孫小丹,許 靜,劉鷖雯,何怡青,杜 艷,張國良,高 鋒,楊翠霞
(1.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院檢驗科,上海 200233;2.上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院中心實驗室,上海 200233)
骨肉瘤是一種罕見的間充質(zhì)惡性腫瘤,具有較強的侵襲、轉(zhuǎn)移能力,有80%~90%的患者在首次確診時即伴有潛在轉(zhuǎn)移灶[1]。單純手術(shù)截肢治療的患者5年生存率低于20%[2]?;熆娠@著提高患者的預期壽命,目前臨床上多采用手術(shù)切除和聯(lián)合化療的治療方案治療骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移患者[3]。然而,大劑量的化療藥物副作用較多,已成為影響治療效果及預后的關(guān)鍵因素[4]。雌激素受體(estrogen receptor,ER)與腫瘤細胞的生長、耐藥及轉(zhuǎn)移能力均密切相關(guān)[5]。除性激素依賴的靶器官腫瘤外,ER還表達于胃癌、結(jié)腸癌、肺癌及骨腫瘤等惡性腫瘤中[6]。有研究結(jié)果顯示,調(diào)控ER的表達水平或活性可有效改變雌激素/ER依賴的轉(zhuǎn)錄因子表達[7],進而影響腫瘤的藥物敏感性、生長特性等。目前,臨床上針對ER的選擇性ER調(diào)節(jié)劑有他莫昔芬、雷洛昔芬、巴多昔芬等,其中他莫昔芬可作為化療增敏劑,增強ER陽性腫瘤患者對化療藥物的敏感性[8];巴多昔芬可抑制結(jié)腸癌細胞中炎癥因子的表達,進而抑制結(jié)腸癌細胞的增殖,逆轉(zhuǎn)耐藥性[9]。目前,針對選擇性ER調(diào)節(jié)劑是否可有效抑制骨肉瘤細胞的增殖及腫瘤進展、調(diào)控骨肉瘤細胞炎癥因子釋放的研究較少。為此,本研究擬探討骨肉瘤細胞中ER的表達量及選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬對骨肉瘤細胞增殖和炎癥因子表達的影響,同時分析他莫昔芬對骨肉瘤細胞CC趨化因子配體(CC chemokine ligand,CCL)2表達的影響,為選擇性ER調(diào)節(jié)劑在骨肉瘤治療中的應用提供參考。
人成骨細胞系hFOB1.19和人骨肉瘤細胞系143B購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,人骨肉瘤細胞系U-2OS購自中國科學院細胞庫。hFOB1.19細胞采用含10%胎牛血清、0.3 mg/mL G418、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM),在33.5 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。143B細胞和U-2OS細胞均采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM,在37 ℃、5% CO2環(huán)境中培養(yǎng)。細胞密度為70%時進行后續(xù)實驗。
采用CCK-8法分別檢測加入10 μmol/L二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO;上海澤邁生物技術(shù)有限公司)(DMSO組)、10 μmol/L 17β-雌二醇(estradiol,E2;美國MedChem Express公司)(E2組)和10 μmol/L他莫昔芬(美國MedChem Express公司)(他莫昔芬組)48 h后的細胞存活情況,CCK-8試劑盒購自美國Promega公司。將143B細胞或U-2OS細胞按3 000個/孔接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h后分別加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2,培養(yǎng)48 h后,每孔加入20 μL CCK-8試劑,37 °C孵育2 h。采用Epoch酶標儀(美國BioTek公司)檢測吸光度(A)值。
將143B細胞和U-2OS細胞以800 個/孔接種于6孔板中,加入10 μmol/L DMSO(DMSO組)、10 μmol/L E2(E2組)和10 μmol/L他莫昔芬(他莫昔芬組),培養(yǎng)2周,直到形成肉眼可見的克隆后,采用4%多聚甲醛固定液固定細胞20 min;去除固定液,用1×磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline,PBS)洗滌3次,再用 0.05%結(jié)晶紫溶液染色20 min,使用 1×PBS 洗滌后風干。拍照并記錄所形成的細胞克隆數(shù)目。
采用RIPA裂解液(上海碧云天公司)裂解細胞,收集細胞裂解物上清液,提取總蛋白。采用蛋白定量試劑盒(美國Sigma公司)測定總蛋白濃度。吸取10 μg蛋白,加入蛋白上樣緩沖液(上海碧云天公司),置于100 ℃水浴鍋孵育10 min。采用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì),通過濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,然后用含5%脫脂奶粉的三羥甲基氨基甲烷-吐溫緩沖液(tris-hydroxymethyl aminomethane-Tween,TBST)封閉1 h,加入一抗,4 °C下孵育過夜。一抗為磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,pPKB;又稱pAkt )308抗體(貨號13038T)、pAkt473抗體(貨號4060T)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)抗體(貨號4695)和磷酸化細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phosphorylated extracellular regulated protein kinase,pERK)抗體(貨號4370P),均購自美國Cell Signaling Technology公司。用TBST洗滌PVDF膜3次,每次10 min,加入辣根過氧化物酶標記的多克隆二抗(杭州聯(lián)科生物公司)孵育1 h。加入化學發(fā)光底物,采用Amersham Imager 600掃描成像系統(tǒng)(美國GE healthcare Bio-Sciences AB公司)分析。以3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參,使用Image Pro-Plus 6.0軟件(美國 Media Cybernetics 公司)對圖像灰度進行分析。
將30 000個143B細胞接種到6孔板中,培養(yǎng)24 h后分別加入10 μmol/L他莫昔芬和10 μmol/L E2,培養(yǎng)48 h。采用RNAiso Plus(日本TaKaRa公司)從143B細胞中提取總RNA。采用NanoDrop系統(tǒng)(美國ThermoFisher Scientific公司)測定RNA濃度。采用含gDNA Eraser(日本TaKaRa公司)的PrimeScript T Reagent試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg mRNA。采用熒光定量PCR檢測IL-6、IL-8、TGF-β、CCL2和CCL5基因表達,SYBR試劑盒購自日本TaKaRa公司,檢測儀器為QuantStudio 7 Flex實時熒光定量PCR儀(美國ThermoFisher Scientific公司)。引物由上海擎科生物有限公司合成,引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達量。
表1 引物序列
將143B細胞和U-2OS細胞分別接種于24孔板中,加入500 μL培養(yǎng)液,再分別加入10 μmol/L E2(E2組)和10 μmol/L 他莫昔芬(他莫昔芬組),處理3 d,設相應的空白對照(DMSO組)。收集培養(yǎng)上清,離心去除細胞沉淀,保存于-20 ℃冰箱。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測143B細胞和U-2OS細胞培養(yǎng)上清中的CCL2水平。試劑盒購自上海森雄有限公司,最低檢測限為63 pg/mL,線性范圍125~8 000 pg/mL,批間變異系數(shù)<15%,批內(nèi)變異系數(shù)<10%,標準曲線r2值為0.999 3。檢測儀器為Epoch酶標儀(美國BioTek公司)。嚴格按儀器和試劑盒說明書操作。
所有實驗至少獨立重復3次。采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析,2個組之間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2種骨肉瘤細胞(143B和U-2OS)的ER mRNA相對表達量均顯著低于成骨細胞(hFOB1.19)。見圖1。
圖1 骨肉瘤細胞(143B和U-2OS)和成骨細胞(hFOB1.19)ER mRNA表達比較
143B細胞的CCK-8增殖實驗和平板克隆實驗結(jié)果顯示,與DMSO組比較,他莫昔芬組細胞數(shù)顯著降低(P<0.05),E2組細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。U-2OS細胞的CCK-8增殖實驗和平板克隆實驗結(jié)果顯示,他莫昔芬組和E2組細胞數(shù)均低于DMSO組(P<0.05)。免疫印跡法結(jié)果顯示,與DMSO組比較,他莫昔芬組pAkt和pERK水平顯著降低(P<0.05),E2組pAkt和pERK水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2。
圖2 選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬對骨肉瘤細胞增殖的影響
他莫昔芬可顯著抑制143B細胞IL-6、IL-8、TGF-β、CXCL1、CCL2和CCL5基因表達,其中對CCL2表達的抑制作用最為顯著。見圖3。
圖3 選擇性ER調(diào)節(jié)劑對骨肉瘤細胞143B炎癥因子表達的抑制作用
他莫昔芬組2種骨肉瘤細胞(143B和U-2OS)CCL2的分泌量顯著低于DMSO組(P<0.05),而E2組CCL2的分泌量顯著高于DMSO組(P<0.05)。見圖4。
圖4 DMSO、E2和他莫昔芬對骨肉瘤細胞(143B和U-2OS)CCL2分泌的影響
骨肉瘤是高度異質(zhì)性的間充質(zhì)腫瘤,臨床上多采用手術(shù)切除及術(shù)后化療[1]進行治療,但大劑量使用化療藥物副作用較多[4],且骨肉瘤患者的5年總體生存率不理想,復發(fā)率較高[10],臨床亟需更好的治療方案。本研究結(jié)果顯示,選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬可抑制骨肉瘤細胞的增殖及CCL2表達,提示選擇性ER調(diào)節(jié)劑可作為骨肉瘤切除術(shù)后化療的輔助方案,可能對改善骨肉瘤患者的預后及遠期生存率具有積極意義。
骨肉瘤好發(fā)于兒童和青少年,此階段正是性激素分泌最活躍的時期。有研究發(fā)現(xiàn),在骨肉瘤組織及細胞中均發(fā)現(xiàn)ER呈低表達[11];另有研究發(fā)現(xiàn),骨肉瘤的發(fā)生可能與ER的水平及活性有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示,骨肉瘤細胞143B和U-2OS的ER表達量顯著低于成骨細胞hFOB1.19(P<0.05),與文獻報道[13]一致。
選擇性ER調(diào)節(jié)劑(他莫昔芬等)目前已被廣泛用于ER陽性乳腺癌的內(nèi)分泌治療,且療效良好[14]。選擇性ER調(diào)節(jié)劑可抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[15],而在骨組織、心血管系統(tǒng)中,選擇性ER調(diào)節(jié)劑則作為ER激動劑發(fā)揮作用[16]。本研究結(jié)果顯示,E2和他莫昔芬均可抑制骨肉瘤細胞的增殖,且他莫昔芬的抑制作用更強,提示他莫昔芬可作為骨肉瘤化療的輔助方案。
在腫瘤微環(huán)境中,炎癥因子可促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[17],并誘導腫瘤細胞的侵襲和耐藥[5]。有研究發(fā)現(xiàn),手術(shù)創(chuàng)傷會導致腫瘤患者體內(nèi)炎癥因子水平升高[18],升高的炎癥因子在腫瘤的休眠和復發(fā)中發(fā)揮重要作用[19]。CCL2作為趨化因子家族成員之一,是腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥因子,可通過誘導腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移,促進腫瘤的惡性進展[20]。CCL2在多種腫瘤,如乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、骨肉瘤中呈異常表達[21],其表達水平與患者的預后相關(guān)。
有研究結(jié)果顯示,選擇性ER調(diào)節(jié)劑可調(diào)控炎癥因子的分泌[9],他莫昔芬可通過直接發(fā)揮抗氧化作用來減輕機體氧化應激,從而緩解機體炎癥反應[20]。在子宮肌瘤治療過程中,他莫昔芬聯(lián)合米非司酮能顯著降低子宮肌瘤患者的炎癥反應,從而抑制疾病進展[21]。本研究發(fā)現(xiàn),他莫昔芬可顯著抑制骨肉瘤細胞中多種炎癥因子基因的表達,其中對CCL2基因的抑制作用最強。
綜上所述,骨肉瘤細胞ER呈低表達。選擇性ER調(diào)節(jié)劑他莫昔芬可明顯抑制骨肉瘤細胞的增殖及CCL2的表達,可能對骨肉瘤患者的預后具有積極作用。