二代測(cè)序技術(shù)診斷糖尿病酮癥酸中毒患者肺部金黃色葡萄球菌感染一例報(bào)道并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

王茜，王岷，吳文穎，梁冉冉

糖尿病是臨床常見的慢性代謝性疾病，其易并發(fā)各種感染，其中并發(fā)肺部感染的概率高達(dá)45%左右［1-2］。革蘭陽性菌是肺部感染的主要致病菌之一，其中金黃色葡萄球菌最為常見［3］。金黃色葡萄球菌可以引發(fā)肺部、手術(shù)創(chuàng)口及皮膚軟組織等多部位感染，而及早診治對(duì)患者的預(yù)后改善非常重要［4-5］。目前，病原菌的檢測(cè)方法主要有微生物培養(yǎng)技術(shù)、血清學(xué)病原體抗原抗體的檢測(cè)、涂片染色鏡檢、特定病原體的多重PCR技術(shù)等［6］，但上述檢測(cè)方法所需時(shí)間較長(zhǎng)、陽性率較低、容易受到外界影響且目標(biāo)病原譜窄，不能盡快確定病原菌，導(dǎo)致患者不能盡早進(jìn)行對(duì)癥治療。2014年，WILSON等［7］報(bào)道了全球首例應(yīng)用二代測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）技術(shù)診斷的感染性疾病。之后NGS技術(shù)被逐漸認(rèn)可及推廣，為臨床上未知病原菌的診斷提供了思路［8］。本文主要報(bào)道1例應(yīng)用NGS技術(shù)診斷為肺部金黃色葡萄球菌感染的糖尿病酮癥酸中毒患者，并進(jìn)行文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，以期為NGS用于病原菌的檢測(cè)提供證據(jù)。

1 病例簡(jiǎn)介

患者，男性，58歲，主因“口干、消瘦、乏力1個(gè)月，心悸、胸悶1 h”而于2020-12-19入住山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，后因“肺部感染”于2020-12-28轉(zhuǎn)入該院呼吸科。患者主要表現(xiàn)為陣發(fā)性咳嗽伴胸悶、氣促、憋喘，左側(cè)胸部隱痛，深呼吸時(shí)疼痛明顯。既往史及家族史：入院前1周確診為2型糖尿病酮癥酸中毒，其父及一弟有糖尿病史。實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：空腹血糖為27.0 mmol/L（參考范圍：3.9～6.1 mmol/L），二氧化碳結(jié)合力為16.5 mmol/L（參考范圍：22.0～27.0 mmol/L），pH值為7.13（參考范圍：7.35～7.45），二氧化碳分壓為39 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）（參考范圍：35～45 mm Hg），氧分壓為93 mm Hg（參考范圍：80～100 mm Hg），碳酸氫根為12.4 mmol/L（參考范圍：21.0～25.0 mmol/L），剩余堿為-5.5 mmol/L（參考范圍：-3.0～3.0 mmol/L），白細(xì)胞計(jì)數(shù)為16.8×109/L（參考范圍：3.5×109/L～9.5×109/L），中性粒細(xì)胞百分比為89.5%（參考范圍：40.0%～75.0%），鐵蛋白＞1 650 μg/L（參考范圍：22～322 μg/L），細(xì)胞角蛋白19片段為4.27 μg/L（參考范圍：0～4.00 μg/L），降鈣素原為1.9 μg/L（參考范圍：0～0.5 μg/L），超敏C反應(yīng)蛋白為278.2 mg/L（0～3.0 mg/L），尿酮體（+），尿白細(xì)胞為10 344個(gè)/μl（參考范圍：0～10個(gè)/μl），余指標(biāo)無異常。2020-12-24，患者胸部平掃+CTA檢查結(jié)果顯示：（1）胸部CT見雙肺多發(fā)異常密度灶，見圖1，首先考慮為感染性病變，建議臨床查病原體并治療后復(fù)查以排除轉(zhuǎn)移瘤；（2）肺動(dòng)脈CTA檢查未見明顯異常。痰病理檢查未見癌細(xì)胞；痰真菌培養(yǎng)先后見光滑假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌；痰培養(yǎng)檢查見洋蔥伯克霍爾德菌，根據(jù)其藥敏試驗(yàn)結(jié)果繼續(xù)給予頭孢呋辛、伏立康唑治療，另加用左氧氟沙星抗感染治療2 d，效果欠佳。為進(jìn)一步明確診斷，與患者多次溝通后于2020-12-29行纖維支氣管鏡檢查，鏡下見雙肺各級(jí)支氣管開口通暢，未見新生物，除右肺中葉支氣管黏膜略充血、可吸出少量白色膿性分泌物外，余各級(jí)支氣管黏膜無明顯充血、水腫。左肺上葉舌段、右肺中葉支氣管行肺泡灌洗，右肺中葉支氣管行毛刷檢查、病原學(xué)及病理檢查，結(jié)果顯示：毛刷未見癌細(xì)胞，右肺中葉黏膜黏液及炎性滲出物內(nèi)見少許纖毛柱狀上皮。2020-12-31，支氣管肺泡灌洗液NGS結(jié)果顯示：主要致病菌為金黃色葡萄球菌，檢出序列數(shù)為21 386，其他微生物因序列數(shù)較低不考慮為致病菌，見表1，故停用伏立康唑，于2021-01-01加用苯唑西林治療。2021-01-07，復(fù)查胸部CT顯示，局部病灶有所吸收，見圖2。使用苯唑西林治療8 d后，肺部影像學(xué)雖有所吸收，但患者仍有咳嗽、胸悶、氣促，考慮為耐藥金黃色葡萄球菌，2021-01-09將抗生素升級(jí)為萬古霉素以加強(qiáng)抗感染治療，7 d后患者咳嗽、咳痰明顯減輕，無胸悶、氣促，未訴其他不適。2021-01-16，患者病情好轉(zhuǎn)出院。2021-03-05，患者來院復(fù)查胸部CT顯示，病灶明顯吸收，見圖3，患者自述已無任何不適癥狀。

圖1 2020-12-24患者胸部CT檢查結(jié)果Figure 1 Results of chest CT examnation of patient on December 24，2020

圖2 2021-01-07患者胸部CT檢查結(jié)果Figure 2 Results of chest CT examination of patient at January 7，2021

圖3 2021-03-05患者胸部CT檢查結(jié)果Figure 3 Results of chest CT examination of patient at March 5，2021

表1 患者肺泡灌洗液NGS結(jié)果Table 1 NGS results of alveolar lavage of patient

2 文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

以“二代測(cè)序”“肺部感染”和“支氣管肺泡灌洗液”為關(guān)鍵詞，計(jì)算機(jī)檢索中國(guó)知網(wǎng)自建庫(kù)至2022年3月發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，納入1篇文獻(xiàn)［9］；以“NGS”“pulmonary infection”和“BALF”為關(guān)鍵詞，計(jì)算機(jī)檢索PubMed自建庫(kù)至2022年3月發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)，納入6篇病例報(bào)告［10-15］。7篇文獻(xiàn)共包括10例肺部感染患者，均經(jīng)常規(guī)檢測(cè)方法不能明確診斷，行支氣管肺泡灌洗液NGS后，明確病原菌并給予對(duì)癥治療，其中9例患者好轉(zhuǎn)、1例患者死亡，見表2。

表2 納入文獻(xiàn)的基本特征Table 2 Basic characteristics of included literature

3 討論

NGS又稱為大規(guī)模并行測(cè)序，其是獲取大量基因組信息的有效方法。NGS技術(shù)主要圍繞合成測(cè)序，其核心思想是邊合成邊測(cè)序，即通過捕捉新合成末端的標(biāo)記來確定DNA序列。NGS技術(shù)不依賴傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，可直接對(duì)標(biāo)本進(jìn)行病原菌檢測(cè)，并將其DNA/RNA與數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，以確定疑似病原體的種類、比例及所攜帶的耐藥、毒力基因信息，能快速、精準(zhǔn)地檢測(cè)出臨床樣本中的疑似致病菌［16-17］。此外，NGS技術(shù)能同時(shí)對(duì)上百萬甚至數(shù)十億的DNA分子進(jìn)行測(cè)序［18］，這極大地提高了測(cè)序效率，其已逐漸成為目前病原微生物研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的測(cè)序手段［19］。

本研究通過文獻(xiàn)復(fù)習(xí)獲得10例肺部感染患者的病歷資料，其均采用多種常規(guī)檢測(cè)方法不能明確診斷，行支氣管肺泡灌洗液NGS后，明確病原體并給予對(duì)癥治療。本例患者行支氣管肺泡灌洗液NGS前，同樣未明確診斷，經(jīng)驗(yàn)性用藥效果欠佳，且肺部CT檢查顯示雙肺彌漫分布多個(gè)大小不等的高密度影，懷疑為惡性腫瘤合并轉(zhuǎn)移瘤，后經(jīng)NGS明確病原體為金黃色葡萄球菌，針對(duì)性調(diào)整抗菌藥物后患者臨床癥狀及影像學(xué)改變均有所好轉(zhuǎn)。

NACCACHE等［20］報(bào)道1例接受異體骨髓移植的42歲男性慢性淋巴細(xì)胞白血病患者，由于移植骨髓與人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）等位基因（DQB1）不匹配，后逐漸出現(xiàn)聽力減退、呼吸困難、易怒、間歇性激動(dòng)等癥狀，期間進(jìn)行過PCR檢測(cè)、顱腦磁共振成像檢查、血清抗神經(jīng)抗體檢測(cè)、額葉活檢及對(duì)活檢組織進(jìn)行微生物檢測(cè)，均無法明確診斷，后對(duì)腦脊液和腦活檢組織進(jìn)行NGS，確診為神經(jīng)侵襲性星狀病毒（astrovirus，AstV）感染，這是第1例記錄在案的成人AstV感染病例。SOMASEKAR等［21］對(duì)已確診為急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）的204例患者的血清樣本進(jìn)行宏基因組二代測(cè)序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS），結(jié)果顯示，8例未確定病原體的患者4例為1型單純皰疹病毒感染、1例為乙型肝炎病毒感染、1例為細(xì)小病毒B19感染、1例為巨細(xì)胞病毒感染、1例為人類皰疹病毒感染；此外，mNGS還確定了多個(gè)病毒雙重或三重感染病例，提示mNGS可能有助于全面診斷與ALF相關(guān)的病毒及排除感染性病因。

《宏基因組分析和診斷技術(shù)在急危重癥感染應(yīng)用的專家共識(shí)》［22］指出，NGS主要適用于以下情況：（1）患者病情危重需盡快明確病原體；（2）特殊疾病患者，如器官移植、腫瘤、免疫缺陷或低下需盡快明確病原體患者；（3）傳統(tǒng)檢測(cè)方法不能明確診斷，經(jīng)驗(yàn)性治療效果不佳的患者；（4）疑似新發(fā)或罕見的疑難病患者。

與傳統(tǒng)測(cè)序方法相比，NGS診斷病原體的靈敏度更高。MIAO等［23］研究指出，mNGS診斷感染性疾病的靈敏度和特異度分別為50.7%和85.7%，其靈敏度高于傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)（50.7%比35.2%），尤其是針對(duì)非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）、病毒、厭氧菌、諾卡菌和真菌；痰標(biāo)本mNGS診斷結(jié)核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）、曲霉菌、隱球菌的靈敏度高于傳統(tǒng)病原體培養(yǎng)；診斷NTM時(shí)支氣管肺泡灌洗液mNGS的靈敏度高于痰標(biāo)本mNGS。BLAUWKAMP等［24］納入350例膿毒癥患者，比較其mNGS和血培養(yǎng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，mNGS與血培養(yǎng)診斷膿毒癥病原體的陽性符合率為93.7%，且mNGS的靈敏度高于血培養(yǎng)。PARIZE等［25］納入101例免疫缺陷患者，比較非靶向NGS與傳統(tǒng)方法鑒定其病原體的結(jié)果顯示：（1）上述兩種方法的符合率為71.3%（72/101）：（2）非靶向NGS對(duì)病毒和細(xì)菌的檢出率高于傳統(tǒng)方法的3倍以上；（3）非靶向NGS的假陰性率較低，較傳統(tǒng)方法更具有提示作用；（4）此外，由于患者就診前自行使用或經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素，導(dǎo)致傳統(tǒng)方法檢測(cè)病原體的陽性率較低，但使用抗生素對(duì)NGS的影響遠(yuǎn)小于傳統(tǒng)方法［26］。

盡管NGS可以快速、精準(zhǔn)地鑒定病原體，給臨床診斷和治療提供線索，但其也存在一定局限性：（1）目前，NGS技術(shù)尚缺乏統(tǒng)一的樣本收集、儲(chǔ)存、運(yùn)輸要求及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的操作規(guī)范，極有可能發(fā)生外源性核酸污染，進(jìn)而嚴(yán)重影響從樣本中獲取的核酸數(shù)據(jù)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果，嚴(yán)重影響臨床診斷［27］。（2）NGS能夠在同一個(gè)標(biāo)本中檢測(cè)出兩種及以上的非致病菌。分析其原因可能為NGS的靈敏度較高，把序列數(shù)較低的非標(biāo)本病原體或已經(jīng)死亡的病原體殘留的核酸物質(zhì)一并檢測(cè)，這極有可能導(dǎo)致臨床醫(yī)生的誤判［28］。（3）NGS結(jié)果缺乏公認(rèn)的判讀標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)序結(jié)果與治療關(guān)系不明確，耐藥基因難以檢測(cè)，故需要與藥敏試驗(yàn)相互補(bǔ)充，這就導(dǎo)致檢測(cè)費(fèi)用過高［29］。（4）與傳統(tǒng)檢測(cè)方法相比，NGS檢測(cè)耗時(shí)明顯縮短，但平均需要24～48 h；而對(duì)于心源性休克、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能衰竭、呼吸功能不全或多器官功能衰竭等危重癥患者，病原體診斷時(shí)間每縮短1 h，其存活率可能增加7%，故縮短診斷時(shí)間對(duì)該類患者具有重要意義［30］。

綜上所述，NGS技術(shù)對(duì)明確病原體、指導(dǎo)臨床治療具有重要作用，其對(duì)病原學(xué)診斷具有里程碑式的意義［31］。未來，隨著NGS檢測(cè)平臺(tái)的不斷完善和相關(guān)判讀標(biāo)準(zhǔn)的提出，NGS技術(shù)將會(huì)被廣泛地用于指導(dǎo)臨床診療工作。

作者貢獻(xiàn)：王茜、王岷、吳文穎、梁冉冉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文章的可行性分析；王茜進(jìn)行文獻(xiàn)/資料收集、整理，撰寫、修訂論文；王岷負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。