周 文,廖 濤,朱子健,白 嬋,王炬光,熊光權(quán),柴 毅
(1 長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434023;2 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所,農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品冷鏈物流技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢 430064)
在各種水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中,麻醉已被廣泛證明是減少各種水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中應(yīng)激或物理?yè)p傷的有效方法[1-3]。麻醉通常由化學(xué)藥劑或物理方法誘導(dǎo),首先引起鎮(zhèn)靜效果,其次是產(chǎn)生麻醉效果(失去活動(dòng)能力、平衡能力和意識(shí))[4]。
目前,已有多種化學(xué)或者物理的方法可用于魚類麻醉,然而,不同方法對(duì)不同魚類的麻醉效果不同,其通常受到藥劑種類、濃度,動(dòng)物的大小以及環(huán)境因素(溫度、pH)影響[15-16]。恰當(dāng)?shù)穆樽砜梢詫?yīng)激對(duì)魚類的有害影響降到最低[17]。因此,每個(gè)物種都需要選擇合適的麻醉方式,制定合適的麻醉方案以減少運(yùn)輸過(guò)程中的有害影響[18]。
黃顙魚(Tachysurusfulvidraco)是中國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)淡水魚類之一,由于“全雄1號(hào)”和雜交黃顙魚“黃油1號(hào)”兩個(gè)審定新品種的推廣,顯著促進(jìn)了水產(chǎn)生產(chǎn)和消費(fèi)的增加,黃顙魚被認(rèn)為是未來(lái)20年水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量將超過(guò)100萬(wàn)t的僅有的兩種特殊魚類之一(另一種是大嘴鱸魚)[19-20]。此外,黃顙魚鮮美的肉質(zhì)和較高的市場(chǎng)價(jià)值,使其在日本、韓國(guó)、東南亞有廣闊的市場(chǎng)前景[21]。遺憾的是,目前沒(méi)有看到相關(guān)文獻(xiàn)評(píng)價(jià)多種麻醉方式對(duì)黃顙魚的麻醉效果以及達(dá)到麻醉狀態(tài)后持續(xù)麻醉所造成的應(yīng)激相關(guān)研究。
本研究評(píng)估了茶樹精油、低溫麻醉、電麻醉對(duì)經(jīng)過(guò)不同溫度暫養(yǎng)以及不同體質(zhì)量黃顙魚的麻醉效果,同時(shí)還研究了麻醉時(shí)長(zhǎng)對(duì)黃顙魚應(yīng)激的影響。
本研究使用的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)來(lái)自中國(guó)湖北省洪湖市水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)(氣溫約30℃)。包括兩種大?。后w質(zhì)量100.58±3.13 g 、體長(zhǎng)20.5±0.32 cm;體質(zhì)量157.35 g±7.16、體長(zhǎng)25.33±0.51 cm。試驗(yàn)前,魚被放在室內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)中(氣溫22℃)飼喂7 d以適應(yīng)試驗(yàn)條件(黃顙魚專用飼料購(gòu)買至通威)。每個(gè)養(yǎng)殖桶都有相同數(shù)量的魚,分別在兩種水溫下暫養(yǎng):17℃和24℃,其他生活條件一致。養(yǎng)殖水質(zhì)如下:溶氧、pH分別為6.80±0.14 mg/L和7.15±0.07。光暗周期為12 h:12 h(08:00—20:00)。試驗(yàn)期間沒(méi)有魚死亡,并且在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前24 h暫停飼喂,以清空魚消化道。
茶樹精油(Tea oilMelaleucaalternifolia,藥用級(jí))、無(wú)水乙醇購(gòu)買至阿拉丁試劑網(wǎng)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);皮質(zhì)醇、葡萄糖測(cè)定都采用商業(yè)試劑盒(南京建成生物工程研究所,中國(guó));A-BF高精度線性電源,東莞市不凡電子有限公司;3K15離心機(jī),美國(guó)Sigma-Aldric公司;酶標(biāo)儀SPARK,瑞士Tecan 公司;ISO 900電子分析天平,德國(guó)Sartorius 公司;hq40 哈希HACH便攜式雙路輸入多參數(shù)數(shù)字化分析儀,哈希水質(zhì)分析儀器(上海)有限公司。
總共25條黃顙魚(157.35±7.16 g;25.33±0.51 cm)被平均分到5個(gè)溫度的循環(huán)系統(tǒng)中(7.7、12.5、17.2、20.3、24.1℃,實(shí)際溫度)。暫養(yǎng)7 d后,黃顙魚經(jīng)過(guò)低溫被誘導(dǎo)深度麻醉,緊接著被采集血液進(jìn)行皮質(zhì)醇和葡萄糖測(cè)定。小循環(huán)系統(tǒng)如圖1a所示。
圖1 低溫麻醉系統(tǒng)(a)以及電麻醉系統(tǒng)(b)
總共408條黃顙魚被用于麻醉效果測(cè)試,它們被分為4組,包括2種大小(100.58±3.13 g 、20.5±0.32 cm;157.35±7.16 g、25.33±0.51 cm)和2種暫養(yǎng)溫度(17℃、24℃)。4組(不同大小×不同溫度暫養(yǎng))黃顙魚都被用于3種麻醉方式測(cè)試(茶樹精油、電麻醉、低溫麻醉)。每一條黃顙魚被完全浸沒(méi)在含有40 L溶液的塑料箱(體積100 L)中觀察15 min,整個(gè)暴露過(guò)程持續(xù)充氣,15 min后魚被取出放到80 L的清水中復(fù)蘇,并記錄麻醉時(shí)間、恢復(fù)時(shí)間。所有經(jīng)過(guò)麻醉實(shí)驗(yàn)的黃顙魚都被保留到原來(lái)的暫養(yǎng)水箱中,觀測(cè)3 d內(nèi)的存活情況。黃顙魚麻醉分期判斷標(biāo)準(zhǔn)如表1所示,改編自Mirghaed 等[22]。麻醉試驗(yàn)水質(zhì)條件如表2所示,麻醉的水溫和暫養(yǎng)溫度保持一致,暫養(yǎng)水溫來(lái)源于1.3節(jié)的結(jié)果。
其中244條黃顙魚被用于茶樹精油測(cè)試,黃顙魚(n=6)暴露于含有16個(gè)不同質(zhì)量濃度的茶樹精油的溶液中(40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190 mg/L)。茶樹精油溶液由準(zhǔn)確稱重的茶樹精油母液(茶樹精油:無(wú)水乙醇為1∶9)均勻混合到40 L水中配置而成。
144條黃顙魚被用于電麻醉測(cè)試,黃顙魚(n=6)暴露于不同電流強(qiáng)度的自制麻醉系統(tǒng)中(0.18、0.2、0.24、0.26、0.28、0.30 A,30 V)。電麻醉裝置如圖1b所示。
20條黃顙魚被用于低溫麻醉測(cè)試,所有的黃顙魚都經(jīng)過(guò)同樣的降溫程序:當(dāng)水溫>10℃時(shí),降溫速率為5℃/h;當(dāng)水溫<10℃時(shí),降溫速率為1℃/h。每5條黃顙魚被用于每個(gè)麻醉狀態(tài)測(cè)試(4個(gè)狀態(tài),從輕度鎮(zhèn)靜到深度麻醉),每條黃顙魚的誘導(dǎo)水溫被記錄,隨后被取出放入暫養(yǎng)水缸中復(fù)蘇并記錄復(fù)蘇時(shí)間。
總共85條在24℃暫養(yǎng)7 d后的黃顙魚(157.35±7.16 g;25.33±0.51 cm)被用于應(yīng)激測(cè)試。其中75條黃顙魚被誘導(dǎo)深度麻醉,并在達(dá)到麻醉后(3 min)第0、2、4、6、8 分鐘被采集血液進(jìn)行皮質(zhì)醇和葡萄糖分析。3種麻醉方式條件分別如下:茶樹精油的質(zhì)量濃度為190 mg/L;電麻醉的電流和電壓為0.30A和30V;低溫麻醉的溫度為8℃。
此外,提供一個(gè)非應(yīng)激組(基線組)和過(guò)應(yīng)激組的血糖和血漿皮質(zhì)醇水平,作為麻醉期間應(yīng)激水平的比較。5條未處理的黃顙魚被殺死作為基線組;5條遭受巨大應(yīng)激的黃顙魚作為過(guò)應(yīng)激組黃顙魚被暴露在高速流動(dòng)的水流中,直到對(duì)尾部按壓不會(huì)爆發(fā)游泳并且在取樣前保持30 min[13]。
用非肝素化注射器采集血樣,血樣在25℃靜置1 h后經(jīng)過(guò)離心(4℃,4 000 r/min,15 min,離心半徑13.5 cm)后取上清液,在-80℃冰箱中保存直到測(cè)定應(yīng)激指標(biāo)。選取皮質(zhì)醇和葡萄糖作為應(yīng)激指標(biāo),用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清皮質(zhì)醇水平。采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定血清葡萄糖質(zhì)量濃度。
使用 Microsoft Excel 2019 和用 Graphpad Prism9軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。對(duì)所有結(jié)果進(jìn)行雙因素方差分析(Two-Way ANOVA),并作Tukey多重比較檢驗(yàn),以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。所有結(jié)果以箱線圖表示,箱線圖上限為最高值,下限為最低值,中間線為中位數(shù)。
表1 黃顙魚麻醉分期
表2所示的水質(zhì)結(jié)果顯示,茶樹精油、電麻醉、低溫麻醉不會(huì)造成水質(zhì)的劇烈變化,并且3種麻醉方式不會(huì)使魚死亡。
表2 麻醉過(guò)程中水質(zhì)情況以及存活率
如圖2所示,暫養(yǎng)溫度影響黃顙魚麻醉后的皮質(zhì)醇和葡萄糖水平。經(jīng)過(guò)17.2℃暫養(yǎng)的黃顙魚皮質(zhì)醇水平最低,而葡萄糖水平最高,意味著17.2℃是最佳的暫養(yǎng)溫度。此外,黃顙魚在7.7℃被麻醉,因此沒(méi)有暫養(yǎng)7 d后的數(shù)值。
圖2 不同溫度暫養(yǎng)7 d后經(jīng)低溫麻醉后黃顙魚的皮質(zhì)醇(a)和葡萄糖(b)含量
如圖3所示,茶樹精油的質(zhì)量濃度和不同的組別對(duì)黃顙魚的麻醉以及恢復(fù)時(shí)間有顯著影響(P<0.05)。隨著茶樹精油質(zhì)量濃度升高,黃顙魚的麻醉程度加深,誘導(dǎo)時(shí)間變短,恢復(fù)時(shí)間增加。在17℃時(shí),小個(gè)體的黃顙魚深度麻醉最佳質(zhì)量濃度為130 mg/L而大的黃顙魚為190 mg/L;在24℃時(shí),小個(gè)體黃顙魚深度麻醉最佳質(zhì)量濃度為120 mg/L,大個(gè)體最佳為130 mg/L;它們對(duì)應(yīng)的恢復(fù)時(shí)間分別為:193.25±36.99 s、140.25±29.94 s、174.25±8.44 s、211.75±10.89 s。在面對(duì)茶樹精油時(shí),黃顙魚個(gè)體越大所需質(zhì)量濃度以及時(shí)間更長(zhǎng),相反,暫養(yǎng)溫度越高,黃顙魚所需質(zhì)量濃度以及時(shí)間更短。此外,研究發(fā)現(xiàn)較高溫度暫養(yǎng)能夠減少不同體質(zhì)量黃顙魚所需的茶樹精油質(zhì)量濃度差(從60 mg/L下降到10 mg/L),這可能使不同體質(zhì)量的黃顙魚在較短的時(shí)間內(nèi)同時(shí)達(dá)到所需的麻醉狀態(tài)。
圖3 不同大小和不同暫養(yǎng)溫度的黃顙魚在接觸不同質(zhì)量濃度的茶樹精油時(shí)的麻醉和恢復(fù)時(shí)間
如圖4所示,電流大小和不同的組別對(duì)黃顙魚的麻醉時(shí)間有顯著影響(P<0.05),而恢復(fù)時(shí)間沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。隨著電流大小升高,黃顙魚的麻醉程度加深,誘導(dǎo)時(shí)間變短。在17℃時(shí),小規(guī)格的黃顙魚深度麻醉最佳電流為0.30 A,而大規(guī)格的黃顙魚所需電流>0.30 A;在24℃時(shí),兩種個(gè)體的黃顙魚深度麻醉最佳電流為0.30 A;黃顙魚在0.30 A的恢復(fù)時(shí)間分別為:173.50±17.10 s、177.25±5.40 s、171.75±8.93 s、165.5±11.01 s。在面對(duì)電麻醉時(shí),黃顙魚個(gè)體越大、暫養(yǎng)溫度越低所需電流更大,但是他們的恢復(fù)時(shí)間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。水中電擊需要調(diào)整電流強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間和頻率,以達(dá)到預(yù)期效果。表3列舉了最近有關(guān)電麻醉的研究,由于電麻醉?xiàng)l件不同,這些結(jié)果很難進(jìn)行比較,但是大部分研究都顯示了一個(gè)短暫的麻醉時(shí)間。
圖4 不同大小和不同溫度暫養(yǎng)黃顙魚在接觸不同電流后的麻醉(a-d)和恢復(fù)時(shí)間(e)
表3 本研究和先前的研究在電麻醉效果之間的比較
如表4所示,不同的組別對(duì)黃顙魚的低溫麻醉麻醉溫度和恢復(fù)時(shí)間有顯著影響(P<0.05)。不同處理黃顙魚的低溫麻醉區(qū)間在6~10℃,并且,隨著暫養(yǎng)溫度降低以及個(gè)體增大,黃顙魚的低溫麻醉區(qū)間更低。24℃暫養(yǎng)大個(gè)體、24℃暫養(yǎng)小個(gè)體、17℃暫養(yǎng)大個(gè)體、17℃暫養(yǎng)小個(gè)體深度麻醉溫度分別為:8.22、8.83、6.26、7.23℃;它們對(duì)應(yīng)的恢復(fù)時(shí)間分別為:254.50±5.02 s、216.5±7.23 s、278.25±13.16 s、254.25±5.07 s。
表4 低溫麻醉對(duì)不同大小和不同暫養(yǎng)溫度黃顙魚的麻醉誘導(dǎo)溫度以及對(duì)應(yīng)的恢復(fù)時(shí)間
如圖5所示,不同的麻醉方式對(duì)皮質(zhì)醇水平有顯著性差異(P<0.05),而對(duì)葡萄糖水平?jīng)]有顯著性差異(P>0.05),麻醉的時(shí)間對(duì)皮質(zhì)醇和葡萄糖水平都沒(méi)有顯著性差異(P>0.05),但是,不同的麻醉方式和麻醉時(shí)間的相互作用對(duì)皮質(zhì)醇水平有顯著性差異(P<0.05)。在本研究中,3種麻醉方式的皮質(zhì)醇和葡萄糖水平隨著麻醉時(shí)間增加有一個(gè)略微增加的趨勢(shì),但是低溫麻醉一直保持最低的皮質(zhì)醇和葡萄糖水平。電麻醉的皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度在9 min時(shí)顯著升高(P<0.05),茶樹精油則變化不大,而低溫麻醉在麻醉11 min時(shí)顯著降低(P<0.05)。此外,電麻醉的葡萄糖水平在11 min時(shí)顯著高于低溫麻醉(P<0.05)。
圖5 3種麻醉方式持續(xù)麻醉過(guò)程中皮質(zhì)醇和葡萄糖水平變化
3種麻醉方式都能用于黃顙魚的麻醉,并且所有麻醉后的魚都能正常生存。鑒于不同目的需要不同深度的麻醉(例如:有水運(yùn)輸通常使魚鎮(zhèn)靜,而手術(shù)、無(wú)水運(yùn)輸通常使魚麻醉),本試驗(yàn)記錄了輕度鎮(zhèn)靜、深度鎮(zhèn)靜、輕度麻醉、深度麻醉所需的誘導(dǎo)時(shí)間和恢復(fù)時(shí)間,這些結(jié)果將作為黃顙魚麻醉?xiàng)l件優(yōu)化的參考。
最佳濃度是活魚運(yùn)輸研究中的最主要參數(shù),大多數(shù)研究都根據(jù)3 mim麻醉、5 min恢復(fù)的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇最佳的麻醉劑濃度、電流強(qiáng)度從而獲得最佳的麻醉效果[28]。麻醉時(shí)間以及恢復(fù)時(shí)間通常受到生物因素(物種、大小等)以及非生物(麻醉劑濃度、溫度、pH等)因素的影響。和大多數(shù)研究類似,本研究中黃顙魚的麻醉誘導(dǎo)時(shí)間和茶樹精油的質(zhì)量濃度以及電流的大小呈負(fù)相關(guān),而恢復(fù)時(shí)間則呈正相關(guān)[29-31]。
在生物因素中,物種和大小在選擇最佳質(zhì)量濃度時(shí)被廣泛考慮[32-33]。Correia等[34]發(fā)現(xiàn)深度麻醉1.03 g的黃尾小丑魚(Amphiprionclarkii)所需茶樹精油質(zhì)量濃度為200 μ/L,而深度麻醉6.60 g的銀鯰[35](Rhamdiaquelen)需要茶樹精油質(zhì)量濃度為300 μ/L,類似地,本研究茶樹精油麻醉結(jié)果顯示,兩種溫度下100.58 g的黃顙魚所需茶樹精油最佳質(zhì)量濃度都小于157.35 g的黃顙魚。以上結(jié)果似乎表明體質(zhì)量越大的魚所需的茶樹精油質(zhì)量濃度越大。與此相似,本研究電麻醉結(jié)果顯示,0.30 A的電流能夠在3 min內(nèi)麻醉100.58 g的黃顙魚卻不能麻醉157.35 g的黃顙魚。此外,Venturini等[36]研究發(fā)現(xiàn)深度麻醉498.9 g的羅非魚(Oreochromisniloticus) 需要10.8 A(205 V)的電流。電麻醉受到體質(zhì)量大小影響的變化趨勢(shì)似乎和茶樹精油一致。然而,朱挺兵[27]等報(bào)道深度麻醉359.10 g的圓口銅魚(Coreiusguichenoti)僅需要200~225 mA(30 V)的電流。電麻醉的電流大小似乎更受物種影響,因此,關(guān)于電麻醉還需要進(jìn)一步的研究才能做出準(zhǔn)確判斷。
在非生物因素中,溫度是影響麻醉劑最佳質(zhì)量濃度選取最重要的環(huán)境因素之一。先前研究表明,盡管不同物種對(duì)麻醉藥的反應(yīng)差異很大,但在較高溫度下麻醉,麻醉劑最佳質(zhì)量濃度有變小的趨勢(shì),這可能與魚類在較高的溫度下保持較高的新陳代謝和通氣率有關(guān)[37-38]。本研究發(fā)現(xiàn)相同大小黃顙魚在17℃所需茶樹精油的最佳質(zhì)量濃度更大,而電麻醉和低溫麻醉在17℃所需電流更大,溫度更低,這可能和低溫時(shí)黃顙魚的抗應(yīng)激能力以及麻醉機(jī)制有關(guān)。和先前的研究方法(直接放在不同的水溫中麻醉)相比,本研究發(fā)現(xiàn)提高暫養(yǎng)溫度不僅能降低麻醉劑最佳濃度,提升麻醉的整齊程度,而且還能消除由于溫度劇烈變化造成的應(yīng)激。目前,還沒(méi)有關(guān)于暫養(yǎng)溫度對(duì)于麻醉效果的研究,這可能是以后的一個(gè)研究方向,特別是在使用各種麻醉劑時(shí),因?yàn)闇p少麻醉劑的質(zhì)量濃度意味著更短的麻醉劑代謝時(shí)間。
總之,制定合適的麻醉方案時(shí)要充分考慮魚的種類、大小、以及溫度,簡(jiǎn)單地復(fù)制不同物種的麻醉劑使用劑量會(huì)導(dǎo)致魚類死亡或無(wú)法達(dá)到足夠高的麻醉水平。
麻醉效率在文獻(xiàn)中被廣泛報(bào)道,然而,很少有研究考慮暴露期間魚類福利[39]。盡管使用麻醉藥被認(rèn)為可以減少應(yīng)激,但不受限制的使用可能會(huì)引起更大的應(yīng)激,因?yàn)槁樽硗ㄟ^(guò)抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)降低代謝率、影響心肺動(dòng)力學(xué)和降低呼吸頻率[4,40]。
在無(wú)水?;钸\(yùn)輸過(guò)程中,魚從接觸麻醉到完成打包通常需要一個(gè)不確定的時(shí)間,魚麻醉后在麻醉液中繼續(xù)保留的時(shí)間仍然充滿爭(zhēng)議。然而,很少研究探究魚類在接觸麻醉過(guò)程中應(yīng)激的變化。Wosnick等[41]在對(duì)小鋸蓋魚 (Centropomusparallelus)的麻醉研究中發(fā)現(xiàn),小鋸蓋魚在接觸苯佐卡因7 min后皮質(zhì)醇和葡萄糖水平顯著增加,因此推薦麻醉時(shí)間為3~6 min。同樣的,本結(jié)果顯示:黃顙魚在電麻醉9 min后皮質(zhì)醇水平顯著提高,而葡萄糖水平升高顯示在11 min,這表明長(zhǎng)時(shí)間面對(duì)電流刺激會(huì)增加黃顙魚應(yīng)激,因此,本推薦黃顙魚的電麻醉時(shí)間為3~7 min。與電麻醉相反,低溫麻醉誘導(dǎo)深度麻醉的黃顙魚在11 min時(shí)皮質(zhì)醇和葡萄糖水平降低,而茶樹精油基本保持不變,這說(shuō)明在11 min內(nèi)低溫麻醉和茶樹精油沒(méi)有使黃顙魚的應(yīng)激變大。同時(shí),低溫麻醉在3種麻醉方式中對(duì)黃顙魚造成的應(yīng)激最小,暗示低溫麻醉更加適合黃顙魚的麻醉。
3種麻醉方式都能很好地麻醉黃顙魚,但是魚體大小、暫養(yǎng)溫度、麻醉方式將影響黃顙魚麻醉方案的制定;推薦電麻醉的持續(xù)時(shí)間為3~6 min,而低溫麻醉和茶樹精油為3~11 min;鑒于低溫麻醉造成的應(yīng)激最小,對(duì)規(guī)格統(tǒng)一性要求低,推薦低溫麻醉作為黃顙魚的麻醉方式。
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