在線固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜快速測(cè)定地表水中磺胺類抗生素

許燕娟，沈斐,2*，魏煥平，魏竹秋，章嘉晴

(1.江蘇省無錫環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，江蘇 無錫 214121； 2.江南大學(xué)環(huán)境與土木工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

磺胺類抗生素是最早人工合成、使用量最大的抗生素之一，具有抗菌譜廣、性質(zhì)穩(wěn)定、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于人工養(yǎng)殖和臨床治療。磺胺類抗生素在人體及動(dòng)物體內(nèi)不能被完全吸收，大部分會(huì)隨著排泄物排出體外，進(jìn)入環(huán)境，進(jìn)而對(duì)自然水體造成污染。近年來，抗生素在國內(nèi)水環(huán)境中檢出的報(bào)道屢見不鮮[1-3]。水環(huán)境中的抗生素濃度較低，普遍處于痕量及微量水平，預(yù)處理通常使用固相萃取法[4]、固相微萃取法[5-6]和液液萃取法[7]純化和濃縮目標(biāo)物，從而滿足對(duì)痕量抗生素的分析需求。但是傳統(tǒng)的前處理方法需要進(jìn)行人工萃取，工作量較大，操作及分析測(cè)試時(shí)間較長。在線固相萃取-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有快速靈敏、定量準(zhǔn)確、檢出種類多等優(yōu)勢(shì)[8]，是目前國際上最先進(jìn)的痕量有機(jī)污染物快速分析方法之一。現(xiàn)通過優(yōu)化全自動(dòng)在線固相萃取、液相色譜和三重四極桿質(zhì)譜三者的實(shí)驗(yàn)條件，建立了快速定性、定量分析地表水中磺胺類抗生素的方法，對(duì)完善飲用水源地監(jiān)測(cè)預(yù)警體系，正確評(píng)估水體抗生素污染程度具有重要價(jià)值，為環(huán)境管理提供重要的技術(shù)支持和數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

1.1.1 儀器

在線固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)：2777C全自動(dòng)在線前處理系統(tǒng)(美國Waters公司)；AQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司)；API4000+三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；Acquity BEH 130 C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm×1.7 μm，美國Waters公司)；Acquity BEH C18色譜柱(2.1 mm ×100 mm×1.7 μm，美國Waters公司)。Milli-Q去離子水發(fā)生器(美國Millipore公司)；HLB Direct Connect HP 在線固相萃取柱(2.1 mm × 30 mm × 20 μm，美國Waters公司)；0.22 μm聚四氟乙烯濾膜(美國Waters公司)。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈和正己烷(色譜純，德國Merck公司)；甲酸(98%，美國Sigma-Aldrich公司)；磺胺甲基嘧啶(SM1)、磺胺甲氧嗪(SMP)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺對(duì)甲氧嘧啶(SMD)、磺胺間甲氧嘧啶(SFZ)、磺胺異惡唑(SIZ)、磺胺甲噻二唑(SMT)、磺胺噻唑(STZ)、磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺間二甲氧嘧啶(SMM)、磺胺鄰二甲氧嘧啶(SDM’)、磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺苯吡唑(SPP)和磺胺喹惡啉(SQX) (1 000 mg/L，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司)。

1.2 樣品采集及前處理

樣品采集：采用50 mL棕色磨口玻璃瓶采集樣品，預(yù)先加入100～150 μL甲醇防止微生物生長。水樣應(yīng)充滿采樣瓶，在避光4 ℃保溫箱中保存。水樣采集后，12 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室。

樣品前處理：取10 mL樣品，經(jīng)0.22 μm的聚四氟乙烯濾膜過濾，如果水樣顆粒物較多，可以先6 000 rmp離心10 min，取上清液后再用濾膜過濾的方式將顆粒物去除。加入甲酸調(diào)節(jié)pH值至2～3，放入樣品瓶中待測(cè)。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 在線固相萃取條件

流動(dòng)相A為含1%甲酸的超純水溶液，流動(dòng)相B為含1%甲酸的甲醇，流動(dòng)相C為甲醇/丙酮/正己烷(體積比為1∶1∶1)。實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣量為5.0 mL。在線固相萃取條件參數(shù)見表1。流動(dòng)相比例變化在分段結(jié)束時(shí)步進(jìn)至最終條件。

表1 在線固相萃取條件參數(shù)

1.3.2 超高效液相色譜條件

流動(dòng)相A1為含0.1%甲酸的超純水溶液，流動(dòng)相B1為乙腈溶液。色譜柱柱溫為40 ℃。超高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序見表2。

表2 超高效液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.3.3 三重四極桿質(zhì)譜條件

采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，使用電噴霧電離源(ESI+源)分析，噴霧電壓為5 500 V，氣簾氣壓為2.07×105Pa，霧化溫度為550 ℃，霧化氣壓為3.79×105Pa，輔助氣壓為4.14×105Pa。特征離子經(jīng)過對(duì)錐孔電壓和碰撞電壓等因素的優(yōu)化，確定了質(zhì)譜分析參數(shù)(表3)。

表3 質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 在線固相萃取柱選擇

HLB固相萃取柱由特殊的共聚合技術(shù)制備而成，含有疏水性的二乙烯基苯結(jié)構(gòu)和親水性的N-乙烯基吡咯烷酮結(jié)構(gòu)，是酸性、堿性、中性化合物的通用型固相萃取柱，具有良好的吸附萃取效果，相對(duì)于C18填料固相萃取柱具有更強(qiáng)的適用性，在抗生素分析中被廣泛使用[9]。因此，本方法采用HLB Direct Connect HP 作為在線固相萃取柱。

2.2 樣品pH值對(duì)在線固相萃取效率的影響

由于抗生素含有酸性或堿性官能團(tuán)，因此樣品的pH值決定了它們的電離狀態(tài)，從而影響其萃取效率[10]。當(dāng)樣品的pH值高于待測(cè)物的pH值時(shí)，待測(cè)物分子以親水離子存在，無法在疏水基團(tuán)的固相萃取小柱上保留。水樣的pH值很大程度地影響了目標(biāo)物在水樣中的存在形態(tài)、穩(wěn)定性以及固相萃取柱對(duì)目標(biāo)物的富集效果，因此將pH值調(diào)節(jié)為2～7，再進(jìn)行回收率對(duì)比實(shí)驗(yàn)。基于液質(zhì)檢測(cè)的原理，建議使用甲酸、乙酸或者三氟乙酸(正離子)來調(diào)節(jié)樣品的pH值，本研究采用甲酸調(diào)節(jié)pH值，樣品pH值對(duì)回收率的影響見圖2。由圖2可見，pH值為中性時(shí)，回收率較差；pH值為2～3時(shí)，回收率有明顯提升，在線固相萃取效果較好。

圖2 樣品pH值對(duì)回收率的影響

2.3 淋洗液的選擇

復(fù)雜基質(zhì)樣品在分析過程中，基質(zhì)成分與待測(cè)物在霧滴表面離子化競(jìng)爭過程中會(huì)顯著地降低或增強(qiáng)目標(biāo)離子的生成效率及離子強(qiáng)度，進(jìn)而對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響。目前關(guān)于基質(zhì)效應(yīng)的研究在國內(nèi)外已有較多成果發(fā)表[8,11-12]，但水環(huán)境中抗生素相關(guān)成果較少，在復(fù)雜基質(zhì)中的抗生素分析更是鮮有報(bào)道。在基質(zhì)較為復(fù)雜的實(shí)際樣品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在線固相萃取小柱未經(jīng)淋洗液淋洗，部分化合物受基質(zhì)效應(yīng)影響，響應(yīng)值明顯偏低，導(dǎo)致回收率結(jié)果降低。不同淋洗液有機(jī)相比例對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響見表4。由表4可見，采用含有一定比例的有機(jī)相水溶液淋洗，能夠降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，提高加標(biāo)回收率;采用過高比例的有機(jī)相水溶液淋洗，則會(huì)將目標(biāo)物洗脫下來，導(dǎo)致回收率下降。因此，選擇最佳淋洗液有機(jī)相比例為1%～5%的甲醇水溶液。

表4 不同淋洗液有機(jī)相比例對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響

2.4 色譜柱對(duì)色譜峰形和分離的影響

本研究選用常見的Acquity BEH 130 C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)、Acquity BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm) 和 Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm) 色譜柱，通過注射磺胺類抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，研究超高效液相色譜柱上的分離效果。3種色譜柱分離磺胺類抗生素的效果具有一定差異，采用Acquity BEH C18(2.1 mm×50 mm×1.7 μm)時(shí)，磺胺類抗生素色譜峰形較寬，分離度也不理想。這可能是因?yàn)樯V柱較短，理論塔板數(shù)無法滿足多個(gè)磺胺類抗生素的測(cè)定。而Acquity BEH 130 C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)和Acquity BEH C18(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)由于色譜柱較長，理論塔板數(shù)較前者更高，分離效果和色譜峰形要好于50 mm短柱。特別是Acquity BEH 130 C18色譜柱，由于該色譜柱為肽分析柱，在分析含有大量藻類的富營養(yǎng)化地表水樣品時(shí)具有較好的分析效果(圖3)，因此,選擇Acquity BEH 130 C18色譜柱為地表水中磺胺類抗生素的分離色譜柱。

圖3 富營養(yǎng)化地表水樣品分析效果

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)與方法檢出限

配制磺胺類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)組分的響應(yīng)值y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度x繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，無法進(jìn)行色譜分離的同分異構(gòu)體使用響應(yīng)值加和計(jì)算。在去離子水中添加低質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0～5.0 ng/L)，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S，按MDL=S×t(n-1，0.95)計(jì)算方法檢出限。式中，t(n-1，0.95)為置信度為95%、自由度為(n-1)時(shí)的t值；n為重復(fù)樣品數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限見表5。由表5可見，濃度范圍內(nèi)線性良好，檢出限達(dá)到ng/L級(jí)，滿足了磺胺類抗生素痕量分析測(cè)試的要求。

表5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和方法檢出限結(jié)果(n=7)

2.6 精密度和準(zhǔn)確度

在地表水樣品中添加不同質(zhì)量濃度的加標(biāo)溶液，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定7次，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表6。由表6可見，水樣的加標(biāo)測(cè)定值其RSD≤10.6%，回收率為80.6%～113%，能夠滿足日常測(cè)定的要求。

表6 精密度和準(zhǔn)確度(n=7)

2.7 實(shí)際水樣分析

按上述實(shí)驗(yàn)方法對(duì)無錫某地表水點(diǎn)位實(shí)際水樣進(jìn)行分析(表7)。由表7可見，部分磺胺類抗生素有檢出。因此，對(duì)于地表水中抗生素污染應(yīng)給予重視，確保水質(zhì)和生態(tài)環(huán)境安全。

表7 實(shí)際水樣測(cè)定①

3 結(jié)語

采用在線固相萃取-超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法快速測(cè)定地表水中磺胺類抗生素，該方法簡便快捷，靈敏度高，分析時(shí)間僅需17 min，克服了傳統(tǒng)分析方法工作量較大，前處理及分析測(cè)試時(shí)間較長，操作煩瑣等缺點(diǎn)?？瞻姿畼拥募訕?biāo)測(cè)定值其RSD≤10.6%，回收率為80.6%～113%，能夠滿足日常測(cè)定要求，適用于抗生素污染的應(yīng)急突發(fā)事件的快速定性、定量測(cè)定，以及大批量抗生素污染樣品的快速監(jiān)測(cè)需求。