不同牦牛毛色轉(zhuǎn)錄組特征以及候選基因篩選

韓敏振，王國(guó)文，彭 巍，舒 適，黃 榮，徐尚榮，付長(zhǎng)其，張 君*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016； 2.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

哺乳動(dòng)物的毛色表型是由黑色素細(xì)胞分泌的黑色素所控制的，黑色素分為真黑色素和褐黑色素，兩者積聚到黑色素體中，最終它們的分布數(shù)量和比例造成了哺乳動(dòng)物毛色的多樣性[1]。盡管在黑色素形成過(guò)程中涉及的信號(hào)通路眾多，但起主要作用的是a-MSH/MC1R信號(hào)通路及酪氨酸酶基因家族，Du等[2]報(bào)道a-MSH/MC1R信號(hào)通路可促進(jìn)哺乳動(dòng)物真黑色素的生成，而刺豚鼠信號(hào)蛋白基因(Agouti signaling protein，ASIP)通過(guò)抑制酪氨酸酶的表達(dá)，導(dǎo)致真黑色素合成受阻[3]，從而誘導(dǎo)褐黑色素的生成。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)ASIP和酪氨酸酶相關(guān)蛋白酶1基因(Tyrosinase-related protein1，TYRP1)、黑素皮質(zhì)激素受體1(Melanocortin 1 receptors，MC1R)、酪氨酸酶基因(Tyrosinase，TYR)等基因?qū)谏氐男纬捎兄匾挠绊慬4-6]。

牦牛(Bosgrunniens)主要分布于我國(guó)青藏高原(海拔3 000～5 500 m)地區(qū)[7]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然環(huán)境選擇淘汰，牦牛已完全適應(yīng)了高海拔特殊生態(tài)環(huán)境[8-10]。野牦牛全身為黑色或?yàn)鹾稚玔11]，而家牦牛毛色比野牦牛毛色類(lèi)型更加豐富，主要以黑色或?yàn)鹾稚珵橹?，純白色占有一定的比例，還有部分呈棕色、金色、青色或雜色。Zhang等[12]發(fā)現(xiàn)牦牛棕色毛色與TYRP1不相關(guān)，而與MC1R的3個(gè)無(wú)義突變及前黑素小體蛋白(Premelanosome protein,PMEL)的1個(gè)缺失突變相關(guān)。Guangxin等[13]利用全基因組重測(cè)序篩選出可能決定天祝白牦牛的9個(gè)候選基因，KEGG分析結(jié)果顯示，9個(gè)候選基因中有5個(gè)被歸入12個(gè)信號(hào)通路，包括鞘脂代謝和ABS轉(zhuǎn)運(yùn)體及P13K-Akt信號(hào)通路等。對(duì)牦牛毛色遺傳基礎(chǔ)的解析有助于牦牛適應(yīng)性進(jìn)化解析以及家牦牛毛色的演變研究；同時(shí)也有助于牦牛品種的保護(hù)。本研究通過(guò)對(duì)黑色、白色以及棕色牦牛皮膚組織進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，篩選與不同毛色相關(guān)的差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步挖掘控制不同毛色牦牛的主效基因及新基因提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取相同發(fā)育階段的成年健康黑色(black)、白色(white)和棕色(brown)牦牛各3頭，采集耳組織樣品，用剪刀剪去耳組織的毛發(fā)，立即用RNase-free水沖洗后置于液氮中，置-80 ℃冰箱冷凍保存，用于總RNA提取。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及質(zhì)量檢測(cè) 按照Trizol RNA試劑盒(Promega，USA)說(shuō)明書(shū)分別提取黑色、白色和棕色牦牛耳組織總RNA，使用Agilent 2100和無(wú)RNA酶的1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA的濃度及完整性進(jìn)行檢測(cè)，以確保測(cè)序所用樣品的質(zhì)量。

1.2.2 文庫(kù)構(gòu)建及質(zhì)量檢測(cè) 建庫(kù)起始RNA為total RNA，通過(guò)Oligo(dT)磁珠富集帶有poly A尾的mRNA，加入二價(jià)陽(yáng)離子將得到的mRNA隨機(jī)打斷。反轉(zhuǎn)合成cDNA并對(duì)其進(jìn)行純化，用AMPure XP beads篩選大小為370～420 bp的cDNA片段。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增并純化PCR產(chǎn)物，PCR富集建庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建所有的步驟完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，將文庫(kù)濃度稀釋至標(biāo)準(zhǔn)濃度(1.5 ng/μL)，接著用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)insert size符合預(yù)期后，為了確保所構(gòu)建文庫(kù)的質(zhì)量，利用qRT-PCR法檢測(cè)使文庫(kù)的有效濃度高于2 nmol/L。

1.2.3 測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量控制

為了保證數(shù)據(jù)的質(zhì)量，對(duì)經(jīng)過(guò)Illumina Hi Seq高通量測(cè)序所得原始序列，除去質(zhì)量較低的reads，獲得高質(zhì)量Clean reads之后開(kāi)展后續(xù)分析，保證了最終所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可靠性。

1.2.4 RNA-seq數(shù)據(jù)處理及分析

將獲得的Clean reads使用HISAT2軟件與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。然后進(jìn)行基因表達(dá)水平的定量分析(feature Counts工具)，計(jì)算出各個(gè)樣本所有基因的表達(dá)量FPKM值，采用DESeq2軟件(1.20.0)分析3組數(shù)據(jù)之間(黑色、白色、棕色)的差異表達(dá)基因。使用Benjamini & Hochberg法調(diào)整P值，將差異表達(dá)基因篩選條件確定為經(jīng)過(guò)校正的P值為FDR(False Discovery Rate)小于0.01，且差異倍數(shù)FC(Fold Change)大于1。通過(guò)cluster Profiler(3.4.4)軟件實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的富集分析。將IBM SPSS Statistics 19.0軟件用于數(shù)據(jù)分析，用t-test分析檢驗(yàn)候選基因在黑色、白色和棕色牦牛中的表達(dá)差異性；P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

本研究共產(chǎn)生了57.57Gb Clean Data，數(shù)據(jù)質(zhì)量情況見(jiàn)表1。由表1可知，黑色、白色、棕色牦牛中的GC含量均高于48%，Q30均在93%以上，說(shuō)明測(cè)序正確率較高，可用于后續(xù)分析。

表1 數(shù)據(jù)質(zhì)量情況一覽表

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與參考基因組的比對(duì)

黑色、白色、棕色牦牛的reads與黃牛參考基因組的匹配率均在84%以上，表明測(cè)序數(shù)據(jù)良好，詳細(xì)的比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Reads與參考基因組比對(duì)

表2(續(xù))

2.3 基因表達(dá)水平分析

為排除因?yàn)榛蜷L(zhǎng)度、測(cè)序深度等因素造成的干擾，一般通過(guò)FPKM值對(duì)不同樣品組數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，從而反映基因的表達(dá)水平。圖1為不同樣品基因表達(dá)量FPKM的箱線(xiàn)圖和密度分布圖。分析FPKM箱線(xiàn)圖(圖1a)得知，各組基因表達(dá)量的分布基本一致，未出現(xiàn)較大波動(dòng)，提示樣品處理正常。同時(shí)FPKM密度分布圖(圖1b)也顯示，各組樣本的密度分布曲線(xiàn)的趨勢(shì)較為一致，能夠正確反映不同表達(dá)量的基因的占比情況。

圖1 不同樣品基因表達(dá)水平比對(duì)圖

2.4 差異表達(dá)基因分析及KEGG通路富集分析

3種毛色牦牛差異表達(dá)基因及KEGG通路富集情況見(jiàn)圖2。由圖2a可以看出，經(jīng)過(guò)對(duì)白色牦牛和黑色牦牛基因差異性表達(dá)分析，共得到426個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因259個(gè)，下調(diào)基因167個(gè)；經(jīng)過(guò)對(duì)白色牦牛和棕色牦?；虿町愋员磉_(dá)分析，共得到246個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因126個(gè)，下調(diào)基因120個(gè)；經(jīng)過(guò)對(duì)黑色牦牛和棕色牦?；虿町愋员磉_(dá)分析，共得到4 230個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)基因1 995個(gè)，下調(diào)基因2 235個(gè)。在3個(gè)對(duì)比中，黑色牦牛與棕色牦牛轉(zhuǎn)錄本的差異巨大，表明黑色牦牛與棕色牦牛毛色調(diào)控機(jī)制更加復(fù)雜。

圖2b顯示白色牦牛和棕色牦牛差異表達(dá)基因主要富集在酪氨酸代謝通路。圖2c顯示白色牦牛和黑色牦牛差異表達(dá)基因主要富集在藥物代謝—細(xì)胞色素P450通路和酪氨酸代謝通路。圖2d顯示黑色牦牛和棕色牦牛差異表達(dá)基因主要富集在鞘脂代謝通路、不飽和脂肪酸的生物合成以及花生四烯酸代謝通路。酪氨酸代謝與黑色素的合成相關(guān)，白色牦牛與黑色牦牛及白色牦牛與棕色牦牛差異表達(dá)基因富集在酪氨酸代謝通路中，分別為T(mén)YRP1、TYR、ALDH3A1以及AOX4。

圖2 3種毛色牦牛差異表達(dá)基因及KEGG通路富集散點(diǎn)圖

2.5 牦牛毛色候選基因篩選

為了篩選與毛色相關(guān)的基因，根據(jù)已知的644個(gè)毛色基因，從白色牦牛與黑色牦牛對(duì)比的差異表達(dá)基因中篩選到19個(gè)與毛色相關(guān)的基因，分別為PMEL、TYRP1、MLANA、MC1R、TYR、SLC45A2、TRPM1、SLC24A5、OCA2、KCNJ13、GPR143、PCBD1、HSP90B1、PKNOX1、FIG4、IRF4、SOX10、LRSAM1、HSD3B1，其中FIG4、LRSAM1、HSD3B1基因在白色牦牛中呈顯著高表達(dá)，其余基因均呈顯著低表達(dá)；白色牦牛與棕色牦牛比對(duì)發(fā)現(xiàn)，16個(gè)與毛色相關(guān)的基因，分別為PMEL、TYRP1、MLANA、TYR、TRPM1、MC1R、SOX10、SLC24A5、OCA2、SLC45A2、SHH、KCNJ13、GPR143、PAX3、DIO2、MDN1，其中SHH、DIO2、MDN1在白色牦牛中呈顯著高表達(dá)，其余基因均呈顯著低表達(dá)；黑色牦牛與棕色牦牛比對(duì)發(fā)現(xiàn)，SLC7A11、COL17A1、KRT5、等138個(gè)基因與毛色相關(guān)。對(duì)3個(gè)比對(duì)組的共有基因進(jìn)行分析的Venn圖結(jié)果顯示(圖3)，白色牦牛比黑色牦牛、白色牦牛比棕色牦牛兩個(gè)比對(duì)組共有45個(gè)基因，其中與毛色相關(guān)的基因有12個(gè)，分別為PMEL、TYRP1、MLANA、MC1R、TYR、SLC45A2、TRPM1、SLC24A5、OCA2、KCNJ13、GPR143、SOX10；白色牦牛比黑色牦牛、黑色牦牛比棕色牦牛共有313個(gè)基因，其中與毛色相關(guān)的基因有8個(gè)，分別為PCBD1、HSP90B1、PKNOX1、FIG4、IRF4、SOX10、LRSAM1、HSD3B1；白色牦牛比棕色牦牛、黑色牦牛比棕色牦牛共有177個(gè)基因，其中與毛色相關(guān)的基因有4個(gè)，分別為SOX10、SHH、DIO2、MDN1；3個(gè)比對(duì)組共有9個(gè)基因，與毛色相關(guān)的基因?yàn)镾OX10。

酪氨酸代謝通路在白色牦牛與棕色牦牛以及白色牦牛與黑色牦牛中均有富集，且該通路與黑色素形成相關(guān)。經(jīng)過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，TYRP1、TYR、ALDH3A1、AOX4及SOX10基因在3種毛色牦牛中表達(dá)量FPKM值如圖4所示。TYRP1和TYR基因在棕色牦牛與黑色牦牛之間無(wú)顯著差異，但在白色牦牛中顯著低表達(dá)。而AOX4及ALDH3A1基因在白色牦牛中高表達(dá)，在黑色牦牛與棕色牦牛中低表達(dá)。SOX10調(diào)控黑色素細(xì)胞數(shù)量以及分布，其在黑色、棕色及白色牦牛中均有表達(dá)，在棕色牦牛中表達(dá)最高，在黑色牦牛中表達(dá)次之，在白色牦牛中表達(dá)最低，該基因的不同表達(dá)豐度對(duì)于牦牛毛色可能具有調(diào)控作用。

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)相同發(fā)育階段3種常見(jiàn)的純色牦牛的皮膚組織在轉(zhuǎn)錄組水平進(jìn)行研究，較全面地分析了不同毛色牦牛皮膚組織的基因表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑色牦牛和棕色牦牛之間的差異表達(dá)基因遠(yuǎn)多于黑色牦牛和白色牦牛及白色牦牛和棕色牦牛之間的差異表達(dá)基因。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，白色牦牛與黑色牦牛及白色牦牛與棕色牦牛差異表達(dá)基因在酪氨酸代謝通路中均有富集，分別為T(mén)YRP1、TYR、ALDH3A1及AOX4基因，這四種基因在3種毛色牦牛中表達(dá)量的差異可能是引起毛色不同的原因。

真黑色素的合成與TYR、TYRP1及DCT(TYRP2)的活性相關(guān)，而褐黑色素的合成受到TYR活性及半胱氨酸濃度的共同調(diào)控[14]。本研究結(jié)果中TYR和TYRP1基因在3種毛色牦牛中的表達(dá)量為白色牦牛<棕色牦牛<黑色牦牛，該結(jié)果印證了上述觀(guān)點(diǎn)。Zhang等[12]研究表明棕色牦牛毛色與TYRP1調(diào)控不相關(guān)，是由PMEL(p.Leu18del)及MC1R(p.Gln34*，p.Met73Leu和p.Arg142Pro)基因隱性突變導(dǎo)致。本研究結(jié)果顯示PMEL及MC1R基因在白色牦牛和棕色牦牛中均有表達(dá)，且在棕色牦牛中的表達(dá)量高于白色牦牛，與Zhang等[12]的研究結(jié)果一致，但牦牛棕色毛色是由單基因還是多基因調(diào)控需進(jìn)一步探討。有關(guān)貓科動(dòng)物的研究認(rèn)為[15]，金色老虎毛色的形成是CORIN蛋白(p.H587Y)突變所致，然而該突變位點(diǎn)在牛中未檢測(cè)到。對(duì)綿羊轉(zhuǎn)錄組的研究結(jié)果顯示，淺棕色綿羊MLANA基因表達(dá)量顯著高于白色綿羊[16]，該基因在牦牛中也有同樣的表達(dá)模式。SOX10基因是黑色素細(xì)胞的標(biāo)記物，可以調(diào)控黑色素細(xì)胞的增殖[17-18]。在本研究中，SOX10基因在不同毛色牦牛中均有表達(dá)，在棕色牦牛中表達(dá)最高，在黑色牦牛中表達(dá)次之，在白色牦牛中表達(dá)最低。據(jù)此推測(cè)，棕色牦牛中SOX10基因的高表達(dá)促進(jìn)了成黑色素細(xì)胞的增殖，同時(shí)TYR基因的高表達(dá)促進(jìn)了褐黑色素的生成，導(dǎo)致了牦牛棕色毛色的形成。

白毛色在家畜中普遍存在，其形成分為色素合成受阻和成熟黑色素細(xì)胞缺失兩類(lèi)。Liang等[19]在白水牛中發(fā)現(xiàn)一個(gè)LINE-1轉(zhuǎn)座子，位于ASIP基因上游并發(fā)揮作用，使白水牛ASIP基因表達(dá)量增加，進(jìn)而導(dǎo)致白水牛皮膚和毛發(fā)中黑色素表達(dá)減少。本研究發(fā)現(xiàn)，ASIP基因在黑色、白色以及棕色牦牛間無(wú)顯著差異。有研究表明白色牦牛的黑色素細(xì)胞發(fā)育完整，但在白色牦牛表皮基底層中基本檢測(cè)不到黑色素[20]，可能是由于苯丙氨酸羥化酶的缺失致使酪氨酸合成發(fā)生障礙，而出現(xiàn)白色表型[21]。具有黑色條紋的白色老虎由于SLC45A2蛋白(p.Ala477Val)隱性突變導(dǎo)致黑色素合成過(guò)程受阻，最終形成白色[22]。在雪虎中，同時(shí)檢測(cè)到CORIN蛋白(p.H587Y)、SLC45A2蛋白(p.Ala477Val)雙突變[15]。但在?；蚱渌锓N中并未檢測(cè)到此突變。黑色素的合成底物為酪氨酸，酪氨酸代謝通路中的AOX4及ALDH3A1基因在白色牦牛中高表達(dá)，而在黑色牦牛與棕色牦牛中低表達(dá)，表明這兩個(gè)基因的高表達(dá)在白色牦牛毛色中發(fā)揮著重要作用。在本研究中也同時(shí)檢測(cè)到白化基因MC1R、TYR在白色牦牛中表達(dá)量極低，但已有研究報(bào)道MC1R、TYR基因與白色毛色不相關(guān)[23]。有研究發(fā)現(xiàn)[24]TRPM1基因的功能是指導(dǎo)黑色素細(xì)胞向皮膚、毛囊遷移分化，并且TRPM1基因的表達(dá)減少與黑色素合成受阻有關(guān)，白色牦牛中TRPM1基因的表達(dá)降低可能干擾了黑色素體的遷移，由此推測(cè)酪氨酸代謝通路受阻是導(dǎo)致白色牦牛毛色形成的重要原因。

綜上所述，本研究對(duì)3種毛色的牦牛皮膚進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)黑色、白色及棕色牦牛轉(zhuǎn)錄本差異巨大，在酪氨酸代謝通路上顯著富集。同時(shí)篩選到牦牛中與毛色相關(guān)的差異表達(dá)基因，這有助于對(duì)牦牛毛色調(diào)控主效基因的篩選。