BCORL1、RUNX1均檢測(cè)到突變，為原發(fā)AML的診斷提供了更有力的證據(jù)。

AML伴BCR-ABL1患者總體來(lái)說(shuō)預(yù)后差、緩解率低、生存期短，目前尚無(wú)統(tǒng)一的治療方案[11]。傳統(tǒng)的AML療法或單純酪氨酸酶抑制劑對(duì)AML伴BCR-ABL1療效不理想。一線治療方案以及化療失敗患者一般使用伊馬替尼進(jìn)行挽救性治療[12]。本例患者采用伊馬替尼+阿糖胞苷方案，首個(gè)療程化療后能夠達(dá)到形態(tài)學(xué)緩解，但流式細(xì)胞術(shù)和基因檢測(cè)均有微小殘留疾病，第2個(gè)療程后殘留陰性，移植后1.5年一般狀況良好，無(wú)復(fù)發(fā)，與文獻(xiàn)報(bào)道[13-14]一致，提示及早進(jìn)行異體基因造血干細(xì)胞移植可能有利于其臨床療效和預(yù)后，是改善預(yù)后、實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期無(wú)復(fù)發(fā)生存的有效途徑。