IL-8/miR-182正反饋調(diào)控軸在非小細胞肺癌中的作用機制研究

趙明娜，張宸梓，洪秋雙，婁加陶

（1.上海交通大學醫(yī)學院附屬第一人民醫(yī)院檢驗醫(yī)學中心，上海 200080；2.中南大學湘雅醫(yī)院血液科，湖南 長沙 410008；3.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗實驗醫(yī)學中心，上海 200437）

肺癌是我國發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一，也是國際上癌癥相關(guān)死亡的首要原因，患者5年生存率較低[1]。因此，探索肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，對提高肺癌的早期診斷率，精確分型分期，以及預(yù)測復發(fā)和預(yù)后具有重要意義[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類大小約為22 nt的非編碼小分子RNA，通常與靶基因mRNA 3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）結(jié)合，通過降解mRNA或抑制其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控靶基因表達[3]。許多癌基因、抑癌基因和一系列與細胞周期、細胞凋亡、細胞遷移、血管生成相關(guān)的基因都受到miRNA的調(diào)控[4]。另外，炎癥因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用。炎癥因子刺激可以調(diào)節(jié)特定的致癌miRNA或抑癌miRNA的表達，影響miRNA靶基因的翻譯，導致靶基因表達發(fā)生變化，而這些靶基因表達的變化可以促進或抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5]。白細胞介素-8（interleukin-8，IL-8）是一種促炎性CXC趨化因子，主要受NF-κB信號通路調(diào)控。有研究結(jié)果顯示，IL-8的過度表達與多種腫瘤有關(guān)，其參與了血管生成和內(nèi)皮細胞遷移，進而導致腫瘤進展[6]。miR-182-5p是miR-183/96/182簇中的一員，是一種新型的腫瘤相關(guān)miRNA，參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與非小細胞肺癌（nonsmall cell lung cancer，NSCLC）的發(fā)生密切相關(guān)[7]。但IL-8和miR-182在NSCLC中是否相互作用，并影響NSCLC的發(fā)展，仍有待進一步研究。為此，本研究擬探討IL-8和miR-182在NSCLC發(fā)展中可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2011年7月—2016年6月上海市胸科醫(yī)院確診為NSCLC的40例患者（NSCLC組），其中男28例、女12例，年齡43～71歲。所有患者均為初診，術(shù)前均未接受治療。收集所有患者術(shù)前血清樣本和術(shù)中切除的癌組織及癌旁組織（距癌灶組織＞5 cm、外觀正常）樣本。另選取上海市胸科醫(yī)院體檢健康者40名（正常對照組），其中男21名、女19名，年齡40～56歲，收集其血清樣本。本研究經(jīng)上海市胸科醫(yī)院倫理委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2 細胞來源和培養(yǎng)

人NSCLC細胞株A549購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC），采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染與刺激

1.3.1 細胞轉(zhuǎn)染 根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進行分組，包括STAT3-siRNA質(zhì)粒（STAT3-siRNA組）、陰性對照siRNA質(zhì)粒（NC-siRNA組）、miR-182模擬物質(zhì)粒（miR-182 mimic組，過表達miR-182）、miR-182抑制劑質(zhì)粒（miR-182 inhibitor組，抑制miR-182表達）、陰性對照質(zhì)粒（mimic NC組、inhibitor NC組），所有質(zhì)粒均購自廣州銳博生物科技有限公司。待細胞融合度為70%～80%時，參照Lipofectamine 2000（美國Invitrogen公司）試劑說明書分別將miR-182 mimic、mimic NC、miR-182 inhibitor、inhibitor NC、STAT3-siRNA或NC-siRNA分別轉(zhuǎn)染至A549細胞，然后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于24、48 h后提取RNA和蛋白，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）檢測miR-182的相對表達量，采用免疫印跡法檢測STAT3蛋白的表達量，確定轉(zhuǎn)染效率。

1.3.2 IL-8刺激 將A549細胞鋪板融合至50%左右或轉(zhuǎn)染miR-182 inhibitor 6 h后，換成無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入10 ng/mL IL-8（蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）或磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）（對照組），于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞，提取RNA和蛋白，用于后續(xù)實驗。

1.3.3 IL-8受體抑制劑Repertaxin和NF-κB信號通路抑制劑BAY11-7082刺激 Repertaxin和BAY11-7082均購自美國MedChemExpress公司。A549細胞轉(zhuǎn)染或用IL-8刺激后，在收取細胞前12 h，加入20 μmol/L Repertaxin或50 μmol/L BAY11-7082，12 h后收集細胞，提取RNA和蛋白，用于后續(xù)實驗。

1.4 RT-qPCR檢測miR-182和IL-8的相對表達量

采用TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）提取細胞總RNA，測定RNA濃度。使用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]逆轉(zhuǎn)錄成互補DNA（complementary DNA，cDNA）。以1 μL cDNA為模板，進行RT-qPCR，試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。miR-182逆轉(zhuǎn)錄引物為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGTGTGAG-3'，前向引物為5'-ACACTCCAGCTGGGTTTGGCAATGGTAGAACT-3'。通用反向引物為5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3'。U6上游引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。IL-8上游引物為5'-CTGGCCGTGGCTCTCTTG-3'，下游引物為5'-CCTTGGCAAAACTGCACCTT-3'。β-actin上游引物為5'-ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG-3'，下游引物為5'-CTGCTTGCTGATCCACATCTG-3'。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)置3個復孔，采用2-△△Ct法進行相對定量。檢測儀器為ABI 7900實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.5 免疫印跡法檢測蛋白相對表達量

收集A549細胞和轉(zhuǎn)染miR-182 mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC、STAT3-siRNA或NC-siRNA的A549細胞，使用裂解液提取細胞總蛋白，加入2×loading蛋白上樣緩沖液，95 ℃ 加熱5 min，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，2%牛血清白蛋白封閉2 h，加入一抗[信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）蛋白兔單克隆抗體、Phospho-NF-κB p65蛋白兔單克隆抗體（簡稱P-p65抗體）、NF-κB p65蛋白兔單克隆抗體（簡稱p65抗體），美國CST公司]和內(nèi)參抗體β-連環(huán)蛋白1（beta-catenin 1，CTNNB1）兔單克隆抗體（美國CST公司）4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Sigma公司）室溫孵育1 h，采用化學發(fā)光法檢測蛋白表達。

1.6 細胞增殖實驗

采用溴化噻唑藍四氮唑（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）法檢測細胞增殖能力。分別將轉(zhuǎn)染miR-182mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC質(zhì)粒的A549細胞和PBS刺激（對照組）、10 ng/mL IL-8刺激（IL-8組）、轉(zhuǎn)染miR-182 inhibitor質(zhì)粒并加入10 ng/mL IL-8刺激（IL-8+miR-182 inhibitor組）的A549細胞，按5 000個/孔鋪在12孔板中，貼壁后，在培養(yǎng)液中加入5 mg/mL MTT[生工生物工程（上海）股份有限公司]，培養(yǎng)2 h，移去培養(yǎng)液，加入200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），37 ℃ 孵育30 min，檢測570 nm處的吸光度（A）值，以第1天為0點，每隔24 h檢測1次，共計4 d。繪制生長曲線。

1.7 細胞遷移試驗

分別收集轉(zhuǎn)染miR-182mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC、inhibitor NC質(zhì)粒的A549細胞和PBS刺激（對照組）、10 ng/mL IL-8刺激（IL-8組）、轉(zhuǎn)染miR-182 inhibitor質(zhì)料并加入10 ng/mL IL-8刺激（IL-8+miR-182 inhibitor組）的A549細胞，用不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種于Transwell 小室的上室（2×104個/小室），在下室中加入500 μL含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用棉簽輕輕擦去小室內(nèi)未遷移的細胞，遷移到小室下表面的細胞用4%多聚甲醛4 ℃固定5 min，PBS洗滌后，用0.1%結(jié)晶紫溶液室溫染色5 min，PBS充分洗滌后，采用BX53型正置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）觀察、拍照并計數(shù)。

1.8 免疫熒光試驗

收集轉(zhuǎn)染miR-182 mimic、miR-182 inhibitor、mimic NC質(zhì)粒的A549細胞和轉(zhuǎn)染miR-182 mimic質(zhì)粒并加入50 μmol/L BAY11-7082處理的A549細胞，采用4%多聚甲醛固定30 min，2%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入一抗（P-p65抗體、p65抗體，1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜，加入二抗[山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 488），1∶1 000稀釋]，室溫避光孵育1 h，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5 min，采用BX53型正置熒光顯微鏡觀察蛋白的表達和定位，拍照并計數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。所有實驗均獨立重復3次。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組與正常對照組血清IL-8水平比較

NSCLC組血清IL-8水平[34.50（24.50～45.75）pg/mL]顯著高于正常對照組[11.00（8.00～15.75）pg/mL]（P＜0.01）。

2.2 NSCLC患者癌組織與癌旁組織miR-182相對表達量比較

NSCLC患者癌組織miR-182相對表達量為2.85（1.08～4.83），顯著高于癌旁組織[0.40（0.24～0.61）]（P＜0.01）。見圖1。

圖1 癌組織與癌旁組織miR-182相對表達量比較

2.3 不同血清IL-8水平NSCLC患者之間癌組織miR-182相對表達量比較

將血清IL-8≤35 pg/mL定義為低IL-8，＞35 pg/mL定義為高IL-8。高IL-8組NSCLC患者（24例）癌組織miR-182相對表達量高于低IL-8組NSCLC患者（16例）（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同血清IL-8水平NSCLC患者癌組織miR-182相對表達量比較

2.4 NSCLC患者血清IL-8水平與癌組織miR-182相對表達量的相關(guān)性

NSCLC患者血清IL-8水平與癌組織miR-182相對表達量呈正相關(guān)（r =0.810 8，P＜0.000 1）。見圖3。

圖3 NSCLC患者血清IL-8水平與癌組織miR-182相對表達量的相關(guān)性

2.5 A549細胞中miR-182的轉(zhuǎn)染效率

將miR-182 mimic、mimic NC、miR-182 inhibitor、inhibitor NC質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至A549細胞中。miR-182 mimic組miR-182相對表達量明顯高于mimic NC組（P＜0.01），miR-182 inhibitor組miR-182相對表達量顯著低于inhibitor NC組（P＜0.01）。見圖4。

圖4 各組miR-182相對表達量比較

2.6 miR-182在A549細胞增殖和遷移中的作用

細胞增殖實驗結(jié)果顯示，培養(yǎng)72 h和96 h，miR-182 mimic組的細胞增殖能力均高于mimic NC組（P＜0.01）；miR-182 inhibitor組的細胞增殖能力均低于inhibitor NC組（P＜0.01）。見圖5（a）。

細胞遷移實驗結(jié)果顯示，miR-182 mimic組的細胞遷移數(shù)目高于mimic NC組（P＜0.01）；miR-182 inhibitor組的細胞遷移數(shù)目低于inhibitor NC組（P＜0.01）。見圖5（b）、圖5（c）。

圖5 miR-182在A549細胞增殖和遷移中的作用

2.7 IL-8在A549細胞增殖和遷移中的作用

細胞增殖實驗結(jié)果顯示，IL-8組的細胞增殖能力明顯高于對照組（P＜0.01），IL-8+miR-182 inhibitor組的細胞增殖能力明顯低于IL-8組（P＜0.01），見圖6（a）。

細胞遷移實驗結(jié)果顯示，IL-8組細胞遷移數(shù)明顯高于mimic NC組（P＜0.01）；而IL-8+miR-182 inhibitor組細胞遷移數(shù)低于IL-8組（P＜0.01）。見圖6（b）、圖6（c）。

圖6 IL-8在A549細胞增殖和遷移中的作用

2.8 IL-8對miR-182表達水平的影響

培養(yǎng)24 h后，IL-8組miR-182相對表達量明顯高于對照組（P＜0.05），IL-8+Repertaxin組m i R-1 8 2相對表達量明顯低于I L-8組（P＜0.01），見圖7（a）。STAT3-siRNA組STAT3蛋白表達量明顯低于NC-siRNA組（P＜0.01），見圖7（b），提示質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。STAT3-siRNA組miR-182相對表達量明顯低于NC-siRNA組（P＜0.05），見圖7（c）。

圖7 IL-8對miR-182表達水平的影響

2.9 miR-182對IL-8表達的影響

轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒48 h后，miR-182 mimic組P-p65蛋白表達量高于mimic NC組（P＜0.05），見圖8（a）。miR-182 mimic組p65蛋白入核數(shù)量多于mimic NC組，miR-182 inhibitor組p65蛋白入核數(shù)量少于inhibitor NC組，見圖8（b）、圖8（c）。miR-182 mimic組IL-8基因和蛋白的表達量均高于mimic NC組（P＜0.05），miR-182 inhibitor組IL-8基因和蛋白的表達量均低于inhibitor NC組（P＜0.05），見圖8（d）、圖8（e）。

圖8 miR-182和NF-κB信號通路對IL-8表達的影響

3 討論

目前，惡性腫瘤居全球死亡原因的第1位，而肺癌是腫瘤相關(guān)死亡的首要原因[1]。提高肺癌的早期診斷率，并根據(jù)肺癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制選擇特異性的治療方法，提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量，是當前肺癌相關(guān)研究的重點和熱點。

趨化因子和細胞因子在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。在腫瘤中，趨化因子主要調(diào)節(jié)血管生成，激活腫瘤特異性免疫反應(yīng)，并通過自分泌或旁分泌機制直接刺激腫瘤[8]。

IL-8是一種相對分子質(zhì)量為6 000～8 000的小分子蛋白質(zhì)，屬于CXC趨化因子家族成員[9]，也被稱為C-X-C基序配體8。多種腫瘤細胞可通過自分泌IL-8的形式促進腫瘤發(fā)展和轉(zhuǎn)移，通過旁分泌的形式影響腫瘤微環(huán)境并誘導血管生成。IL-8也會從腫瘤微環(huán)境被釋放到體循環(huán)中，多種腫瘤，如胰腺癌、結(jié)腸癌、腎癌、前列腺癌、肝癌、食管癌和肺癌患者血清IL-8水平均會升高，并與患者的低生存率顯著相關(guān)[10-11]。2003年，miR-182首次被發(fā)現(xiàn)在感覺器官和組織中大量表達，調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜和內(nèi)耳的發(fā)育，并在成骨細胞和T細胞分化中發(fā)揮重要作用[7]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，miR-182參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遠處轉(zhuǎn)移，在黑色素瘤中，miR-182會出現(xiàn)異常表達，并靶向叉頭轉(zhuǎn)錄蛋白O3（forkhead box O3，F(xiàn)OXO3），促進腫瘤轉(zhuǎn)移[12]；在乳腺癌中，miR-182通過靶向轉(zhuǎn)移抑制因子1（MTSS I-BAR domain containing 1，MTSS1），解除Ras同源基因家族成員A（ras homolog family member A，RHOA）的活性抑制，促進應(yīng)力纖維的形成來促進腫瘤轉(zhuǎn)移[13]。

本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者癌組織miR-182呈高表達，且高IL-8組癌組織miR-182相對表達量高于低IL-8組（P＜0.05）。本研究細胞實驗結(jié)果顯示，IL-8可促進A549細胞的增殖和侵襲；單獨過表達miR-182可促進A549細胞的增殖和侵襲，敲低miR-182可抑制A549細胞的增殖和侵襲，且敲低miR-182后，還能恢復IL-8促A549細胞增殖和侵襲的作用；IL-8可通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子STAT3來促進miR-182的表達，而miR-182通過上調(diào)NF-κB信號通路，促進IL-8的表達和分泌。

綜上所述，IL-8/miR-182調(diào)控軸在NSCLC細胞的增殖過程中發(fā)揮了重要作用，這為探索NSCLC的基因治療、尋找新的分子治療靶點提供了實驗室依據(jù)，為肺癌的治療提供了一種新的可能。后續(xù)研究將通過動物實驗進一步闡明并驗證NSCLC細胞中IL-8/STAT3/miR-182/NF-κB/IL-8正反饋調(diào)控軸的機制，探索靶向抑制該調(diào)控軸干預(yù)NSCLC的可行性，并在臨床患者樣本中進行驗證，為NSCLC的預(yù)防和臨床診治提供新的策略和分子靶點。