抗菌肽多靶點(diǎn)作用抑菌機(jī)理研究進(jìn)展

肖懷秋，李玉珍，林親錄，趙謀明，劉 軍，周 全

（1.湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 制藥與生物工程學(xué)院，湖南 株洲412000；2.中南林業(yè)科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410004；3.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州510641）

感染性疾病是由細(xì)菌和病毒等致病微生物感染引起的嚴(yán)重威脅公共健康安全的疾病，特別是以金黃色葡萄球菌為典型代表的多重耐藥菌的出現(xiàn)使感染性疾病治療變得更加復(fù)雜[1]。在抗生素替代藥物研究中，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）因能使細(xì)菌無(wú)耐藥性或降低細(xì)菌耐藥性而備受關(guān)注[2]，由基因編碼的多肽前體通過(guò)蛋白酶解激活產(chǎn)生，大多數(shù)為陽(yáng)離子（2~9價(jià)），一級(jí)結(jié)構(gòu)中—NH2端常富含親水性氨基酸，—COOH端富含疏水性氨基酸，疏水性殘基一般超過(guò)30%，在細(xì)胞質(zhì)膜中折疊后可形成疏水殘基與親水殘基，分別位于兩側(cè)的雙親和空間結(jié)構(gòu)，可形成α-螺旋和β-折疊等多種二級(jí)結(jié)構(gòu)，具有廣譜抗菌活性、熱穩(wěn)定性好、抗菌活性高、特異性強(qiáng)、有一定細(xì)胞選擇性和對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒副作用少等優(yōu)勢(shì)，對(duì)細(xì)菌、真菌和病毒甚至腫瘤細(xì)胞都有良好抑制活性[3]，對(duì)生物體主動(dòng)防御及主動(dòng)免疫等也有重要作用，有望成為抗菌藥物理想替代品[4]?？咕膶?duì)細(xì)胞具有多靶點(diǎn)單獨(dú)或協(xié)同作用，研究抗菌肽多作用靶點(diǎn)抑菌機(jī)理對(duì)抗菌肽構(gòu)效關(guān)系理論與應(yīng)用研究具有重要指導(dǎo)意義?？咕脑谏矬w內(nèi)的生理功能[5]見(jiàn)圖1。

圖1 抗菌肽生物學(xué)功能Fig.1 Biological functions of antimicrobial peptides

1 細(xì)胞壁損傷抑菌機(jī)制

細(xì)菌細(xì)胞壁主要含肽聚糖，真菌細(xì)胞壁主要含葡聚糖和甘露聚糖等成分?？咕目赏ㄟ^(guò)與細(xì)胞壁合成前體分子結(jié)合（如脂質(zhì)II分子帶負(fù)電荷的焦磷酸糖[6-7]）或干擾肽聚糖合成[8]，或與肽聚糖和坦酸等細(xì)菌細(xì)胞壁關(guān)鍵組分結(jié)合[9]等方式造成細(xì)胞壁損傷。如β-defensin 3可與細(xì)胞壁合成前體焦磷酸糖結(jié)合，抑制細(xì)胞壁形成并破壞細(xì)胞正常形態(tài)，導(dǎo)致胞內(nèi)容物外溢和細(xì)胞死亡[10]；planosporicin通過(guò)阻斷肽聚糖合成造成肽聚糖前體異常積聚，使細(xì)胞壁合成受阻[11]；LL-37可作用于真菌細(xì)胞壁甘露聚糖造成細(xì)胞壁受損而表現(xiàn)抑菌活性[12]；Teixobactin通過(guò)與肽聚糖前體Lipid II和坦酸前體Lipid III結(jié)合抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成而表現(xiàn)出抑菌活性[13]。

2 細(xì)胞膜損傷抑菌機(jī)制

細(xì)菌細(xì)胞膜上富含大量負(fù)電荷酸性磷脂，可通過(guò)靜電吸附作用與陽(yáng)離子抗菌肽結(jié)合，抗菌肽結(jié)構(gòu)中疏水區(qū)域可與細(xì)胞膜兩性離子磷脂表面聚集并富集在膜表面[14]。對(duì)G-細(xì)菌，抗菌肽可與負(fù)電荷細(xì)胞外膜脂多糖結(jié)合形成肽-脂復(fù)合物并形成跨膜通道破壞細(xì)胞膜完整性；對(duì)G+細(xì)菌，可與細(xì)胞表面坦酸結(jié)合并附著細(xì)胞表面，通過(guò)兩親性結(jié)構(gòu)自聚形成構(gòu)象簇穿過(guò)坦酸、脂坦酸、脂多糖及肽聚糖層等膜表面組分到達(dá)細(xì)胞膜并造成膜受損[15]。真菌細(xì)胞膜中麥角甾醇和鞘脂常為抗菌肽靶受體，如抗菌肽C16-Fengycin A通過(guò)抑制細(xì)胞膜中麥角固醇生物合成而破壞禾谷鐮刀菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[16]，DmAMP1與細(xì)胞膜中鞘脂甘露糖苷二肌醇磷脂酰神經(jīng)酰胺相互作用破壞釀酒酵母細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[17]。陽(yáng)離子抗菌肽不易與富含膽固醇及中性磷脂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜作用，因此，對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞有一定細(xì)胞選擇性[18]?？咕募?xì)胞膜損傷模型主要有如下4種：

2.1 地毯（Carpet）模型

“地毯”模型是抗菌肽細(xì)胞膜損傷模型的典型代表?？咕姆肿悠叫形接诩?xì)胞膜表面脂雙層，當(dāng)抗菌肽濃度達(dá)到閾值后大量集聚在細(xì)胞膜表面形成“地毯”式結(jié)構(gòu)，親水端“伸向”水溶液，而疏水端通過(guò)靜電吸附集聚于細(xì)胞膜表面，集聚濃度達(dá)到閾值后破壞細(xì)胞膜完整性，使細(xì)胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)瓦解塌陷[19]，抗菌肽其疏水核心并未嵌入到細(xì)胞膜內(nèi)部，親水區(qū)域也無(wú)須聚集形成孔道，當(dāng)聚集到細(xì)胞膜表面的抗菌肽達(dá)到閾值后，細(xì)胞膜瞬間坍塌，細(xì)胞膜向內(nèi)彎曲并引起膜破裂[19]，作用于G-和寄生蟲(chóng)等抗菌肽常以毯式模型方式進(jìn)行[20]，如aurein、cathelidicins、indolicidin和LL-37等[21]。

2.2 環(huán)孔狀（Toroidal-Pore）模型

抗菌肽分子極性端與細(xì)胞膜磷脂分子極性頭部結(jié)合，插入到脂質(zhì)雙層膜并造成細(xì)胞聚集，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，親水域形成孔內(nèi)側(cè)，而疏水域形成孔外側(cè)，疏水性區(qū)域與磷脂分子頭部基團(tuán)協(xié)同形成“環(huán)孔”并在細(xì)胞膜上形成孔洞，造成脂質(zhì)體與胞內(nèi)生物大分子“外逸”。由于孔洞由抗菌肽與細(xì)胞膜脂質(zhì)分子共同構(gòu)成，微型抗菌肽也能形成“環(huán)孔”，抗菌肽以垂直方式插入細(xì)胞膜并使其疏水區(qū)發(fā)生移位導(dǎo)致細(xì)胞膜疏水中心形成裂口，誘導(dǎo)磷脂單分子層持續(xù)性向內(nèi)彎曲形成跨膜孔道[22]，該模型不存在特定肽-肽相互作用，肽與肽之間不干涉[23]，最顯著特征是雙分子層排列，如magainin、LL-37和sticholysin II等[24-26]。

2.3 桶板（Barrel-Stave）模型

桶板模型的抗菌肽分子橫跨細(xì)菌細(xì)胞膜形成具有中心內(nèi)腔結(jié)構(gòu)構(gòu)象簇的跨膜離子通道，包括抗菌肽單體與細(xì)胞膜結(jié)合、單體間識(shí)別、連續(xù)多個(gè)單體嵌入與聚集、聚集抗菌肽單體以垂直方式排列細(xì)胞膜表面形成跨膜微孔4個(gè)步驟。其中，抗菌肽單體間識(shí)別與聚集是關(guān)鍵[24]?？咕囊允鵂钚问酱怪薄案采w”在細(xì)胞膜表面并不斷往胞內(nèi)滲透，在細(xì)胞膜上形成類(lèi)似于木桶狀的中空管腔結(jié)構(gòu)，親水部分朝向桶內(nèi)壁構(gòu)成親水通道，疏水區(qū)域朝向膜內(nèi)與磷脂結(jié)合，一個(gè)抗菌肽分子就相當(dāng)木桶邊沿上的“木板”，理論上需要至少4個(gè)“板”才能有效形成該模型結(jié)構(gòu)?？咕钚噪S抗菌肽分子數(shù)量增加而增加，抗菌肽分子越多內(nèi)容物滲透就越嚴(yán)重[27]，可破壞細(xì)胞正常滲透壓并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Alamycin以α-螺旋構(gòu)象附著、聚集并嵌入磷脂分子，其疏水性區(qū)域與磷脂分子疏水核心結(jié)合，親水性區(qū)域形成跨膜離子通道或跨膜微孔[24]。桶板模型脂質(zhì)疏水性和親水性排列對(duì)細(xì)胞膜不會(huì)造成嚴(yán)重破壞，部分抗菌肽可易位到內(nèi)質(zhì)單層進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并與胞內(nèi)組分發(fā)生相互作用[28]。只有少數(shù)抗菌肽可形成桶板模型，如alamethicin、pardaxin和protegrins等[3]。

毯式模型、環(huán)孔狀模型和桶板模型抗菌肽對(duì)細(xì)胞膜的損傷機(jī)制見(jiàn)圖2。

圖2 抗菌肽破壞細(xì)胞膜作用機(jī)制Fig.2 Schematic representation of membrane-active mechanism of AMPs

2.4 “凝聚”（Aggregate）模型

細(xì)胞膜中磷脂先形成聚集體，當(dāng)結(jié)合抗菌肽后聚集體形成的平衡態(tài)被打破并在細(xì)胞膜上出現(xiàn)離子泄露通道，促使胞內(nèi)離子“逸出”并造成細(xì)胞凋亡?？咕姆肿涌筛?jìng)爭(zhēng)性取代脂多糖并與細(xì)胞表面Ca2+和Mg2+等金屬陽(yáng)離子結(jié)合而破壞細(xì)胞穩(wěn)定性，也可與細(xì)胞內(nèi)外膜上脂質(zhì)層結(jié)合并破壞膜結(jié)構(gòu)形成“孔洞”[3]，與環(huán)孔模型相似，但抗菌肽排列沒(méi)有特定方向，以聚集形式形成跨膜，只會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞膜滲透性，不造成膜破裂，以無(wú)規(guī)則肽-脂質(zhì)分子聚集形式插入細(xì)胞膜形成動(dòng)態(tài)孔道[3]，如maculatin1.1[29]和polyphemusin等[30]。

3 影響胞內(nèi)生物大分子合成及代謝關(guān)鍵酶活性

陳旋等[31]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽P7可抑制DNA復(fù)制和RNA合成導(dǎo)致大腸桿菌死亡；PR-39可通過(guò)抑制蛋白質(zhì)與DNA合成以非裂解方式殺滅細(xì)菌[32]；人源抗菌肽tPMP-1和aHNP-1進(jìn)入到細(xì)胞后可抑制DNA與蛋白質(zhì)合成[33]；組蛋白衍生肽Buforin II在不改變膜通透性情況下通過(guò)細(xì)菌膜轉(zhuǎn)運(yùn)并直接與大腸桿菌胞內(nèi)核酸或與組蛋白H2A結(jié)合，使DNA結(jié)構(gòu)松散，削弱堿基堆積力，干擾DNA合成，BuforinⅡ突變體可與RNA相互作用表現(xiàn)更高結(jié)合活性，抑菌活性更強(qiáng)[34]。Indolicidin可阻止胸苷摻入到DNA復(fù)制過(guò)程，也可與細(xì)胞脂多糖結(jié)合抑制細(xì)胞壁合成，或抑制蛋白質(zhì)生物合成[35]。Apidaecin可結(jié)合在細(xì)菌表面并轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)中，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性與細(xì)菌熱休克蛋白結(jié)合，進(jìn)而封閉并抑制伴侶蛋白質(zhì)輔助眾多未成熟蛋白質(zhì)加工折疊，表現(xiàn)出良好的抗菌活性[36]。豬源抗菌肽PR-39可抑制胞內(nèi)氧化酶復(fù)合物組裝，導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法產(chǎn)生活性氧（ROS）并影響正常代謝[37]。部分α-螺旋肽（pleurocidin，dermasep-tin）和富含Pro與Arg的抗菌肽（PR-39，indolicidin）可阻礙（3H）胸腺嘧啶、（3H）尿嘧啶與（3H）亮氨酸在E.coli中表達(dá)，通過(guò)抑制核酸與蛋白質(zhì)合成[32]；富含Pro抗菌肽pyrrhocoricin、drosocin和apidaecin可抑制熱激蛋白的ATP酶活性，影響蛋白質(zhì)的正?？臻g結(jié)構(gòu)形成[38]。Indolicidin能破壞細(xì)菌細(xì)胞膜且失活DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶來(lái)抑制DNA合成[39]；Cathelicidin Bac7能靶向核糖體亞基并干擾蛋白質(zhì)翻譯，但不影響DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄[40]；HNP-1和HNP-2能干擾細(xì)菌核酸與蛋白質(zhì)合成并抑制周質(zhì)β-半乳糖苷酶合成，破壞細(xì)胞壁完整性[41]；Feglymycin（13肽）能抑制肽聚糖生成酶MurA和MurC活性，影響細(xì)胞壁形成[42]。

4 線粒體損傷抑菌機(jī)制

線粒體保持一定的膜電位對(duì)其正常生物功能發(fā)揮有重要作用，若線粒體受損或形態(tài)改變，則線粒體電位會(huì)下降，一旦膜電位耗盡，細(xì)胞凋亡則不可逆轉(zhuǎn)，可作為線粒體早期損傷的重要表征指標(biāo)，特別是線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。papiliocin[43]和psacotheasin[44]可改變線粒體電位耗散誘導(dǎo)白色念珠菌凋亡，CGA-N12和CGA-N9也可通過(guò)類(lèi)似機(jī)制誘導(dǎo)熱帶念珠菌凋亡[45-46]。線粒體中Ca2+是真核細(xì)胞調(diào)控關(guān)鍵離子，當(dāng)細(xì)胞過(guò)度興奮或刺激時(shí)，線粒體對(duì)Ca2+的吸收會(huì)增強(qiáng)并誘導(dǎo)線粒體內(nèi)膜損傷，使部分細(xì)胞凋亡因子（包括Cyt C）發(fā)生外溢[47]。核酸內(nèi)切酶為Ca2+敏感酶，與細(xì)胞凋亡晚期染色質(zhì)濃縮和DNA斷裂密切相關(guān)，Ca2+超載誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS可直接作用于核酸并導(dǎo)致細(xì)胞核損傷與細(xì)胞凋亡[48]。Scolopendin可誘導(dǎo)線粒體吸收過(guò)量Ca2+并造成胞內(nèi)氧自由基過(guò)量生成，從而誘導(dǎo)白色念珠菌因自由基過(guò)量而出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[49]。CGA-N12和CGA-N9也可促進(jìn)線粒體Ca2+吸收，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量產(chǎn)生并造成細(xì)胞凋亡[45-46]。促細(xì)胞凋亡因子Cyt C存在于線粒體膜空間，其釋放常視為線粒體外膜受損或通透性改變，是真核細(xì)胞程序性死亡重要特征[50-51]。Melittin可增強(qiáng)線粒體對(duì)Ca2+的吸收，誘導(dǎo)胞內(nèi)產(chǎn)生大量羥基自由基（·OH），并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因子（Cyt C）泄漏，從而造成白色念珠菌線粒體和Yca1依賴性凋亡途徑[52]。CGA-N12也可使熱帶念珠菌Cyt C泄漏，通過(guò)天冬氨酸蛋白水解酶依賴性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[45]。線粒體負(fù)責(zé)TCA循環(huán)與氧化磷酸化等能量代謝途徑，TCA循環(huán)可產(chǎn)生NADH和FADH2等輔酶，氧化磷酸化是利用輔酶生成能量并將質(zhì)子逆濃度梯度泵入線粒體間隙，形成線粒體內(nèi)外膜電化學(xué)梯度（電勢(shì)用于ATP合成）。histatin 5可抑制輔酶I依耐性酶的生物活性（如蘋(píng)果酸脫氫酶），抑制三羧酸循環(huán)并下調(diào)ATP合成酶的亞基（γ鏈），上調(diào)參與蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)水平，使胞內(nèi)生物大分子泄漏，降低細(xì)胞的環(huán)境適應(yīng)性并誘導(dǎo)細(xì)胞程序性凋亡[53]。LL-37可降低生物氧化呼吸鏈中相關(guān)基因的表達(dá)，使能量代謝出現(xiàn)障礙，從而表現(xiàn)抑菌活性[54]。常見(jiàn)抗菌肽結(jié)構(gòu)氨基酸殘基序列及抑菌作用機(jī)制見(jiàn)表1。

表1 常見(jiàn)抑菌肽結(jié)構(gòu)氨基酸殘基序列與靶點(diǎn)/作用模式Table 1 Sequence and target/action mode of amino acid residues of common AMPs

續(xù)表1

5 免疫調(diào)節(jié)抑菌機(jī)制

除直接殺死微生物外，抗菌肽在亞治療劑量下可作為免疫效應(yīng)分子調(diào)動(dòng)并激活機(jī)體免疫細(xì)胞抑制或殺滅炎癥[67]。LL-37可在機(jī)體感染或促炎因子誘導(dǎo)下，在生物體內(nèi)組織或器官中表達(dá)和釋放至黏膜表面發(fā)揮間接趨化作用[68]，LL-37既可直接上調(diào)單核細(xì)胞趨化蛋白-1和IL-8表達(dá)，還可誘導(dǎo)單核細(xì)胞（monocyte）產(chǎn)生大量IL-1β，間接誘導(dǎo)白細(xì)胞介素和單核細(xì)胞趨化蛋白質(zhì)表達(dá)，或上調(diào)趨化因子受體CXCR-4、CCR2和IL-8RB表達(dá)，招募免疫細(xì)胞到感染部位[69]，或抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）活化和Akt信號(hào)通路降低了促炎細(xì)胞因子分泌，減弱炎癥反應(yīng)[70]，還可與細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）結(jié)合降低內(nèi)毒素介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[71]；部分抗菌肽還可趨化免疫細(xì)胞至感染部位，如βdefensin hBD1和hBD2可結(jié)合單核細(xì)胞趨化因子受體并招募T細(xì)胞[72]來(lái)發(fā)揮抗感染作用。

6 展 望

細(xì)胞膜對(duì)維持細(xì)胞滲透壓、控制物質(zhì)交換、信號(hào)傳導(dǎo)和能量生成等生化過(guò)程有重要作用，受損后會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)容物外泄與胞外物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)，改變細(xì)胞滲透壓，對(duì)細(xì)胞正常生理功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，陸續(xù)報(bào)道了許多新型抗菌藥物，但以細(xì)胞膜作為效應(yīng)靶點(diǎn)居多，主要是因?yàn)橐约?xì)菌細(xì)胞膜作為抗菌效應(yīng)靶點(diǎn)可以解決現(xiàn)有抗生素難以徹底殺滅處于減速生長(zhǎng)期與休眠期的細(xì)菌這一問(wèn)題[73]；細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相對(duì)保守和作用于細(xì)胞膜的快速殺菌效應(yīng)也使得以細(xì)胞膜作為效應(yīng)靶點(diǎn)具有天然優(yōu)勢(shì)；此外，由于細(xì)菌細(xì)胞膜組分與真核生物細(xì)胞膜組分的差異，使得以細(xì)菌細(xì)胞膜作為效應(yīng)靶點(diǎn)的新藥物研發(fā)具有更好的細(xì)胞選擇性和安全性，且不易產(chǎn)生耐藥性[74]。但有研究表明，長(zhǎng)期使用抗菌肽也可能存在耐藥性[75]。筆者認(rèn)為，盡管細(xì)菌細(xì)胞膜是抗菌肽篩選優(yōu)秀的效應(yīng)靶點(diǎn)，但也應(yīng)考慮基于細(xì)胞壁損傷、線粒體損傷、胞內(nèi)生物大分子合成抑制及代謝關(guān)鍵酶靶點(diǎn)的新型抗菌肽研發(fā)[3]，從而為抗菌藥物的研究提供更多可供選擇的效應(yīng)靶點(diǎn)。