基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的作用機(jī)制Δ

阮意丹，黃志鴻，陳美琳，吳嘉瑞

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488)

鼻炎是由細(xì)菌、病毒、過敏原、各種理化因子以及某些全身性疾病引起的鼻腔炎癥性疾病，其誘因不同，癥狀也有所不同，可分為急性鼻炎、慢性鼻炎、變應(yīng)性鼻炎、藥物性鼻炎和萎縮性鼻炎[1]。目前，西醫(yī)治療鼻炎的效果并不理想，激素、抗菌藥物的使用雖能抗菌消炎、緩解癥狀，但治愈困難，預(yù)后不良。為增強(qiáng)療效，減少抗菌藥物及激素的使用，臨床上可用鼻淵通竅顆粒聯(lián)合西藥配合治療，如孟魯斯特、糠酸莫米松鼻噴劑。鼻淵通竅顆粒源自《劑生方》所載的經(jīng)典古方——蒼耳子散，是在原方基礎(chǔ)上加減研制而成，可疏風(fēng)清熱、宣肺通竅，改善炎癥介質(zhì)，減輕炎癥反應(yīng)，是近年來臨床治療鼻炎的重要輔助用藥[2]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于大數(shù)據(jù)時(shí)代背景下誕生的多學(xué)科交叉融合的科學(xué)，借助系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、多種網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)平臺(tái)以及現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)，構(gòu)建“疾病、基因、靶點(diǎn)、藥物”之間的相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，揭示中藥及其復(fù)方“多基因、多靶點(diǎn)、多途徑”的作用機(jī)制[3-4]。本研究將借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，探討鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的分子作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步的藥理作用研究和臨床合理應(yīng)用提供參考。

1 資料與方法

1.1 鼻淵通竅顆粒的活性成分篩選及靶點(diǎn)收集

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中藥綜合數(shù)據(jù)庫(traditional Chinese medicines integrated database，TCMID)(https://119.3.41.228∶ 8 000/tcmid/search/)，檢索辛夷、蒼耳子(炒)、麻黃、白芷、薄荷、藁本、黃芩、連翹、野菊花、天花粉、生地黃、丹參、茯苓和甘草14味中藥的化學(xué)成分，篩選口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%且類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18[4]的活性化合物及其潛在作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并根據(jù)明確的生物活性報(bào)道對(duì)鼻淵通竅顆粒的活性成分及其靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充。篩選結(jié)束后，利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org)將所篩選出的靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為相對(duì)應(yīng)的基因名。將得到的鼻淵通竅顆?；钚猿煞旨捌浒悬c(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2，構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.2 鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)的收集

以“rhinitis”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/search/)、GenCLiP數(shù)據(jù)庫(http://ci.smu.edu.cn/genclip3/analysis.php)、TTD數(shù)據(jù)庫(http://db.idrblab.net/ttd/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(https://omim.org/)，收集與鼻炎相關(guān)的靶點(diǎn)，合并5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫靶點(diǎn)，刪除重復(fù)值后得到鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 鼻炎相關(guān)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將得到的鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)中，獲取生物物種為“Homo sapiens”、最小互相作用閾值為“highest confidence(0.900)”的蛋白質(zhì)互作關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建相應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能，將鼻淵通竅顆粒的“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)與鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)合并，選取網(wǎng)絡(luò)交集部分作為鼻淵通竅顆?；钚猿煞种委煴茄椎臐撛谧饔冒悬c(diǎn)[5]。通過Cytoscape 3.7.2構(gòu)建鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，選取節(jié)點(diǎn)度值在平均數(shù)以上的化合物作為鼻淵通竅顆粒發(fā)揮作用的關(guān)鍵化合物。

1.5 鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，獲取生物物種為“Homo sapiens”、最小互相作用閾值為“highest confidence(0.900)”的蛋白質(zhì)互作關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建相應(yīng)的PPI網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，選取節(jié)點(diǎn)度值在平均數(shù)以上的靶點(diǎn)作為鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的核心靶點(diǎn)。

1.6 基因本體(gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析

利用R軟件中的“org．Hs．eg．Db”“clusterProfiler”及“DOSE”[6]對(duì)鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行可視化。選取KEGG分析中前20條通路在Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建“關(guān)鍵化合物-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

1.7 分子對(duì)接驗(yàn)證

選取“1.4”項(xiàng)下度值排序居前4位的關(guān)鍵化合物作為分子對(duì)接的配體，通過PubChem獲取其SDF格式，利用Chem3D軟件將SDF格式轉(zhuǎn)化為PDB格式。選取“1.5”項(xiàng)下度值排序靠前且有文獻(xiàn)報(bào)道的經(jīng)典靶點(diǎn)作為分子對(duì)接的受體，通過PDB數(shù)據(jù)庫獲取其相應(yīng)靶點(diǎn)蛋白的結(jié)構(gòu)信息。利用AutoDockTools 1.5.6對(duì)配體和受體進(jìn)行結(jié)構(gòu)處理和文件轉(zhuǎn)換，運(yùn)行Vina進(jìn)行分子對(duì)接，最后通過PyMOL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化處理[7]。

2 結(jié)果

2.1 鼻淵通竅顆粒的活性成分及其靶點(diǎn)

經(jīng)初步篩選共獲得297個(gè)化合物和476個(gè)靶點(diǎn)，其中辛夷19個(gè)，蒼耳子(炒)11個(gè)，麻黃23個(gè)，白芷22個(gè)，薄荷11個(gè)，藁本3個(gè)，黃芩36個(gè)，連翹23個(gè)，野菊花12個(gè)，天花粉2個(gè)，生地黃5個(gè)，丹參65個(gè)，茯苓15個(gè)，甘草92個(gè)。利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖1。圖中，菱形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，正六邊形節(jié)點(diǎn)代表藥物，正八邊形節(jié)點(diǎn)代表化合物，節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正比關(guān)系。

圖1 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖Fig 1 Network diagram of “drug-compound- target”

2.2 鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

在OMIM、GeneCards、DisGeNET、GenCLiP和TTD等5個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫中共檢索到1 295個(gè)與鼻炎相關(guān)的靶點(diǎn)，借助STRING 11.0數(shù)據(jù)庫獲得PPI關(guān)系，在Cytoscape 3.7.2 軟件中構(gòu)建鼻炎相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖2，該網(wǎng)絡(luò)共含有881個(gè)節(jié)點(diǎn)和6 898條邊，節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正比關(guān)系。

圖2 與鼻炎相關(guān)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 PPI network associated with rhinitis

2.3 鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2中的Merge功能，將鼻淵通竅顆?！八幬?化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)與鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)合并取交集，存在交集的靶點(diǎn)即鼻淵通竅顆?；钚猿煞种委煴茄椎臐撛谧饔冒悬c(diǎn)，共有113個(gè)。在Cytoscape 3.7.2中構(gòu)建鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，見圖3，圖中左邊圓形節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)，右邊圓形節(jié)點(diǎn)代表化合物，節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)的度值呈正比關(guān)系。通過Cytoscape中的Network Analysis-Analyze Network對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，根據(jù)度值大小篩選鼻淵通竅顆粒發(fā)揮作用的關(guān)鍵化合物，節(jié)點(diǎn)度值的均值為7.560 846 561，節(jié)點(diǎn)度值≥8的化合物共有44個(gè)，見表1。

圖3 鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)Fig 3 “Compound-target” network of Biyuan Tongqiao granule in the treatment of rhinitis

表1 關(guān)鍵化合物的基本信息Tab 1 Basic information of key compounds

2.4 鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的PPI網(wǎng)絡(luò)

借助String 11.0數(shù)據(jù)庫和Cytoscape 3.7.2構(gòu)建鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的PPI網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)其進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，篩選得到度值在均值以上的靶點(diǎn)共42個(gè)，即為鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的核心靶點(diǎn)，見表2。

表2 核心靶點(diǎn)的基本信息Tab 2 Basic information of core target

2.5 GO和KEGG富集分析

利用R軟件對(duì)鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。其中，GO功能富集結(jié)果顯示：生物過程方面，主要富集條目為對(duì)細(xì)菌來源的分子應(yīng)答(response to molecule of bacterial origin)、脂多糖應(yīng)答(response to lipopolysaccharide)和氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)等；細(xì)胞組成方面，主要富集條目為膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)和膜區(qū)(membrane region)等；分子功能方面，主要富集條目為細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)和受體配體活性(receptor ligand activity)等。根據(jù)P值排序，分別對(duì)前10個(gè)條目進(jìn)行可視化分析，得到柱狀圖，見圖4，圖中縱坐標(biāo)表示富集條目，橫坐標(biāo)表示富集個(gè)數(shù)。KEGG通路富集結(jié)果顯示，靶點(diǎn)主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、IL-17、美洲錐蟲病(Chagas disease)、乙型肝炎(Hepatitis B)、TNF、Toll樣受體信號(hào)通路(Toll-like receptor signaling pathway)及甲型流感(Influenza A)等通路上。AGE-RAGE信號(hào)通路在鼻炎發(fā)病機(jī)制中起到重要作用，圖5顯示的是鼻淵通竅顆粒通過作用于PRKCA、PRKCB、AKT1及JUN等4個(gè)靶點(diǎn)來抑制炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮治療鼻炎的作用。對(duì)P值排序居前30位的信號(hào)通路進(jìn)行高級(jí)氣泡圖分析，見圖6，圖中氣泡顏色由淺灰到深灰表示P值從大到小，P值越小代表顯著性越強(qiáng)，氣泡越大代表該通路的基因計(jì)數(shù)越大，橫軸代表該通路基因所占總體輸入基因的比率。在Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建“關(guān)鍵化合物-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見圖7，圖中圓形節(jié)點(diǎn)代表通路，正八邊形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，菱形節(jié)點(diǎn)代表化合物，節(jié)點(diǎn)大小與節(jié)點(diǎn)度值呈正比。

圖4 GO功能富集分析(縱坐標(biāo)表示富集條目，橫坐標(biāo)表示富集個(gè)數(shù))Fig 4 GO enrichment analysis (vertical coordinate indicates enrichment items, horizontal coordinate indicates enrichment number)

圖5 AGE-RAGE信號(hào)通路圖Fig 5 AGE-RAGE signal pathway diagram

圖6 KEGG通路富集分析Fig 6 KEGG pathway enrichment analysis

圖7 鼻淵通竅顆粒的“關(guān)鍵化合物-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig 7 “Key compound-core target-pathway” network of Biyuan Tongqiao granules

2.6 分子對(duì)接

利用AutoDock Vina軟件[8]對(duì)度值排序靠前的關(guān)鍵化合物(Quercetin、Luteolin、Kaempferol和Wogonin)與核心靶點(diǎn)(TNF、JUN、MAPK1和IL-6)進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，化合物與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能均<-7 kcal/mol，見表3。結(jié)合能表示化合物與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力，結(jié)合能<-5.0 kcal/mol表示有較好的結(jié)合活性，結(jié)合能<-7.0 kcal/mol表示具有強(qiáng)結(jié)合活性，結(jié)合能的數(shù)值越小，表示受體與配體結(jié)合得越好，親和力越高[9]。圖8展示了部分化合物與靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接模式，其中包括TNF與Quercetin(a)、JUN與Quercetin(b)、MAPK1與Luteolin(c)以及IL-6與Luteolin(d)。

表3 分子對(duì)接結(jié)果Tab 3 Results of molecular docking

3 討論

鼻淵通竅顆粒具有疏風(fēng)清熱、宣肺通竅的功效，是耳鼻喉科常用的中藥制劑，在臨床上可用于治療鼻炎和鼻竇炎。鼻炎的炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為局部血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管通透性增加，藥效學(xué)研究結(jié)果顯示，鼻淵通竅顆粒對(duì)毛細(xì)血管通透性增加、肉芽組織增生有較好的抑制作用，可減少炎癥滲出和水腫，達(dá)到通利鼻竅的效果[10]。為了進(jìn)一步研究鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的分子作用機(jī)制，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法，研究鼻淵通竅顆粒的活性成分，挖掘鼻炎相關(guān)靶點(diǎn)信息，構(gòu)建“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、鼻炎相關(guān)PPI網(wǎng)絡(luò)、鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的PPI網(wǎng)絡(luò)和“關(guān)鍵化合物-核心靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，分析“藥物、疾病、基因、靶點(diǎn)”之間的相互關(guān)系，系統(tǒng)闡釋鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的分子作用機(jī)制。

A.TNF與quercetin；B.JUN與quercetin；C.MAPK1與luteolin；D.IL-6與luteolinA. TNF and quercetin; B. JUN and quercetin; C. MAPK1 and luteolin; D. IL-6 and luteolin圖8 分子對(duì)接模式圖Fig 8 Molecular docking pattern

對(duì)“化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，可得鼻淵通竅顆粒發(fā)揮作用的關(guān)鍵化合物有44個(gè)，治療鼻炎的核心靶點(diǎn)共42個(gè)。其中，槲皮素在抗炎和免疫調(diào)節(jié)方面有較強(qiáng)的生物活性，可抑制白三烯、組胺和前列腺素等炎癥介質(zhì)的釋放，減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[11-12]。木犀草素可通過減少活性氧和活性氮的生成，抑制促炎細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)的表達(dá)，調(diào)節(jié)多種炎癥信號(hào)通路等多途徑緩解炎癥反應(yīng)[13]。山柰酚通過調(diào)節(jié)促炎酶的活性，抑制炎癥因子的產(chǎn)生與表達(dá)，從而達(dá)到抗炎的效果[14]。STAT3、JUN和MAPK1涉及細(xì)胞的凋亡和增殖，IL-6、TNF與炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)相關(guān)。STAT3是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子[15]；JUN參與免疫細(xì)胞的增殖分化，下調(diào)JUN可抑制炎癥反應(yīng)[16]；MAPK1可抑制促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，參與過敏性鼻炎的激活過程[17]；PTGS2基因在炎癥反應(yīng)過程中受炎癥介質(zhì)刺激時(shí)，其表達(dá)迅速上調(diào)[18]。分子對(duì)接結(jié)果也驗(yàn)證了上述關(guān)鍵化合物與核心靶點(diǎn)具有較強(qiáng)的結(jié)合活性，由此可推測鼻淵通竅顆粒可能主要通過上述化合物作用于核心靶點(diǎn)，達(dá)到對(duì)鼻炎的治療作用。

GO功能富集結(jié)果顯示，鼻淵通竅顆粒治療鼻炎的基因功能主要集中在對(duì)細(xì)菌來源的分子應(yīng)答、對(duì)脂多糖應(yīng)答、氧化應(yīng)激反應(yīng)、膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性和受體配體活性等。KEGG通路富集結(jié)果顯示，靶點(diǎn)主要富集在糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17、美洲錐蟲病、乙型肝炎、TNF、Toll樣受體信號(hào)通路和甲型流感等通路上。AGE-RAGE信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)通過與受體RAGE結(jié)合引起NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPK等多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的活化，從而激活轉(zhuǎn)錄因子核因子кB(NF-кB)的活性，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6的表達(dá)[19]。說明鼻淵通竅顆?？赡苁峭ㄟ^抑制AGEs/RAGE/NF-кB通路的激活來減少炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療鼻炎的效果。IL-17信號(hào)通路在許多免疫性疾病及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，其通過JNK、NF-кB等傳導(dǎo)信號(hào)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子，與鼻炎的發(fā)生有著密切關(guān)系[20]。TNF可誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)等多種信號(hào)通路，與各種T細(xì)胞亞群相互作用，維持機(jī)體免疫平衡[21]；Toll受體在抗原刺激下激活多種下游信號(hào)通路，促使炎癥介質(zhì)釋放，通過產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF等調(diào)節(jié)機(jī)體Th1/Th2平衡[22]。因此，鼻淵通竅顆?？赏ㄟ^TNF信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，抑制炎癥介質(zhì)釋放，從而緩解變應(yīng)性鼻炎的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，鼻淵通竅顆粒治療鼻炎發(fā)揮作用的關(guān)鍵成分可能是槲皮素、木犀草素、山柰酚和漢黃芩素，涉及AGE-RAGE、IL-17、TNF和Toll樣受體等多條通路，研究結(jié)果初步驗(yàn)證了鼻淵通竅顆粒發(fā)揮作用的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討其藥理作用機(jī)制和臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。