參草通脈復方對慢性心力衰竭模型大鼠心肌重構及心腎功能的影響研究

禮海，劉曉蕾，王懿，張艷

研究顯示，慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）患者占同期心血管疾病住院患者的20%［1］。受冠心病、心肌梗死等疾病的影響，我國CHF年發(fā)病人數在50萬以上，并呈遞增趨勢［2］。CHF患者的治療多以藥物干預為主，但部分治療方案因價格昂貴無法推廣［3］。而長期使用強心、利尿等口服藥物，不良反應明顯。經過十余年的臨床經驗摸索，本團隊研發(fā)了可活血化瘀、益氣通絡的參草通脈復方，臨床反饋其對CHF患者具有較好的臨床療效［4］。為明確作用靶點，本研究分析參草通脈復方對CHF模型大鼠心肌重構及心腎功能的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗時間 本實驗時間為2019年9月至2020年2月。

1.2 實驗動物 SPF級12周齡體質量為300～350 g的雄性大鼠50只，由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。許可證號：SCXK（遼）2015-0001，合格證號：201703120，本研究經遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準。飼養(yǎng)條件：敷料每3 d更換1次，更換期間對飼養(yǎng)環(huán)境進行紫外線消毒；每日更換水瓶，濕度保持在40%～60%。

1.3 實驗藥物 參照文獻［4］和《中華人民共和國藥典（2015年版）（一部）》［5］選取藥材，然后由遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院生產參草通脈復方（藥物基本成分為黃芪、丹參、益母草、人參、紅花、三七粉、葶藶子；配伍比例為3∶2∶2∶1∶1∶1∶1，遼藥制Z0901013）。福辛普利鈉片（國藥準字H19980197）由中美上海施貴寶制藥有限公司生產。

1.4 主要試劑及儀器 免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，全自動生化分析儀購自南京貝登醫(yī)療股份有限公司。

1.5 實驗方法

1.5.1 實驗分組及干預方法 將50只大鼠適應性喂養(yǎng)7 d，編號后采用隨機數字表法將其分為正常組、假手術組、模型組、中藥組、西藥組，各10只。正常組不進行手術；假手術組、模型組、中藥組、西藥組大鼠禁食不禁水12 h后，采用10%水合氯醛以0.5 ml/100 g的劑量進行腹腔麻醉，對大鼠行氣管插管術，并迅速連接小動物呼吸機（通氣頻率80次/min，潮氣量0.7 ml/kg），在左側第三、四肋間橫向切開長度為1～2 cm的開口，逐層鈍性分離，暴露心臟，于左冠狀動脈前降支起源點3～4 mm處縫線結扎（假手術組結扎5 s后松開），心電監(jiān)測顯示胸前導聯ST段及T波明顯異常，重置心臟于胸腔，分層縫合，開口處敷注射用青霉素鈉，待大鼠平穩(wěn)后進行口腔清痰，停呼吸機。術后72 h內給予注射用青霉素鈉30萬U·次-1·d-1。術后常規(guī)喂養(yǎng)7 d。模型組、中藥組、西藥組術后第8天將飼料減少1/3，每天進行1次游泳訓練至大鼠疲乏，第14天開始改為1次/3 d；共訓練28 d。建模成功標準：多普勒超聲心動圖檢測顯示左心室射血分數（left ventricular ejection fraction，LVEF）≤60%［6］。建模成功后，中藥組、西藥組大鼠按人鼠劑量換算公式〔劑量（g/kg）=給出人的劑量（g）×系數（0.018）/所求動物體質量（kg）〕灌胃給藥［6］，其中中藥組給予參草通脈復方生藥7.2 g·kg-1·d-1，2次/d；西藥組給予福辛普利和蒸餾水，首次為福辛普利1.2 mg/kg，第2次為蒸餾水1.5 ml。正常組、假手術組、模型組大鼠給予蒸餾水灌胃，1.5 ml/次，2次/d。共干預28 d。

1.5.2 免疫組化法檢測大鼠心肌組織基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9、血管緊張素Ⅱ-1型受體（angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R）表達水平 干預結束后各組大鼠禁食不禁水12 h，采血后麻醉并處死所有大鼠，取心肌組織（每只大鼠取100 mg）于液氮-80 ℃條件下保存。取各組大鼠心肌組織，采用多聚甲醛固定50 min，PBS洗滌2次、2 min/次；5 ℃下脫水，常規(guī)石蠟包埋，切片（4 μm），置于經多聚賴氨酸處理后的載玻片上，在60～610 ℃烤箱中放置60 min；PBS洗滌2次、5 min/次；置于0.3%過氧化氫中5～10 min，再用蒸餾水洗3次、2 min/次；浸入枸櫞酸中，加熱至沸騰，間隔10 min后反復1次，冷卻后用PBS洗滌2次、1 min/次，靜置5 min，PBS再洗滌2次、1 min/次；加入5% BSA靜置20 min，于37 ℃下加一抗，1 h后用PBS洗滌2次、1 min/次；加二抗于37 ℃下孵育20 min，用PBS洗滌4次、5 min/次；將其置于免疫組化試劑盒中，加入ABC試劑于37 ℃下孵育30 min，脫水、封固，利用Image-Pro Plus圖像軟件分析MMP-9、AT1R表達水平。

1.5.3 酶聯免疫吸附試驗檢測大鼠內生肌酐清除率（creatinine clearance，Ccr）、B型利鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）水平 分別于干預前、干預后采集各組大鼠目內眥靜脈血1 ml，3 000 r/min離心10 min（離心半徑10 cm），取上清液，于-20 ℃下保存。利用全自動生化分析儀、采用酶聯免疫吸附試驗檢測Ccr、BNP水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 統計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，組內比較采用配對t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌組織MMP-9、AT1R表達水平 干預后各組大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。假手術組、模型組大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平高于正常組，西藥組大鼠心肌組織AT1R表達水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平高于假手術組、中藥組、西藥組，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥組大鼠心肌組織AT1R表達水平低于假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1、圖1。

表1 各組大鼠干預后心肌組織MMP-9、AT1R表達水平比較（±s，n=10）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-9 and AT1R in myocardial tissue of rats in each group after intervention

表1 各組大鼠干預后心肌組織MMP-9、AT1R表達水平比較（±s，n=10）Table 1 Comparison of expression levels of MMP-9 and AT1R in myocardial tissue of rats in each group after intervention

注：a表示與正常組比較，P＜0.05；b表示與假手術組比較，P＜0.05；c表示與模型組比較，P＜0.05；MMP=基質金屬蛋白酶，AT1R=血管緊張素Ⅱ-1型受體

組別 MMP-9 AT1R正常組 98.26±27.83 138.88±16.51假手術組 174.28±39.01a 231.23±33.51a模型組 527.92±83.16ab 311.51±41.06ab中藥組 121.76±18.96c 178.28±30.50bc西藥組 127.32±21.40c 199.84±34.70ac F值 161.352 40.509 P值 ＜0.001 ＜0.001

圖1 免疫組化法檢測各組大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平（×40）Figure 1 Expression levels of MMP-9 and AT1R in myocardial tissue of rats detected by immunohistochemistry in each group

2.2 Ccr、BNP水平 各組大鼠干預前、干預后Ccr、BNP水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。假手術組、模型組、中藥組、西藥組大鼠干預前Ccr、BNP水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；假手術組大鼠干預后BNP水平高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組、中藥組、西藥組大鼠干預后Ccr、BNP水平高于正常組、假手術組，差異有統計學意義（P＜0.05）；中藥組、西藥組大鼠干預后Ccr、BNP水平低于模型組，差異有統計學意義（P＜0.05）；西藥組大鼠干預后Ccr、BNP水平高于中藥組，差異有統計學意義（P＜0.05）。假手術組、中藥組、西藥組大鼠干預后Ccr、BNP水平分別低于本組干預前，差異有統計學意義（P＜0.05）；模型組大鼠干預后BNP水平高于本組干預前，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠干預前后Ccr、BNP水平比較（±s，n=10）Table 2 Comparison of Ccr and BNP levels of rats in each group before and after intervention

表2 各組大鼠干預前后Ccr、BNP水平比較（±s，n=10）Table 2 Comparison of Ccr and BNP levels of rats in each group before and after intervention

注：a表示與正常組比較，P＜0.05；b表示與假手術組比較，P＜0.05；c表示與模型組比較，P＜0.05；d表示與中藥組比較，P＜0.05；e表示與本組干預前比較，P＜0.05；Ccr=內生肌酐清除率，BNP=B型利鈉肽

組別 Ccr（ml/min） BNP（pg/ml）干預前 干預后 干預前 干預后正常組 6.17±0.68 6.32±0.72 63.06±6.33 65.32±5.85假手術組 16.77±2.57a 6.53±0.89e 900.89±84.68a 499.86±37.69ae模型組 16.49±2.41a 18.30±1.67ab 983.48±95.70a 1 105.73±69.39abe中藥組 17.02±2.40a 9.30±0.85abce 988.62±97.34a 581.35±55.70abce西藥組 16.93±2.51a 12.47±1.06abcde 973.54±95.41a 659.66±63.73abcde F值 45.356 209.167 232.844 515.480 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3 討論

報道顯示，CHF患者5年生存率＜40%，CHF嚴重威脅人類健康，并占用大量醫(yī)療資源［7］。心臟再同步化治療、左心室輔助裝置等多因價格昂貴等原因無法在臨床廣泛應用，因而CHF患者多是長期使用藥物治療，而利尿劑、洋地黃類藥物隨著使用時間的延長患者不良反應越明顯，造成患者依從性差。因此，本研究組從中醫(yī)藥入手，結合多年臨床經驗，研發(fā)出高效低毒的中藥復方——參草通脈復方［4］。本研究旨在分析參草通脈復方對CHF模型大鼠心肌重構及心腎功能的影響。

實驗發(fā)現，心肌重構過程中心肌細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成發(fā)生改變，其Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量減少，導致其不能有效起到骨架支撐的作用［1］。而MMP是降解膠原蛋白的重要物質，可維持現有心肌結構，適度調節(jié)新陳代謝，以保證心肌正常結構與功能。當心排血量減少后，心肌做功增加，導致心肌細胞過度拉伸，加速心肌老化，MMP被大量激活，導致心肌膠原蛋白降解增加，加速心肌結構發(fā)生變化，進而導致心肌重構，其中MMP-9是降解心肌膠原的主要物質。前期研究發(fā)現，腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）在正常狀態(tài)下通過釋放血管緊張素調節(jié)血管收縮，維持正性肌力，分泌醛固酮［6］。而在心排血量減少、心腦腎等長期處于低灌注狀態(tài)時，RAAS會過度釋放腎素，前期可維持正常灌注，但長期可導致血管調節(jié)失常，引發(fā)血流動力學異常。失代償后RAAS不斷釋放血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ），當AngⅡ作用于心肌細胞的AT1R時，能夠引起血管平滑肌收縮，增加心室前后負荷，引發(fā)心肌超負荷，導致心肌重構［7］。因此，MMP-9、AT1R表達水平可反映心肌重構情況［8-9］。本研究結果顯示，干預后假手術組、模型組大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平高于正常組，西藥組大鼠心肌組織AT1R表達水平高于正常組；模型組大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平高于假手術組、中藥組、西藥組；中藥組大鼠心肌組織AT1R表達水平低于假手術組；中藥組、西藥組大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平比較無統計學差異；提示福辛普利和參草通脈復方均對改善CHF模型大鼠心肌重構具有積極作用，其可通過降低MMP-9、AT1R表達水平減少對膠原蛋白的分解，降低對心肌結構的破壞；同時通過降低AT1R表達水平，減少AngⅡ的釋放，減輕心室前后負荷，從而達到緩解CHF癥狀的目的。本研究組前期實驗發(fā)現，參草通脈復方能夠有效增加Ⅰ型膠原蛋白表達水平，改善心肌結構，促進心肌細胞AT1R釋放Ca2+，減少Ca2+內流導致的興奮收縮耦聯，從而降低血管阻力［10］；參草通脈復方也能夠改善ECM組成，提高心肌收縮功能［11］。

CHF患者多伴有不同程度的腎功能不全，且任何藥物的長時間使用均會對心腎功能造成不同程度的影響。內生肌酐是機體肌肉肌酸的代謝產物，與血肌酐相比，Ccr可更準確地評價腎功能，且不受其他因素干擾［12］。BNP分布于腦、心臟、肺臟組織，其中以心臟含量最高，其是RAAS的天然拮抗劑，心房負荷過重或擴張時BNP分泌增加，血漿BNP水平升高，其被廣泛應用于心功能、心力衰竭嚴重程度的判定以及心臟病患者預后的分析等領域［13-14］。因此，本研究通過檢測各組大鼠心、腎功能指標（Ccr、BNP）來評價參草通脈復方對大鼠心腎功能的影響，結果顯示，中藥組、西藥組大鼠干預后Ccr、BNP表達水平分別低于本組干預前，提示福辛普利和參草通脈復方均可有效降低CHF模型大鼠Ccr、BNP表達水平，從而改善大鼠心腎功能。模型組、中藥組、西藥組大鼠干預后Ccr、BNP水平高于正常組、假手術組，中藥組、西藥組大鼠干預后Ccr、BNP水平低于模型組，西藥組大鼠干預后Ccr、BNP水平高于中藥組，提示與福辛普利相比，參草通脈復方改善CHF模型大鼠心腎功能的效果更好。

參草通脈復方以益氣活血、行水為主，其組成中的黃芪主要成分為黃芪皂苷，有明顯的強心作用，可減輕缺氧及高負荷條件下的心肌細胞受損程度，通過利尿作用降低心肌負荷，與人參合用有抑制心肌細胞凋亡的作用［13］。而人參的主要成分為人參皂甙，其強心利尿的效果突出，能夠增強CHF患者的非特異性免疫能力［14］。丹參中丹參酮的各分型均有擴張血管、降低心肌負荷、增加心腦腎供血的作用，其抗缺氧、抗氧化作用明顯，有修復心肌細胞、保護心腎等臟器的作用［15］。益母草利水消腫，其主要成分益母草堿在明顯增加冠狀動脈血流量、降低冠狀動脈阻力的同時，能夠有效降低心率、減少氧自由基對心肌的損傷［16］。紅花中的紅花苷與紅花黃色素能夠增加冠狀動脈與腎臟血流量，改善心肌缺血狀態(tài)，雙向調節(jié)心率，減輕炎癥反應，保護心腎血管［17］。三七粉中的三七總皂苷具有強心、擴血管的作用，兼具抗動脈粥樣硬化、降低血小板活性、抗血栓形成的作用，可有效保護心、腦、腎等器官［18-19］。葶藶子的主要成分為葶藶苷、糖芥苷，其有明顯的強心、降低心率的作用，可促進排尿及調節(jié)腎臟代謝［20-22］。全方合用可強心、利尿，從而保護腎功能，兼有抗氧化、抗炎等功效。

綜上所述，參草通脈復方能夠通過降低CHF模型大鼠心肌組織MMP-9、AT1R表達水平來抑制其心肌重構進程，且與福辛普利相比，參草通脈復方可更有效地改善大鼠的心腎功能，這為CHF中藥新藥的研發(fā)提供了數據支持與科學依據。但本研究樣本量較小，且觀察指標不夠全面，需要進一步擴大樣本量、增加觀察指標來進一步驗證本研究結論。

作者貢獻：禮海進行文章的構思與設計、研究的實施與可行性分析，撰寫、修訂論文；劉曉蕾、王懿進行數據收集與整理、統計學處理、結果的分析與解釋、英文的修訂；張艷負責文章的質量控制及審校，對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。