枯草芽孢桿菌產(chǎn)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶的發(fā)酵優(yōu)化

卜一凡，張 濤，2，陳靜靜，2，江 波*，2

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 食品安全國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122）

D-阿洛酮糖分子式為C6H12O6，是一種稀有糖。由于具有較低的熱量但卻有蔗糖70%的甜度，它為糖尿病人和肥胖人群提供了傳統(tǒng)糖制品的替代品，因此，D-阿洛酮糖備受關(guān)注[1]。D-阿洛酮糖在自然界中少量地存在于甘蔗、小麥等植物中[2-3]；化學(xué)合成法制備D-阿洛酮糖由于較多的副產(chǎn)物、復(fù)雜的純化步驟而受到限制[4]；而通過D-阿洛酮糖3-差向異 構(gòu) 酶 （D-psicose 3-epimerase，EC 5.1.3.30，DPEase）催化D-果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖有許多優(yōu)勢，例如簡單的純化過程和較高的產(chǎn)物濃度等[5]?？莶菅挎邨U菌是一種食品級微生物，非致病性，且擁有高效分泌蛋白質(zhì)的能力[6]，常用在抗生素、酶制劑的制備中。本研究所用的Bacillus subtilis1A751/pUB-P43dpe-dal[1]為作者所在實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的具有雙啟動子、無抗生素抗性的基因重組枯草芽孢桿菌，在前期實(shí)驗(yàn)中，其在Super-Rich培養(yǎng)基中的最高發(fā)酵酶活為6 U/mL。

該研究目的是利用此基因重組菌Bacillus subtilis1A751/pUB-P43dpe-da在3 L發(fā)酵罐水平上進(jìn)行產(chǎn)DPEase的發(fā)酵優(yōu)化，獲得最適培養(yǎng)條件后進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)來提高酶蛋白質(zhì)表達(dá)量，以期為工業(yè)化制備D-阿洛酮糖提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.2 培養(yǎng)基

1）固體平板培養(yǎng)基（組分g/L） NaCl 10.0、蛋白胨10.0、酵母膏5.0，瓊脂粉20.0；調(diào)節(jié)pH 7.0。

2）種子液體培養(yǎng)基（組分g/L） NaCl 10.0、蛋白胨10.0、酵母膏5.0；調(diào)節(jié)pH 7.0。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L） 葡萄糖15.0、酵母膏20.0、蛋白胨10.0、NaCl 8.0、MgSO4·7H2O 1.0、Na2HPO4·12H2O 1.0。

1.1.3 主要試劑及儀器 葡萄糖、MgSO4·7H2O、NaCl、瓊脂粉、Na2HPO4·12H2O、氨水、鹽酸：購自國藥集團(tuán)；果糖：購自上海生工生物工程有限公司；酵母膏、蛋白胨：購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Waters e2695高效液相色譜：美國Waters公司產(chǎn)品；DASGIP四聯(lián)3 L發(fā)酵罐：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；MiniSpin離心機(jī)：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；DK-8D電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠產(chǎn)品；A360紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 菌種活化與發(fā)酵罐培養(yǎng) 接種環(huán)蘸取甘油管保藏的菌種，平板固體培養(yǎng)基劃線，37℃培養(yǎng)12 h。挑取單菌落轉(zhuǎn)接入液體培養(yǎng)基中（裝液體積分?jǐn)?shù)10%），37℃、200 r/min培養(yǎng)12~14 h。將種子液按體積分?jǐn)?shù)3%轉(zhuǎn)接入已含發(fā)酵培養(yǎng)基的3 L發(fā)酵罐中。將攪拌速率、通氣量關(guān)聯(lián)溶氧值，以攪拌速率1 000 r/min、通氣量2 vvm調(diào)節(jié)溶氧值為100%。發(fā)酵過程中定時取樣測定OD600、酶活、葡萄糖質(zhì)量濃度。

網(wǎng)絡(luò)課程制作是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，它涉及眾多專業(yè)、各個領(lǐng)域，專業(yè)性較強(qiáng)。繼續(xù)教育學(xué)院應(yīng)安排專人負(fù)責(zé)，可以通過校內(nèi)、校外公開招聘的形式，甚至可以直接聘請具有豐富教育教學(xué)經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)教師，組建教師隊(duì)伍，為網(wǎng)絡(luò)教學(xué)資源建設(shè)提供師資保障。并且要加強(qiáng)課程設(shè)計與制作人員的學(xué)習(xí)與培訓(xùn)，為網(wǎng)絡(luò)教學(xué)課程建設(shè)提供技術(shù)支持。

1.2.2 發(fā)酵指標(biāo)測定

1）菌體生長量的測定 調(diào)節(jié)分光光度計波長為600 nm，將所得的發(fā)酵液樣品稀釋至適宜的濃度，置于比色皿中讀數(shù)，記錄吸光值。

2）DPEase酶活的測定 取發(fā)酵液樣品1 mL，12 000 r/min離心5 min，沉淀用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）反復(fù)洗吹、離心3次，將菌體沉淀稀釋至合適的濃度后，加到終體積1 mL用磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 7.5）配制的果糖底物溶液中（果糖質(zhì)量濃度90 g/L，Mn2+濃度為1 mmol/L），55℃保溫反應(yīng)10 min，煮沸滅酶5 min后于12 000 r/min離心5 min，上清液過0.22μm濾膜，制樣，HPLC分析。酶活定義：在55℃、pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)催化合成1μmol的D-阿洛酮糖所需的酶量為一個酶活單位（U）。

3）葡萄糖質(zhì)量濃度的測定 取發(fā)酵液樣品1 mL，12 000 r/min離心5 min，上清液稀釋至合適的濃度后過0.22μm濾膜，制樣，HPLC分析。

1.2.3 溶解氧（DO）對發(fā)酵的影響 在發(fā)酵過程中，分別控制DO為20%、30%，在初始碳源質(zhì)量濃度為15 g/L、pH自然、37℃的條件下進(jìn)行發(fā)酵，定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.4 pH對發(fā)酵的影響 在發(fā)酵過程中通過流加14%氨水和13%鹽酸控制pH，分別控制pH在6.0、7.0及自然；通過流加體積分?jǐn)?shù)14%氨水控制pH≥6.0，在初始碳源質(zhì)量濃度為15 g/L、溫度37℃、DO為30%條件下進(jìn)行發(fā)酵，定時取樣測定OD600、酶活及葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.5 溫度對發(fā)酵的影響 分別控制溫度28、37、42℃，在初始碳源質(zhì)量濃度15 g/L、pH 6.0、DO為30%條件下進(jìn)行發(fā)酵，定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.6 初始碳源質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響 設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)基中初始葡萄糖質(zhì)量濃度分別為15、20、25 g/L，在溫度37℃、pH 6.0、DO為30%條件下進(jìn)行發(fā)酵，定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.7 補(bǔ)料時機(jī)對發(fā)酵的影響 在溫度37℃、初始碳源質(zhì)量濃度15 g/L、pH 6.0、DO為30%條件下進(jìn)行發(fā)酵，分別在第4、5、6、7小時進(jìn)行補(bǔ)料，流量30 mL/h，補(bǔ)料瓶成分為540 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O，即碳源補(bǔ)料速率為16 g/（L·h），定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質(zhì)量濃度。

1.2.8 補(bǔ)料碳源速率對發(fā)酵的影響 在溫度37℃、初始碳源質(zhì)量濃度15 g/L、pH 6.0、DO為30%條件下進(jìn)行發(fā)酵，第5小時進(jìn)行補(bǔ)料，流量30 mL/h。補(bǔ)料瓶成分分別為135 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、270 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、400 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O、540 g/L葡萄糖+20 g/L MgSO4·7H2O，即碳源補(bǔ)料速率分別為4、8、12、16 g/（L·h），定時取樣測定OD600值、酶活及葡萄糖質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DO對發(fā)酵的影響

有研究表明，DO值較低時影響菌體代謝，而過高的DO值雖然可以使菌體迅速生長，但是容易導(dǎo)致菌體衰老，產(chǎn)量下降[7-9]。枯草芽孢桿菌是好氧菌，控制發(fā)酵過程的中的DO值對于菌體發(fā)酵和產(chǎn)酶具有重要作用[10]。圖1顯示了DO值分別為20%、30%和DO自然時對發(fā)酵的影響?？梢钥闯?，未控制體系DO時，OD600值增長緩慢，菌體生長受限，同樣也不利于產(chǎn)酶。而DO值為20%和30%的情況下，菌體得以生長并且產(chǎn)酶量增高。DO為30%時，酶活最高，因此選擇DO為30%作為最適DO條件。

圖1 DO對發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of DO on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.2 pH對發(fā)酵的影響

pH可以影響菌體細(xì)胞膜的通透性和代謝，進(jìn)而影響發(fā)酵進(jìn)程[11-12]。分別控制發(fā)酵pH為6.0、7.0、pH自然和pH≥6.0，結(jié)果見圖2。在pH 6.0和自然的條件下，菌體增長較為緩慢，但在pH 6.0條件下6 h達(dá)到最高酶活，為78.3 U/mL。在pH 7.0條件下，菌體量達(dá)到最大后驟降，可能是由于流加的鹽酸、氨水量破壞了菌體。在維持pH≥6.0的條件下，碳源耗盡之后pH開始增加，發(fā)酵罐系統(tǒng)停止補(bǔ)充氨水，體系體積不再增長，使得測試的菌體量和酶活都出現(xiàn)了“二次增長”的現(xiàn)象。重組菌在4種pH控制條件下達(dá)到的最高酶活分別為78.3、62.3、46.3、42.4 U/mL，所以選擇pH 6.0作為最優(yōu)的發(fā)酵pH。

圖2 pH對發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of pH on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.3 溫度對發(fā)酵的影響

分別設(shè)置28、37、42℃以研究溫度對重組菌發(fā)酵過程的影響，結(jié)果見圖3。隨著溫度的升高，菌體的生長、酶活的升高、葡萄糖消耗速度都隨之加快。最高酶活出現(xiàn)在37℃的實(shí)驗(yàn)組，溫度過高、過低都不適合菌體發(fā)酵，溫度過高會導(dǎo)致重組蛋白質(zhì)的折疊紊亂進(jìn)而形成包涵體[13]，長時間的高溫也會導(dǎo)致酶的失活。而較低的溫度使得菌體生長、產(chǎn)酶速度過慢。因此，選擇37℃為最佳的發(fā)酵溫度。

圖3 溫度對發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of temperature on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.4 初始碳源質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響

碳源對菌體發(fā)酵和產(chǎn)酶具有重要作用，是需求量最大的營養(yǎng)要素[14]。在確定最佳DO、pH和溫度后，分別設(shè)置發(fā)酵培養(yǎng)基中15、20、25 g/L的初始葡萄糖質(zhì)量濃度。當(dāng)初始葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/L時，菌體生長和產(chǎn)酶較快，而質(zhì)量濃度為25 g/L時，最高酶活僅為53.4 U/mL，但菌體增長情況與20 g/L的實(shí)驗(yàn)組相似，見圖4。當(dāng)培養(yǎng)基中碳源質(zhì)量濃度過高時，菌體由于脫水而菌體量下降[15]，并且CcpA蛋白的產(chǎn)生會抑制酶蛋白的轉(zhuǎn)錄翻譯，酶活下降[15-18]。綜上，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最適的初始葡萄糖質(zhì)量濃度為15 g/L。

圖4 初始碳源質(zhì)量濃度對發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial carbon source concentration on cell growth,enzyme activity and glucose consumption during fermentation

2.5 補(bǔ)料時機(jī)對發(fā)酵的影響

在確定初始培養(yǎng)條件后，對發(fā)酵體系進(jìn)行補(bǔ)料，其中葡萄糖和MgSO4·7H2O補(bǔ)料速率分別為16、0.6 g/（L·h），基于此條件對補(bǔ)料起始時間（4、5、6、7 h）進(jìn)行了優(yōu)化。由圖5可知，在發(fā)酵的第4、5、6、7小時分別對應(yīng)發(fā)酵罐中葡萄糖的殘余質(zhì)量濃度為10、4、0、0 g/L。3種補(bǔ)料方式中，從7 h起開始補(bǔ)料的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果較不明顯，這是由于補(bǔ)料時間太遲，菌體發(fā)酵過程中不利產(chǎn)物的積累一定程度上影響了菌體對補(bǔ)料的吸收。

圖5 補(bǔ)料時機(jī)對發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of feeding time on cell growth，enzyme activity and glucose consumption during fermentation

當(dāng)起始補(bǔ)料時間為4、6 h時，最高酶活僅為55.1、74.1 U/mL，低于未補(bǔ)料的酶活78.3 U/mL。而在第5小時開始補(bǔ)料，不僅在發(fā)酵過程中獲得了最高的酶活，且在后期酶活能夠維持在較高位，因此，較好的補(bǔ)料起始時間為第5小時。

2.6 補(bǔ)料碳源速率對發(fā)酵的影響

基于上述結(jié)果，較佳的補(bǔ)料時間為第5小時，分別設(shè)置葡萄糖補(bǔ)料速率4、8、12、16 g/（L·h），其中MgSO4·7H2O為0.6 g/（L·h）。如圖6（a），補(bǔ)料之后的菌體量均上升，最高OD600值由17.8上升至36.8。如圖6（b），補(bǔ)料組的酶活出現(xiàn)了“雙峰”的趨勢，這是由于補(bǔ)料的結(jié)果。當(dāng)補(bǔ)料速率為12、16 g/（L·h）時，第6小時的酶活低于未補(bǔ)料的對照組，考慮到圖6（a）中6 h菌體量顯著高于對照組，說明此時酶活的降低可能并不是因?yàn)檠a(bǔ)料的稀釋作用，而是因?yàn)榇怂俾恃a(bǔ)料對補(bǔ)料后1 h內(nèi)的酶活產(chǎn)生一定的抑制作用。這兩種補(bǔ)料速率在中后期出現(xiàn)了葡萄糖的不斷積累，導(dǎo)致酶活低于補(bǔ)料速率為4、8 g/（L·h）的實(shí)驗(yàn)組。而補(bǔ)料速率為4 g/（L·h）時，后期酶活也降至較低水平，結(jié)合圖6（c）中其葡萄糖質(zhì)量濃度變化，推測酶活降低的原因?yàn)? g/（L·h）補(bǔ)料速率不能滿足菌體對葡萄糖的需求，體系中葡萄糖耗盡未得到及時補(bǔ)充。當(dāng)補(bǔ)料速率為8 g/（L·h）時，菌體在9 h達(dá)到最高酶活123.0 U/mL，并且酶活能夠長時間保持高位，因此選擇8 g/（L·h）的補(bǔ)料速率。

圖6 碳源補(bǔ)料速率對發(fā)酵的影響Fig.6 Effect of feeding rate on cell growth，enzyme activity and glucose consumption during fermentation

3 結(jié) 語

在對DO、pH、溫度、初始葡萄糖質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化后，確定了最適條件為：DO 30%，pH 6.0，溫度37℃、初始葡萄糖質(zhì)量濃度15 g/L。該發(fā)酵條件下酶活為78.3 U/mL。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行補(bǔ)料培養(yǎng)，最適補(bǔ)料條件為：在發(fā)酵第5小時分別以8 g/（L·h）和0.6 g/（L·h）的速率流加葡萄糖與MgSO4·7H2O，在發(fā)酵第9小時達(dá)最高酶活，為123.0 U/mL，是優(yōu)化前產(chǎn)酶能力的24倍。CHEN等[19]、FU等[20]通過枯草芽孢桿菌在7.5 L發(fā)酵罐中補(bǔ)料生產(chǎn)DPEase，獲得酶活分別為95 U/mL（84 h）、74 U/mL（72 h），發(fā)酵周期較長導(dǎo)致耗時和成本增加。而該研究中的發(fā)酵方法為工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖奠定了基礎(chǔ)，后續(xù)可對分段控制pH和DO值等進(jìn)一步優(yōu)化。