斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22基因克隆及對(duì)不同刺激物的響應(yīng)

朱霞 ，楊移斌 ，張蕾，胥寧，艾曉輝

1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223

白介素-22（Interleukin-22，IL-22）是一種Ⅱ型細(xì)胞因子［1］，與IL-19、IL-20、IL-24 和IL-26 同屬I(mǎi)L-10家族。在所有動(dòng)物中，細(xì)胞因子作為一類(lèi)重要的蛋白質(zhì)，通常在協(xié)調(diào)免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用［2］。哺乳動(dòng)物中主要依靠CD4+效應(yīng)淋巴細(xì)胞和其他淋巴細(xì)胞分泌［3］，經(jīng) JAK-STAT 信號(hào)通路或直接利用 Notch 信號(hào)途徑上調(diào)IL-22表達(dá)量從而抵御外界病原作用后產(chǎn)生的炎癥［4］。此外，IL-22 還具有多種作用，如誘導(dǎo)抗生物肽（AMPs）和促炎癥分子，激活屏障表面的上皮細(xì)胞，通過(guò)限制細(xì)菌的復(fù)制控制病原體入侵［5］；刺激靶細(xì)胞釋放粘附因子，加速細(xì)胞增殖，修復(fù)受損組織［6］。在應(yīng)激狀態(tài)或IL-22過(guò)表達(dá)時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答［7］。2005年IL-22基因首次在哺乳動(dòng)物以外的斑馬魚(yú)（Danio rerio）［8］上被克隆，隨后分別在硬骨魚(yú)虹鱒（Oncorhynchus mykiss）［9］、大菱鲆（Scophthalmus maximus）［10］、黃 顙 魚(yú)（Pelteobagrus filvidraco）［11］、鱖（Siniperca chuasti）［12］和 草 魚(yú)（Ctenopharyngodon idellus）［13］中被陸續(xù)報(bào)道。IL-22在斑馬魚(yú)、草魚(yú)、虹鱒等硬骨魚(yú)中能夠促進(jìn)宿主抵抗外源病原的感染，因此，了解免疫因子的表達(dá)動(dòng)態(tài)是提高魚(yú)類(lèi)自身免疫限制疾病暴發(fā)的關(guān)鍵。

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalunes punctatus）隸屬于鮎形目（Siluriformes），鮰科（Lctaluridae），真鮰屬，自1984年引入湖北以來(lái)頗受廣大消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)已成為鮰科的主要養(yǎng)殖對(duì)象，但養(yǎng)殖中受限的養(yǎng)殖環(huán)境常導(dǎo)致魚(yú)體自身健康受到威脅。因此，研究斑點(diǎn)叉尾鮰的免疫基因，探明斑點(diǎn)叉尾鮰應(yīng)答過(guò)程中的機(jī)制十分必要。先前關(guān)于IL-22在硬骨魚(yú)中的研究已有不少，為進(jìn)一步探究斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22編碼區(qū)序列特征以及不同誘導(dǎo)模式下IL-22表達(dá)變化，本研究利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（PCR）克隆了斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22基因CDS 區(qū)，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）檢測(cè)其在各組織中的表達(dá)分布以及不同免疫刺激誘導(dǎo)和病原菌感染后的表達(dá)情況，旨在豐富硬骨魚(yú)類(lèi)IL-22研究?jī)?nèi)容。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

854 尾體質(zhì)量為（200±20）g 的健康斑點(diǎn)叉尾鮰購(gòu)自武漢白沙洲水產(chǎn)品大市場(chǎng)，于養(yǎng)殖箱中暫養(yǎng)1周，水溫（25±1）℃，養(yǎng)殖用水充分曝氣，每天清污換水，試驗(yàn)期間不投喂。魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）和海豚鏈球菌（Streptococcus iniae）菌種均為西北農(nóng)林科技大學(xué)王二龍副教授贈(zèng)送；斑點(diǎn)叉尾鮰病毒（channel catfish virus，CCV）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)袁軍法副教授贈(zèng)送；腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI）購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），聚肌胞苷酸（polyinosinic-polycytidylic acid，Poly（I：C）），植物血球凝集素（phytohaemagglutinin，PHA）、佛波酯（phorbol ester，PMA）和溴氰菊酯均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。斑點(diǎn)叉尾鮰腎細(xì)胞（channel catfish kidney cells，CCK）由上海海洋大學(xué)國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)贈(zèng)送。pMD19-T 和DH5α 購(gòu)自TaKaRa 寶生物工程（大連）有限公司。TRIzol Reagent 購(gòu)自 Invitrogen 公司，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量（qRT-PCR）試劑盒均購(gòu)自上?；哿枭锛夹g(shù)有限公司。

1.2 白介素-22 CDS區(qū)克隆

根據(jù)NCBI中斑點(diǎn)叉尾鮰白細(xì)胞介素-22的預(yù)測(cè)序列（NCBI 登錄號(hào)為XM_017494747.1）設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。以斑點(diǎn)叉尾鮰脾臟的cDNA 為模板，進(jìn)行IL-22序列擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 80 s，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸15 min。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證片段大小，割膠回收，將膠回收產(chǎn)物與pMD19-T 載體（TaKaRa）連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂平板，挑取陽(yáng)性克隆培養(yǎng)10 h 后送武漢天一輝遠(yuǎn)生物公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3 氨基酸序列分析

測(cè)序結(jié)果通過(guò)Nucleotide BLAST：Search nucleotide databases using a nucleotide query（nih.gov）進(jìn)行序列Blast 比對(duì)，通過(guò)ORF Finder（Home -ORFfinder-NCBI（nih.gov））查找開(kāi)放閱讀框，采用ExPASy -ProtParam tool 預(yù)測(cè)氨基酸序列分子質(zhì)量和等電點(diǎn)，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過(guò)https：//predictprotein.org/完成，多序列比對(duì)和美化通過(guò)DNAMAN和 GeneDoc 軟件，用 http：//130.88.97.239/cgi-bin/dbbrowser/fingerPRINTScan/FPScan_fam.cgi 查找所歸屬家族特征，通過(guò)MEGA 5.0 構(gòu)建IL-22 的氨基酸序列N-J（neighbor-joining，NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 IL-22組織表達(dá)分布

用MS-222 麻醉斑點(diǎn)叉尾鮰后，無(wú)菌條件下取后腸、中腎、頭腎、皮膚、肌肉、鰓、性腺、肝臟、脾臟和心臟10 個(gè)組織，迅速放于含1 mL TRIzol 溶液的無(wú)RNA酶EP管中，設(shè)置4個(gè)平行組，每組只包含1尾斑點(diǎn)叉尾鮰相應(yīng)組織樣品。隨后將樣品用組織勻漿儀于4 ℃破碎，以氯仿抽提法獲取各組織總RNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)完整性，微量分光光度計(jì)進(jìn)行純度檢測(cè)合格的RNA 樣品，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)成cDNA 后用于熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)。采用QuantStudioTMDesign & Analysis Software 3.0 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)結(jié)合2×SYBR qPCR Mixture（HLINGENE）檢測(cè)不同組織樣品中IL-22的mRNA表達(dá)量。以斑點(diǎn)叉尾鮰EF-1α作為內(nèi)參基因，每個(gè)樣品進(jìn)行3 個(gè)操作重復(fù)，引物見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)體系10 μL 包括 5 μL 2× SYBR qPCR Mixture，4.5 μL cDNA 模板，0.25 μL 引物。PCR 程序：94 ℃ 2 min，94 ℃ 12 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 25 s，共 40 個(gè)循環(huán)。結(jié)果采用2-△△Ct法分析。

1.5 不同免疫刺激劑誘導(dǎo)CCK 細(xì)胞后IL-22 表達(dá)分析

取出液氮中凍存的CCK 細(xì)胞，放置37 ℃水浴鍋中解凍90 s 后快速將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5 mL 10%FBS 和1%雙抗的M199 培養(yǎng)基（25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶）中，在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，次日更換1次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至細(xì)胞數(shù)為5×106/mL 時(shí)，消化。用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度至每孔細(xì)胞約106個(gè)，每孔2 mL，鋪滿6 孔板。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，用LPS（50 μg/mL）、Poly（I：C）（50 μg/mL）、PHA（10 μg/mL）、PMA（0.5 μg/mL）分別刺激細(xì)胞，用同等劑量的PBS刺激CCK做對(duì)照，每個(gè)處理4個(gè)平行。每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)都設(shè)置相應(yīng)對(duì)照組，分別于刺激后0、24 和48 h 收集細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基，加入1 mL TRIzol 反復(fù)吹打裂解細(xì)胞后，快速保存于-80 ℃，RNA 提取方法、質(zhì)量檢測(cè)及表達(dá)量檢測(cè)同本文材料與方法“1.4”。

1.6 細(xì)菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰后IL-22表達(dá)分析

取出-80 ℃保存的魯氏耶爾森氏菌菌種，待其解凍后取200 μL 放入腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基中，28 ℃震蕩培養(yǎng) 18 h 后，3 000 r/min 離心 5 min，棄去培養(yǎng)液并用PBS 洗滌2 次。加入2 mL PBS 重懸細(xì)菌，以10-1為單位依次用PBS 稀釋。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)最終選取稀釋至10-3的菌液，終濃度為1.5×107CFU/mL，該濃度能導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰感染且不致死。將180 尾規(guī)格一致且健康的斑點(diǎn)叉尾鮰隨機(jī)分為2組（對(duì)照組和魯氏耶爾森氏菌注射組）。實(shí)驗(yàn)組斑點(diǎn)叉尾鮰腹腔注射200 μL 魯氏耶爾森氏菌（1.5×107CFU/mL），每個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的對(duì)照組均注射等劑量PBS。注射后6、12、24和48 h取樣，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各取4個(gè)平行。MS-222將斑點(diǎn)叉尾鮰麻醉后分別取鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織，放于TRIzol溶液中，待組織充分破碎后，暫存于-80 ℃。RNA 提取方法、質(zhì)量檢測(cè)及表達(dá)量檢測(cè)同本文“1.4”。海豚鏈球菌注射實(shí)驗(yàn)參照魯氏耶爾森氏菌注射實(shí)驗(yàn)進(jìn)行。

1.7 病毒感染斑點(diǎn)叉尾鮰后IL-22表達(dá)分析

斑點(diǎn)叉尾鮰腎細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)詳見(jiàn)本文材料與方法“1.5”。顯微鏡下觀察到6孔板中平鋪單層對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CCK后，接種CCV。待其在28 ℃成功吸附2 h后，棄去未吸附病毒懸液，再用無(wú)菌PBS洗滌3次后，加入含5% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。顯微鏡下觀察，待細(xì)胞培養(yǎng)瓶中90%細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）后收毒，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?94尾斑點(diǎn)叉尾鮰均分為2 組，實(shí)驗(yàn)組腹腔注射80 μL CCV，對(duì)照組注射等體積DMEM 處理。每個(gè)采樣時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各取4 個(gè)平行。感染后1、3 和5 d 分別取鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織并放于TRIzol 溶液中，待組織充分破碎后，暫存于-80 ℃。RNA 提取方法、質(zhì)量檢測(cè)及表達(dá)量檢測(cè)同本文“1.4”。

1.8 農(nóng)藥刺激斑點(diǎn)叉尾鮰后IL-22表達(dá)分析

將300 尾斑點(diǎn)叉尾鮰隨機(jī)均分為3 組，對(duì)照組養(yǎng)殖用水為充分曝氣自來(lái)水，試驗(yàn)組為溴氰菊酯浸泡低質(zhì)量濃度組（0.5 μg/L）、高質(zhì)量濃度組（5 μg/L）。浸泡期間時(shí)刻觀察魚(yú)體狀態(tài)。取樣時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)應(yīng)對(duì)照組隨機(jī)選4 尾進(jìn)行取樣。取樣前先用MS-222麻醉魚(yú)體，剪刀無(wú)菌處理后剪斷鰓弓放血處死，迅速取鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織。置于含1 mL TRIzol溶液的無(wú)菌無(wú)酶EP管中，4 ℃充分破碎后，-80 ℃暫存，RNA 提取方法、質(zhì)量檢測(cè)及表達(dá)量檢測(cè)同本文“1.4”。

1.9 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用SPSS 25.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析以及t檢驗(yàn)，采用Prism8.0 作圖，P＜0.05 表示數(shù)據(jù)顯著相關(guān)，P＜0.01表示數(shù)據(jù)具極顯著相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 IL-22 CDS區(qū)克隆與多序列比對(duì)分析

對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得IL-22CDS 區(qū)534 bp，前18 個(gè)氨基酸殘基為預(yù)測(cè)的信號(hào)肽（MNCAVLAVLVVLCCCCAL），編碼 177 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量20.07 ku，理論等電點(diǎn)7.06。該序列含有IL-10 家族的特征序列（NNTKAQNKAIGETDILF）（圖1）。

圖1 斑點(diǎn)叉尾鮰核苷酸及預(yù)測(cè)氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and predicted amino acid sequence of channel catfish

斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22和其他物種IL-22氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果（圖 2）顯示，該序列含有 6 個(gè)α 螺旋，4 個(gè)保守的半胱氨酸殘基，分別位于118、119、166 和215位。118 位和 166 位，119 位和 215 位分別形成 2 個(gè)二硫鍵。

圖2 斑點(diǎn)叉尾鮰與其他物種IL-22氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignments of I.punctatus with other known IL-22 amino acids sequences

2.2 序列相似性和進(jìn)化分析

IL-22 氨基酸序列與硬骨魚(yú)類(lèi)、哺乳動(dòng)物、飛禽和兩棲類(lèi)共14種脊椎動(dòng)物的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示具有一定的保守性。斑點(diǎn)叉尾鮰與黑鮰（Ameiurus melas）IL-22 氨基酸序列一致性高達(dá)95.48%；與條紋鯰（Pangasianodon hypophthalmus）一致性為88.7%，與巨魾（Bagarius yarrelli）一致性為85.88%。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，硬骨魚(yú)類(lèi)的IL-22 各自聚為一支；飛禽、哺乳類(lèi)、兩棲類(lèi)各聚為一支（圖3）；其中斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22 與條紋鯰和黑鮰親緣關(guān)系最近。如圖4所示，從進(jìn)化結(jié)果看，IL-22 位于 IL-26 和 MDM1 之間，并與IFN-γ 共線。整體分析看來(lái)，從哺乳動(dòng)物人（Homo sapiens）、禽類(lèi)雞（Gallus gallus）、兩棲類(lèi)中華鱉（Pelodiscus sinensis），一直到脊椎動(dòng)物斑馬魚(yú)、斑點(diǎn)叉尾鮰，序列相似性和進(jìn)化分析充分體現(xiàn)了不同物種的IL-22基因在進(jìn)化過(guò)程中的保守性。

圖3 IL-22氨基酸系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（NJ）Fig.3 The phylogenetic trees of IL-22 amino acids sequences（Neighbor-joining）

圖4 基因同線性Fig.4 Genetic synteny

2.3 IL-22 的組織分布表達(dá)分析

qRT-PCR 檢測(cè)IL-22在斑點(diǎn)叉尾鮰各個(gè)組織中表達(dá)量的結(jié)果顯示，IL-22廣泛分布于后腸、中腎、皮膚、頭腎、肌肉、鰓、性腺、肝臟、脾臟和心臟中。其中后腸中IL-22表達(dá)量最高，其次是中腎，脾臟和心臟中表達(dá)量較低（圖5）。

圖5 斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22的組織分布Fig.5 The distribution of IL-22 mRNA in I.punctatus

2.4 不同誘導(dǎo)模式下IL-22的表達(dá)狀況

1）IL-22在 CCK 中的表達(dá)。如圖6 所示，Poly（I：C）和LPS 刺激斑點(diǎn)叉尾鮰腎細(xì)胞后24～48 hIL-22持續(xù)上調(diào)，LPS刺激后IL-22mRNA 表達(dá)量呈逐漸上升趨勢(shì)。斑點(diǎn)叉尾鮰腎細(xì)胞在PHA 和PMA 刺激下24～48 h表達(dá)量持續(xù)下調(diào)，顯著低于正常表達(dá)水平。

圖6 不同誘導(dǎo)下IL-22在CCK中相對(duì)表達(dá)圖譜Fig.6 The relative expression profile of IL-22 in CCK under different induction

2）微生物脅迫下IL-22的表達(dá)變化。（1）魯氏耶爾森氏菌感染魚(yú)體后IL-22的表達(dá)變化。隨著感染時(shí)間的變化，魯氏耶爾森氏菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰后6～48 h內(nèi)在鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織中IL-22mRNA 表達(dá)量整體呈上調(diào)狀態(tài)，鰓中IL-22表達(dá)量下調(diào)。鰓中表達(dá)量于24 h 達(dá)峰值，隨后下降。后腸中IL-22整體呈升高趨勢(shì)，48 h 檢測(cè)到表達(dá)量最高。脾臟表現(xiàn)為急性期6 h 瞬時(shí)上調(diào)應(yīng)答，但整體呈下降趨勢(shì)。中腎和頭腎中IL-22整體呈上調(diào)變化，12 h達(dá)峰值（圖7 A（e）和（f））。

（2）海豚鏈球菌感染魚(yú)體后IL-22的表達(dá)變化。海豚鏈球菌感染斑點(diǎn)叉尾鮰48 h 內(nèi)IL-22動(dòng)態(tài)表達(dá)譜如圖7B 所示。皮膚、后腸、脾臟和頭腎中IL-22表達(dá)量均于48 h 達(dá)最高值，整體呈持續(xù)上升。感染后24 h，中腎中表達(dá)量最高，整體呈先升高后下降趨勢(shì)。6～48 h內(nèi)鰓中IL-22表達(dá)量下調(diào)。

（3）CCV 感染魚(yú)體后IL-22的表達(dá)變化。對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行攻毒后第1 天，鰓、脾臟和頭腎中IL-22mRNA 表達(dá)量均達(dá)到峰值，且表現(xiàn)為逐漸下降，1～3 d 持續(xù)性上調(diào)變化。CCV 感染后，后腸中IL-22表達(dá)量變化趨勢(shì)先下降后上升，第5 天表達(dá)量最高。中腎中IL-22表達(dá)量第1 天上調(diào)后，隨攻毒時(shí)間發(fā)展（3～5 d）均下調(diào)（圖7 C（e））。

（4）溴氰菊酯浸泡魚(yú)體后IL-22的表達(dá)變化。如圖7 D 所示，溴氰菊酯浸泡后斑點(diǎn)叉尾鮰鰓中持續(xù)下調(diào)反應(yīng)，皮膚、后腸、中腎和頭腎均表現(xiàn)為低濃度IL-22mRNA 表達(dá)量上升，高濃度下降，持續(xù)上調(diào)應(yīng)答。脾臟則表現(xiàn)為逐漸上調(diào)變化，高濃度刺激后表達(dá)量為對(duì)照組2.2倍。

圖7 不同刺激下IL-22在魚(yú)體中mRNA表達(dá)分析Fig.7 The mRNA expression analysis of IL-22 in channel fish under different stimulate

3 討 論

IL-22 作為IL-10 家族的一員，在免疫反應(yīng)中常發(fā)揮重要作用。qRT-PCR結(jié)果顯示，IL-22基因在斑點(diǎn)叉尾鮰多種組織中均有表達(dá)。這種表達(dá)模式存在物種間宿主差異。在草魚(yú)中，IL-22 主要分布于鰓和后腸［13］；在黃顙魚(yú)鰭條、鰓和皮膚黏液中表達(dá)較高［11］；而鱖中鰓、幽門(mén)盲囊分布較多［14］。虹鱒中腸道表達(dá)量最高，其次是尾鰭、鰓和性腺［9］。本研究顯示IL-22主要分布在斑點(diǎn)叉尾鮰的后腸和中腎，心臟中最少。這些結(jié)果表明IL-22 主要表達(dá)于黏膜免疫組織或一些系統(tǒng)性免疫器官中。

IL-22 的有效誘導(dǎo)通常體現(xiàn)在細(xì)菌、病毒以及一些外源誘導(dǎo)下魚(yú)的黏膜組織和相關(guān)免疫器官中IL-22mRNA 表達(dá)水平的上調(diào)［11，14-15］。這與本試驗(yàn)中魯氏耶爾森氏菌和海豚鏈球菌、CCV 感染斑點(diǎn)叉尾鮰以及溴氰菊酯浸泡斑點(diǎn)叉尾鮰后IL-22mRNA 表達(dá)量上調(diào)一致，不同的是海豚鏈球菌和CCV 感染后鰓和皮膚中呈現(xiàn)下調(diào)，究其原因可能是免疫細(xì)胞遷移的結(jié)果。魯氏爾森氏菌感染后斑點(diǎn)叉尾鮰脾臟6 h響應(yīng)最激烈，隨后是鰓24 h，后腸48 h。符合其致病機(jī)制中早期階段先通過(guò)鰓和胃腸道上皮細(xì)胞侵入，隨后經(jīng)血液循環(huán)，加速病原擴(kuò)散，進(jìn)一步感染免疫器官，最后全面攻擊免疫系統(tǒng)的規(guī)律［16］。海豚鏈球菌攻擊斑點(diǎn)叉尾鮰后，皮膚、后腸、脾臟和頭腎IL-22mRNA 表達(dá)量于48 h 達(dá)到峰值，隨后恢復(fù)正常水平。中腎于24 h 達(dá)到峰值后下降。類(lèi)似的結(jié)果出現(xiàn)在無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae）刺激鮻魚(yú)（Liza haematocheila）后，其腎臟、脾臟和腸中IL-22均上調(diào)約5 倍［17］。從某種角度反映出革蘭陽(yáng)性菌刺激宿主后短時(shí)間內(nèi)細(xì)菌持續(xù)復(fù)制，機(jī)體強(qiáng)烈的反應(yīng)導(dǎo)致IL-22分泌量大幅上調(diào)。這可能與海豚鏈球菌粘附侵入、破壞上皮細(xì)胞后經(jīng)巨噬細(xì)胞內(nèi)化快速傳播至整個(gè)魚(yú)體有關(guān)［18］。斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)病后期體表大面積彌漫性出血，內(nèi)臟明顯腫脹，推測(cè)IL-22分泌量與組織的健康狀況呈正相關(guān)，一定程度上IL-22 可成為健康狀態(tài)的評(píng)判指標(biāo)。低濃度溴氰菊酯浸泡斑點(diǎn)叉尾鮰后大部分組織IL-22呈現(xiàn)高表達(dá)，高濃度下則相反。當(dāng)斑點(diǎn)叉尾鮰暴露于合適濃度溴氰菊酯下時(shí)，游離氨基酸上升促進(jìn)了應(yīng)答時(shí)能量的供應(yīng)［19-20］，故也很可能對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生激活作用。此外，鰓中表達(dá)量的下調(diào)可能是免疫細(xì)胞特別是黏膜組織的損傷，抑制表達(dá)的結(jié)果。研究表明溴氰菊酯能導(dǎo)致魚(yú)鰓上皮細(xì)胞的病變［21-22］，溴氰菊酯作為一種殺蟲(chóng)劑主要攻擊機(jī)體的呼吸系統(tǒng)，鰓中IL-22下調(diào)極可能是由此引發(fā)。

受 Poly（I：C）和 LPS 刺 激 后 CCK 中IL-22mRNA 表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，能促使非特異性免疫得到一定程度的刺激［23］。已證實(shí)PHA和100 ng/mL PMA刺激大菱鲆頭腎細(xì)胞、虹鱒脾細(xì)胞3～24 h持續(xù)高表達(dá)［9-10］，而本研究中 0.5 μg/mL PMA 作用于斑點(diǎn)叉尾鮰腎細(xì)胞后表達(dá)下調(diào)。PMA 和PHA 都是T細(xì)胞誘導(dǎo)劑，同時(shí)PMA 也可作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的刺激因子，刺激相關(guān)細(xì)胞因子間接促進(jìn)IL-22的表達(dá)［10］。本研究中24～48 h 內(nèi)PHA 和PMA 刺激斑點(diǎn)叉尾鮰腎細(xì)胞后IL-22均顯示下調(diào)反應(yīng)，這可能是觀察時(shí)間不同所造成的。此外不同濃度的PMA 對(duì)于細(xì)胞本身的誘導(dǎo)程度也有區(qū)別。

斑點(diǎn)叉尾鮰在不同誘導(dǎo)模式下，腸道、脾臟、中腎和頭腎中IL-22均上調(diào)表達(dá)。此外，由于本試驗(yàn)中細(xì)菌和病毒是腹腔注射的，此感染模式下可能存在部分黏膜組織應(yīng)答的延遲，亦導(dǎo)致鰓和皮膚不同刺激下IL-22表達(dá)的不穩(wěn)定。從免疫學(xué)的角度上看，T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞存在于魚(yú)的腸道中［24］，腸道可能是病原體的入口［25］，通過(guò)白細(xì)胞浸潤(rùn)促使IL-22的分泌，從而抑制腸道炎癥［26-27］。免疫器官脾臟、中腎和頭腎在細(xì)菌和病毒入侵后刺激免疫細(xì)胞遷移，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。

綜上，本試驗(yàn)獲得的斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22 氨基酸序列在進(jìn)化上高度保守，IL-22在斑點(diǎn)叉尾鮰各檢測(cè)組織中均表達(dá)并且能夠參與不同誘導(dǎo)下鰓、皮膚、后腸、脾臟、中腎和頭腎組織以及CCK 中的免疫響應(yīng)，不同誘導(dǎo)下不同組織中表達(dá)模式存在差異，推測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰IL-22基因參與抗病原免疫反應(yīng)。