糖原作為新型基因載體的研究

鄧淑豪，賴 莉，王志清，張慧杰，陳敬華

（江南大學(xué) 生命科學(xué)與健康工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

基因治療是指將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞，以修復(fù)有缺陷的基因或補(bǔ)償基因的缺失，從而達(dá)到疾病治療的目的。目前，基因治療在攻克腫瘤、糖尿病、遺傳性疾病和自身免疫性疾病等方面顯示出極大的潛力[1-2]。然而，未經(jīng)修飾的目的基因不穩(wěn)定，進(jìn)入血液循環(huán)后極易被核酸酶降解。此外，目的基因在生理環(huán)境下一般帶負(fù)電荷，導(dǎo)致其難以進(jìn)入靶細(xì)胞[3-4]。這些弊端都極大地影響到基因治療的效果。因此，構(gòu)建安全高效的遞送載體對于基因治療至關(guān)重要。

常用的基因載體主要分為兩大類：病毒載體和非病毒載體[5]。病毒載體具有較高的基因遞送效率。然而，病毒載體制備過程復(fù)雜，同時(shí)，病毒載體存在免疫原性和潛在的安全性問題，這些因素嚴(yán)重制約了其臨床應(yīng)用[6-7]。相對而言，非病毒載體制備簡單、免疫原性較低，同時(shí)載體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)豐富多樣，可有效提高目的基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。非病毒載體主要以陽離子脂質(zhì)體、陽離子聚合物為代表[8-11]。PEI 25k是目前研究最為廣泛的聚陽離子非病毒載體。盡管PEI 25k可以顯著提高目的基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，但其自身較高的毒性限制了其發(fā)展。近年來，隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展，利用各種納米材料、納米結(jié)構(gòu)等構(gòu)建的基因遞送系統(tǒng)受到了越來越多的關(guān)注。

糖原是由葡萄糖聚合而成的天然樹狀大分子多糖，是哺乳動(dòng)物的貯備多糖，主要存在于哺乳動(dòng)物的肝臟和骨骼肌中。作為內(nèi)源性多糖，糖原無毒、無免疫原性。同時(shí)，糖原在體內(nèi)可被淀粉酶和糖苷酶降解為葡萄糖[12]。糖原是天然的多糖納米材料，其粒徑大小約為20~150 nm[13-15]。糖原可溶于水，富含官能團(tuán)，易通過化學(xué)修飾引入其他官能團(tuán)[4]。糖原具有密集的支鏈，其樹狀大分子納米結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)對藥物以及核酸等的高效負(fù)載?；谏鲜鰞?yōu)異的性能，糖原在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)[16-17]。

作者利用二乙烯三胺修飾糖原合成了氨基化的糖原衍生物（NH2-Gly），并對其作為基因載體的可行性和有效性進(jìn)行了評(píng)估。利用動(dòng)態(tài)光散射儀和紅外光譜對NH2-Gly結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征。采用凝膠電泳實(shí)驗(yàn)分析其對pEGFP的負(fù)載和保護(hù)能力。通過MTT實(shí)驗(yàn)和溶血實(shí)驗(yàn)考察了NH2-Gly的生物相容性。最后，利用流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦顯微鏡分析了NH2-Gly/pEGFP在NIH 3T3細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糖原（glycogen，相對分子質(zhì)量100 000~110 000）：上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品；二乙烯三胺（DETA）：上海安耐吉化學(xué)有限公司產(chǎn)品；相對分子質(zhì)量25 000聚乙烯亞胺：美國Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；綠色熒光蛋白質(zhì)粒（pEGFP-N1）：北京TIANDZ公司產(chǎn)品，在大腸桿菌DH5α中大量繁殖，使用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提并純化；質(zhì)粒抽提試劑盒：上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；DNase酶、質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定液：上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品；小鼠胚胎成纖維細(xì)胞NIH 3T3：來自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）、胰蛋白酶：碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）培養(yǎng)基、胎牛血清：美國Gibco公司產(chǎn)品；TAE緩沖液：武漢博士德生物公司產(chǎn)品；所需其他化學(xué)試劑（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Zetasizer Nano ZS動(dòng)態(tài)光散射粒度儀：英國Malvern公司；凝膠成像儀：美國BIO-RAD公司；TENSORⅡ型紅外光譜儀：德國Bruker公司；AduanceⅢ型全數(shù)字化核磁共振波譜儀：德國Bruker公司；透射電子顯微鏡：日本JEOL公司；酶標(biāo)儀：美國Bio-Rad公司；流式細(xì)胞儀：美國Beckman公司；Nanodrop One超微量紫外分光光度計(jì)：美國Thermo Fisher公司；高速離心機(jī)：德國Eppendorf公司；激光共聚焦顯微鏡：德國Leica公司。

1.3 研究方法

1.3.1 NH2-Gly的制備 首先按照質(zhì)量比為1∶1~1∶10的比例分別稱取相應(yīng)質(zhì)量的糖原和羰基二咪唑（CDI）。在惰性氣體保護(hù)下，投入不同質(zhì)量比的糖原與CDI，溶解于二甲基亞砜中；低溫?cái)嚢?~4 h后，隨即加入一定質(zhì)量的二乙烯三胺，持續(xù)反應(yīng)12~36 h，得到氨基化糖原。隨后將上述所得溶液用去離子水透析3~5 d以去除有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，透析后將溶液放入冰箱冷凍24 h，然后用凍干機(jī)進(jìn)行干燥，即得到氨基化糖原衍生物（NH2-Gly）。為測定二乙烯三胺在糖原上的取代程度，對NH2-Gly進(jìn)行酸堿滴定。首先用去離子水配制25 mL 1 mg/mL的NH2-Gly樣品溶液，然后用酸堿滴定管進(jìn)行滴定。先用HCl溶液（0.1 mol/L）滴定樣品溶液至pH為2.0，隨即用NaOH溶液（0.1 mol/L）滴定混合物，滴加的同時(shí)測量其pH，記錄pH隨滴定體積增加的變化情況，繪制滴定曲線，得到2個(gè)突變點(diǎn)。取代度根據(jù)公式（1）計(jì)算：

式中：DS為取代度；M為二乙烯三胺的相對分子質(zhì)量；c為NaOH溶液的濃度，mol/L；m為NH2-Gly的質(zhì)量，g；X1為第一個(gè)突變點(diǎn)的橫坐標(biāo)，mL；X2為第二個(gè)突變點(diǎn)的橫坐標(biāo)，mL。

1.3.2 NH2-Gly的pH緩沖能力測定 采用酸堿滴定法測定不同氨基化程度的NH2-Gly的pH緩沖能力及對照組PEI 25k在pH 2~11范圍內(nèi)的緩沖能力。樣品溶液濃度為0.5 mg/mL，溶劑為NaCl溶液（0.1 mol/L），先用NaOH溶液（0.1 mol/L）滴定樣品溶液pH至11左右，然后將HCl溶液（0.1 mol/L）連續(xù)滴入溶液中并充分混勻，記錄pH的變化。

1.3.3 NH2-Gly的溶血性實(shí)驗(yàn) 研究不同質(zhì)量濃度NH2-Gly的溶血性。取1 mL小鼠血液于8 000 r/min下離心10 min以分離紅細(xì)胞，用pH 7.4的PBS洗滌5次至上清液澄清，用PBS稀釋重懸紅細(xì)胞。稱取一定量NH2-Gly樣品，并向不同樣品中分別加入200μL紅細(xì)胞懸液，其中NH2-Gly樣品溶液取800 μL（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0μg/mL）。另外，分別采用800μL PBS和水作為對照，PBS作為陰性對照（0%溶血），水作為陽性對照（100%溶血）。樣品放入37℃水浴鍋中孵育4 h后取出，2 000 r/min離心10 min，吸取100μL上清液加入96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測540 nm處吸光度。溶血率根據(jù)公式（2）計(jì)算：

式中：A為聚合物與血紅蛋白形成溶液的吸光度；A0為陰性對照溶液吸光度；A100為陽性對照溶液的吸光度。

1.3.4 NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的制備 取一定質(zhì)量的NH2-Gly加入PBS中，攪拌使其充分溶解，得到相應(yīng)質(zhì)量濃度的NH2-Gly溶液。隨即按NH2-Gly與pEGFP的質(zhì)量比（1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1）分別加入一定質(zhì)量的pEGFP溶液，充分振蕩混勻，于4℃保存。取樣品溶液1 mL，采用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測定NH2-Gly/pEGFP納米粒子的粒徑和表面電荷，測定溫度均為25℃。

1.3.5 瓊脂糖凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn) 按NH2-Gly與pEGFP的質(zhì)量比（1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、20∶1）制備成NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物，NH2-Gly/pEGFP含2.5μg質(zhì)粒將所得復(fù)合物室溫靜置孵育1 h。吸取樣品或pEGFP溶液4μL（1μg），加入上樣緩沖液2μL，混勻。采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析（100 V，30 min），用凝膠成像系統(tǒng)觀察凝膠并拍照，考察NH2-Gly對pEGFP的負(fù)載能力。

1.3.6 NH2-Gly/pEGFP的抗酶解實(shí)驗(yàn) 按NH2-Gly與pEGFP質(zhì)量比為5∶1和10∶1制備NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物，復(fù)合物含5μg質(zhì)粒。將所得復(fù)合物室溫靜置孵育1 h。按照DNase說明書進(jìn)行操作，取5μL NH2-Gly/pEGFP或pEGFP溶液進(jìn)行酶處理1 h，處理結(jié)束后將溶液低速離心，吸取底部溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對照組為未使用DNase處理的pEGFP。

1.3.7 NH2-Gly/pEGFP的細(xì)胞相容性評(píng)價(jià) 采用MTT法對NH2-Gly及NH2-Gly/pEGFP的細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。將培養(yǎng)好的NIH 3T3細(xì)胞稀釋至一定倍數(shù)，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞取100μL接種于96孔板中，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。細(xì)胞貼壁后吸去舊培養(yǎng)基，加入100μL培養(yǎng)基。向96孔板中分別加入不同質(zhì)量濃度的NH2-Gly、NH2-Gly/pEGFP及PEI，然后將96孔板放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h或48 h后吸出培養(yǎng)基，加入0.5 mg/mL MTT的培養(yǎng)基溶液，放入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h。接著吸出MTT的培養(yǎng)基溶液，每孔加入100μL DMSO，于37℃搖床上以100 r/min避光振搖10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm處的吸光度。根據(jù)公式（3）計(jì)算細(xì)胞活力：

式中：A0為聚合物在加入MTT反應(yīng)后形成溶液的吸光度；A1為陰性對照溶液的吸光度；A2為陽性對照溶液的吸光度。

1.3.8 NH2-Gly/pEGFP體外轉(zhuǎn)染效率 將培養(yǎng)狀態(tài)良好的NIH 3T3細(xì)胞稀釋一定倍數(shù)，向12孔板及共聚焦小皿中接種1 mL，密度為每孔1×105個(gè)細(xì)胞，放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。分別制備不同質(zhì)量比的NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物和PEI/pEGFP復(fù)合物，向12孔板的每個(gè)孔中加入50μL復(fù)合物，補(bǔ)加無血清DMEM培養(yǎng)基使每個(gè)孔體積達(dá)到300μL。放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育4 h，轉(zhuǎn)染完畢更換新鮮的含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h。然后處理樣品，用PBS洗滌3次，再用胰酶消化，以1 000 r/min離心收集細(xì)胞，加入PBS重懸，用流式細(xì)胞儀測定轉(zhuǎn)染效率。用PBS沖洗2~3次，隨后將每個(gè)培養(yǎng)皿加入500μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定液固定10 min，再用PBS沖洗2~3次后保存于500μL PBS中，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)數(shù)資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，運(yùn)用SPSS 23.0進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 NH2-Gly的合成與表征

采用紅外光譜分析不同氨基化程度的NH2-Gly結(jié)構(gòu)。由圖1可知，制備的NH2-Gly在1 699 cm-1處的強(qiáng)吸收峰不同于糖原，是酰胺的特征吸收峰，可以歸結(jié)為—C=O伸縮振動(dòng)。此外，1 457~1 532 cm-1和1 263~1 291 cm-1處的吸收峰分別為—NH—彎曲振動(dòng)和C—N振動(dòng)[6]。此外，NH2-Gly在1 457~1 532 cm-1處的吸收峰較糖原明顯加強(qiáng)，且隨著氨基化程度的提高而增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，糖原已成功被二乙烯三胺寡氨殘基修飾，得到了不同氨基化程度的NH2-Gly。

圖1 氨基化糖原紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of glycogen and NH2-Gly

粒徑和所帶電位很大程度上影響著基因載體的轉(zhuǎn)染效率。采用動(dòng)態(tài)光散射粒度儀測定了NH2-Gly的粒徑和表面電位，結(jié)果見表1。所制備的NH2-Gly的水化粒徑范圍為50~90 nm。通過酸堿滴定可計(jì)算出不同物料比條件下制備的NH2-Gly的氨基取代度。由表1數(shù)據(jù)可知，氨基取代度隨活化劑CDI與糖原質(zhì)量比的增加而增加。反應(yīng)物料質(zhì)量比為2∶5∶5所合成的NH2-Gly的氨基取代度最高，可達(dá)到42.6%。同時(shí)，在此條件下得到的NH2-Gly電位最高，達(dá)37.1 mV。據(jù)此可判斷物料質(zhì)量比為2∶5∶5是合成NH2-Gly的較優(yōu)條件。后續(xù)實(shí)驗(yàn)中所用到的NH2-Gly均在此質(zhì)量比下合成。帶有強(qiáng)正電荷的NH2-Gly具有較好的對目的基因進(jìn)行壓縮包裹的能力。圖2為糖原和NH2-Gly的透射電鏡圖，可以看出，糖原和NH2-Gly為球形納米粒子結(jié)構(gòu)，粒徑均在50 nm左右，且粒子分散均勻，幾乎無團(tuán)聚現(xiàn)象。

圖2 透射電子顯微鏡圖Fig.2 Transmission electron microscopy images

表1 糖原和氨基化糖原的粒徑、電位、取代度Table 1 Size，zeta potential and degree of substitution of NH2-Gly

2.2 NH2-Gly的pH緩沖能力

陽離子聚合物的基因轉(zhuǎn)染能力與其緩沖能力密切相關(guān)。PEI具有“質(zhì)子海綿”效應(yīng)，表現(xiàn)出較高的緩沖能力。PEI所具有的“質(zhì)子海綿”效應(yīng)能夠使內(nèi)吞小泡溶脹破裂，幫助PEI/基因復(fù)合物逃逸到細(xì)胞質(zhì)中，從而具有較高的基因轉(zhuǎn)染能力。不同氨基化程度的NH2-Gly在NaCl水溶液中的緩沖能力見圖3。未修飾的糖原在pH突變時(shí)消耗HCl（0.1 mol/L）體積最少，緩沖性能較差，這是由于糖原自身游離的可供反應(yīng)的基團(tuán)較少所致。糖原被二乙烯三胺寡氨殘基修飾后，pH突變時(shí)消耗HCl體積有所增加，緩沖性能得到明顯改善。然而，由于NH2-Gly存在相對較少的氨基，其緩沖能力仍低于PEI 25k。隨著NH2-Gly的氨基取代度提高，溶液的酸堿緩沖能力顯著增強(qiáng)。NH2-Gly有望實(shí)現(xiàn)目的基因的有效轉(zhuǎn)染。

圖3 氨基化糖原和PEI 25k的pH緩沖能力Fig.3 Buffering capacity of NH2-Gly and PEI 25 k

2.3 NH2-Gly的血液相容性評(píng)價(jià)

將不同質(zhì)量濃度的NH2-Gly與分離出的紅細(xì)胞一起孵育后，通過觀察不同質(zhì)量濃度的NH2-Gly的溶血現(xiàn)象，評(píng)估NH2-Gly的血液相容性。如圖4所示，在NH2-Gly質(zhì)量濃度高達(dá)200μg/mL時(shí)，NH2-Gly的溶血率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽性對照組的溶血率，未達(dá)到陽性對照組的5%。結(jié)果表明，NH2-Gly不會(huì)對紅細(xì)胞造成溶脹，NH2-Gly具有較好的血液相容性。

圖4 氨基化糖原的溶血活性評(píng)價(jià)Fig.4 Hemolysis activity of NH2-Gly

2.4 NH2-Gly對pEGFP的壓縮包載

載體能否對基因進(jìn)行有效壓縮包裹是實(shí)現(xiàn)基因遞送的首要條件。采用瓊脂糖凝膠電泳考察NH2-Gly對目的基因pEGFP的壓縮包裹能力。圖5為不同質(zhì)量比的NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳圖。隨著NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物質(zhì)量比的升高，電場作用下遷移的pEGFP越來越少。當(dāng)NH2-Gly與pEGFP質(zhì)量比為2∶1時(shí)，泳道中已觀察不到遷移的pEGFP，pEGFP完全滯留在上樣孔內(nèi)，表明此時(shí)NH2-Gly可完全壓縮包載pEGFP。NH2-Gly帶有較強(qiáng)的正電荷，隨著NH2-Gly與pEGFP質(zhì)量比的增加，NH2-Gly與pEGFP之間的靜電相互作用得到增強(qiáng)。此結(jié)果表明，該NH2-Gly對pEGFP具有較好的壓縮包載能力，有望作為新型基因載體。

圖5 pEGFP和不同質(zhì)量比NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis analysis of the pEGFP and NH2-Gly/pEGFP complex with different weight ratios

2.5 NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的表征

載體/基因復(fù)合物的粒徑和電位是影響其轉(zhuǎn)染效率的重要因素。研究表明，適度的正電荷和合適的粒徑（50～200 nm）有利于載體/基因復(fù)合物的細(xì)胞攝取和胞內(nèi)運(yùn)輸[19-20]。NH2-Gly帶有較強(qiáng)的正電荷，可與pEGFP通過靜電作用組裝成納米粒子。表2為不同制備條件下得到的NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的粒徑與電位。當(dāng)NH2-Gly與pEGFP質(zhì)量比為1∶1時(shí)，復(fù)合物粒徑約為100 nm，電位為負(fù)值，說明此條件下NH2-Gly未能將pEGFP完全包載。這個(gè)結(jié)果與圖5中凝膠電泳結(jié)果一致。隨著NH2-Gly比例的增加，NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物粒徑有所增大并保持相對穩(wěn)定，多分散系數(shù)（PDI）在0.2左右，表明復(fù)合物粒徑比較均一。同時(shí)，NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物所帶電荷也由負(fù)變正并保持穩(wěn)定。以上結(jié)果表明，NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的粒徑和電位有利于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

表2 NH2-Gly/pEGFP的粒徑和電位Table 2 Size and zeta potential of NH2-Gly/pEGFP complex

2.6 NH2-Gly/pEGFP抗核酸酶降解能力

基因在遞送過程中易被血清中的核酸酶降解，導(dǎo)致基因治療的失敗。為了驗(yàn)證NH2-Gly對pEGFP的保護(hù)能力，將NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物以及pEGFP與DNase共孵育，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。如圖6所示，NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的條帶清晰，表明其可以保護(hù)pEGFP免受核酸酶降解，而游離EGFP已經(jīng)被DNase降解，無法看到條帶。此結(jié)果說明NH2-Gly對pEGFP的高效包載提高了pEGFP在血清中的穩(wěn)定性，是一個(gè)優(yōu)良的基因載體。

圖6 pEGFP和NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物的穩(wěn)定性Fig.6 Stability of the pEGFP and NH2-Gly/pEGFP complex

2.7 NH2-Gly/pEGFP的細(xì)胞毒性

陽離子基因載體的細(xì)胞毒性是影響其臨床應(yīng)用的主要障礙之一。選擇PEI 25k作為對照，采用MTT法檢測了NH2-Gly和NH2-Gly/pEGFP對于NIH 3T3細(xì)胞的毒性。如圖7所示，培養(yǎng)24 h和48 h后，PEI和PEI/pEGFP在較低質(zhì)量濃度下就已顯現(xiàn)出高細(xì)胞毒性，細(xì)胞存活率低于50%。這主要是由PEI 25k所具有的較高的正電荷密度以及骨架的不可降解性所導(dǎo)致。相反，NH2-Gly沒有抑制NIH 3T3的增殖，表現(xiàn)出良好的生物相容性。這主要?dú)w因于糖原較好的生物相容性、生物可降解性以及NH2-Gly相對較低的電荷密度。NH2-Gly/pEGFP與細(xì)胞培養(yǎng)48 h后沒有表現(xiàn)出明顯毒性現(xiàn)象，質(zhì)量濃度為30μg/mL時(shí)相對細(xì)胞存活率為108%，50μg/mL時(shí)相對細(xì)胞存活率為100%，100μg/mL時(shí)存活率仍超過90%。因此，NH2-Gly細(xì)胞毒性較低，具有較好的安全性，有望作為新型基因載體。

圖7 NH2-Gly和NH2-Gly/pEGFP對NIH 3T3細(xì)胞的毒性Fig.7 Cytotoxicity of NH2-Gly and NH2-Gly/pEGFP complex to NIH 3T3 cells

2.8 NH2-Gly/pEGFP體外轉(zhuǎn)染效率

基因復(fù)合物能否被細(xì)胞攝取很大程度上影響著基因治療的效果。首先利用共聚焦顯微鏡觀察了NH2-Gly/pEGFP在NIH 3T3細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染情況。如圖8所示，轉(zhuǎn)染48 h后，NIH 3T3細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可見表達(dá)的GFP的綠色熒光，且GFP熒光強(qiáng)度隨著NH2-Gly與pEGFP質(zhì)量比的增加而增加，說明NH2-Gly/pEGFP在NIH 3T3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果明顯。其中，質(zhì)量比10∶1時(shí)，復(fù)合物轉(zhuǎn)染的NIH 3T3細(xì)胞的GFP熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)正常且生長狀態(tài)好。NH2-Gly的轉(zhuǎn)染效果與PEI 25k相當(dāng)。而PEI/pEGFP復(fù)合物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞生長狀態(tài)欠佳，細(xì)胞少而分散且形態(tài)呈圓形，細(xì)胞生長狀態(tài)較差，綠色熒光較暗。質(zhì)量比為10∶1的復(fù)合物獲得高轉(zhuǎn)染效率的原因主要有以下兩個(gè)方面：首先，NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物細(xì)胞毒性小，高質(zhì)量比易獲得高轉(zhuǎn)染效率，而PEI 25k的細(xì)胞毒性較大，提高轉(zhuǎn)染比例后細(xì)胞易死亡，從而引起轉(zhuǎn)染效率降低；其次，糖原可以被α-D-葡萄糖苷酶從非還原性末端降解，有利于DNA的釋放，可以提高轉(zhuǎn)染效率。

圖8 NH2-Gly/pEGFP在成纖維細(xì)胞中的激光共聚焦顯微鏡圖Fig.8 Confocal laser scanning microscopy images of the transfection of NH2-Gly/pEGFP in NIH 3T3 cells

隨后用流式細(xì)胞儀定量考察了NH2-Gly/pEGFP及PEI/pEGFP復(fù)合物在NIH 3T3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效果。由圖9可知，在24 h時(shí)，NH2-Gly與pEGFP質(zhì)量比為5∶1的復(fù)合物轉(zhuǎn)染效率要明顯高于PEI/pEGFP復(fù)合物，說明其具有較快的轉(zhuǎn)染效率。這主要因?yàn)镹H2-Gly/pEGFP具有較好的生物相容性。轉(zhuǎn)染48 h后，NH2-Gly與pEGFP質(zhì)量比為10∶1的復(fù)合物轉(zhuǎn)染效果與PEI/pEGFP復(fù)合物的轉(zhuǎn)染效果相當(dāng)。綜上所述，NH2-Gly載體具有較好的細(xì)胞轉(zhuǎn)染能力，其轉(zhuǎn)染效果可接近或超過PEI?？紤]到NH2-Gly載體良好的生物相容性，NH2-Gly有望作為載體用于基因治療。

圖9 NH2-Gly/pEGFP復(fù)合物在NIH 3T3中的流式分析圖Fig.9 Flow cytometer of NH2-Gly/pEGFP complex in NIH 3T3 cells

3 結(jié)語

通過較為簡便的方法合成了氨基化的糖原衍生物（NH2-Gly）。NH2-Gly表面帶有較高的正電荷，同時(shí)具有良好的生物相容性和較好的緩沖能力。NH2-Gly可有效絡(luò)合pEGFP并保護(hù)其免受核酸酶的降解。NH2-Gly大幅提高了pEGFP在NIH 3T3細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率，其轉(zhuǎn)染效率幾乎與PEI 25k相當(dāng)。同時(shí)，與PEI相比，NH2-Gly的生物相容性更好。此外，溶酶體內(nèi)含有大量的能夠分解糖原的α-葡萄糖苷酶，NH2-Gly/基因復(fù)合物有望在溶酶體內(nèi)被α-葡萄糖苷酶水解，釋放出所包載的基因。同時(shí)，基于糖原易于功能化修飾的特點(diǎn)，未來還可以在NH2-Gly表面進(jìn)一步修飾靶向基團(tuán)，實(shí)現(xiàn)基因的靶向遞送。綜上，糖原有望作為安全高效的基因載體，在基因治療領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。