基于主成分分析的不同產(chǎn)地涼粉草質(zhì)量評(píng)價(jià)

賴志明 宋曉娟 魏星任 莫穗芬 盧曉瑩 曾唯雅 嚴(yán)萍 詹若挺

摘要 [目的]利用主成分分析法對(duì)不同產(chǎn)地的涼粉草中總黃酮、總酚酸、總糖、紫云英苷、迷迭香酸、咖啡酸含量進(jìn)行評(píng)價(jià)，驗(yàn)證其含量測(cè)定方法。[方法]采用HPLC法測(cè)定涼粉草中咖啡酸、迷迭香酸、紫云英苷含量;采用紫外-可見分光光度法測(cè)定總黃酮、總酚酸和總糖的含量;對(duì)6個(gè)成分含量進(jìn)行主成分分析，評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地質(zhì)量差異。[結(jié)果]建立的含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠;主成分分析提取3個(gè)成分，累計(jì)貢獻(xiàn)率87.395%，酚酸類和黃酮類物質(zhì)對(duì)于涼粉草的質(zhì)量評(píng)價(jià)有重要貢獻(xiàn)。通過(guò)綜合評(píng)分，來(lái)自廣東平遠(yuǎn)及福建長(zhǎng)汀涼粉草質(zhì)量較好。[結(jié)論]20批不同產(chǎn)地的涼粉草質(zhì)量具有差異性，且產(chǎn)地距離較近的涼粉草表現(xiàn)出成分含量特征相似性;建立的主成分分析方法可對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行全面分析，適用于涼粉草質(zhì)量評(píng)價(jià)。

關(guān)鍵詞 涼粉草;不同產(chǎn)地;質(zhì)量評(píng)價(jià);主成分分析

中圖分類號(hào) R284.1? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2022）10-0172-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.10.039

Quality Evaluation of Mesona chinensis from Different Origins Based on Principal Component Analysis

LAI Zhi-ming1，SONG Xiao-juan2，WEI Xing-ren2 et al （1.Guangdong Nanling Pharmaceutical Co.，Ltd.，Pingyuan，Guangdong 514600;2.Research Center of Chinese Herbal Resource Science and Engineering，Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Key Laboratory of Chinese Medicinal Resource from Lingnan Guangzhou University of Chinese Medicine，Ministry of Education; Joint Laboratory of National Engineering Research Center for the Pharmaceutics of Traditional Chinese Medicines，Guangzhou，Guangdong 510006）

Abstract [Objective]The principal component analysis method was used to evaluate the contents of total flavonoids，total phenolic acids，total sugars，vetchin，rosmarinic acid and caffeic acid in Mesona chinensis from different origins，and to verify the content determination methods.[Method]The contents of caffeic acid，rosmarinic acid and vetchin in Mesona chinensis were determined by HPLC; the contents of total flavonoids，total phenolic acids and total sugars were determined by UV-VIS spectrophotometry.Principal component analysis was carried out on the content of 6 components to evaluate the quality difference between different producing areas.[Result]The established content determination method was stable and reliable.Principal component analysis extracted 3 components with a cumulative contribution rate of 87.395%.Phenolic acids and flavonoids had important contributions to the quality evaluation of Mesona chinensis.According to the comprehensive score，the quality of Mesona chinensis from Pingyuan Guangdong and Changting Fujian was better.[Conclusion]20 batches from different production regions showed variability in the quality of Mesona chinensis，and those from relatively close locations showed characteristic similarity in their compositional contents.The established PCA method can provide a comprehensive analysis of the measured indexes and is suitable for the quality evaluation of Mesona chinensis.

Key words Mesona chinensis;Different origins;Quality estimation;Principal components analysts （PCA）

基金項(xiàng)目? 廣東省普通高?！胺?wù)鄉(xiāng)村振興計(jì)劃”重點(diǎn)領(lǐng)域?qū)ｍ?xiàng)（2019KZDZX2017）;2020年省級(jí)鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略專項(xiàng)（2020KJ148）。

作者簡(jiǎn)介 賴志明（1983—），男，廣東梅州人，主管中藥師，從事中藥資源研究。通信作者，副研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量控制及活性成分研究。

收稿日期 2021-11-22;修回日期 2021-12-27

涼粉草為唇形科（Labiatae）植物涼粉草（Mesona chinensis）的全草，據(jù)《中華本草》[1]記載其具有消暑、清熱、涼血、解毒的功效，是一種制作消暑清熱飲料產(chǎn)品的重要原料。在我國(guó)浙江、江西、臺(tái)灣、廣東、廣西等地有廣泛種植，具有良好的開發(fā)前景?，F(xiàn)代研究表明，涼粉草的主要效用成分為黃酮、酚酸、多糖（涼粉草膠）等[2]。多糖在涼粉草中含量較高，是重要的生物活性成分，具有抗氧化[3]、抗肝損傷[4]、降血脂[5]等生理功能。黃酮及其苷類都具有良好的藥理作用[6-9]，含量占全草成分的5.47%～6.21%[10]，具有抗氧化[11]、抗衰老等功效，可作抗炎、抗菌、抗病毒和健胃消食類藥物的主要成分;紫云英苷即為一種常見的黃酮苷類化合物，具有抗炎作用[12]。涼粉草水溶性成分多為酚酸類化合物，HPLC指紋圖譜[13]顯示涼粉草藥材中含有咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸苷和迷迭香酸。咖啡酸具有抗氧化應(yīng)激[14]、抗菌、抗病毒和促進(jìn)血小板凝集等功效，涼粉草中單體成分以咖啡酸含量最高，乙醇萃取得涼粉草咖啡酸含量約為0.03%[15]。迷迭香早已被證明具有抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等藥理作用[16]，近年學(xué)者發(fā)現(xiàn)其還可抗肌膚光損傷[17]。目前，雖然涼粉草在多方面已有研究，但是對(duì)于其質(zhì)量控制評(píng)價(jià)系統(tǒng)仍不全面，更少有報(bào)道同時(shí)對(duì)涼粉草中多個(gè)成分進(jìn)行測(cè)定，并同時(shí)對(duì)測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，揭示其活性成分含量關(guān)系。該研究收集了20批不同產(chǎn)地的涼粉草，建立HPLC法測(cè)定涼粉草中3種成分（咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸）含量的方法，采用紫外法測(cè)定其總黃酮、總酚酸和總糖的含量，并對(duì)測(cè)定的活性成分進(jìn)行主成分分析，旨在對(duì)涼粉草的質(zhì)量控制進(jìn)行深入探索，為建立合理的涼粉草質(zhì)量評(píng)價(jià)體系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 儀器。E2695型高效液相色譜儀，Empower2（2154-c），美國(guó)Waters科技公司;KQ-700DE 超聲波儀（40 kHz，280 W），昆山超聲儀器有限公司;XR205SM-DR型電子天平，瑞士Precisa公司;Milipore-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)Milipore。

1.1.2 試藥。乙腈（色譜純，德國(guó)Merck）;紫云英苷（批號(hào)160824，純度98%）、迷迭香酸（批號(hào)160105，純度98%）、咖啡酸（批號(hào)161007，純度99%）、沒(méi)食子酸（批號(hào)161120，純度99%）、蘆丁（批號(hào)161024，純度99%）均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司。

1.1.3 試材。S1～S20涼粉草樣品由廣東南領(lǐng)藥業(yè)有限公司提供，詳見表1，樣品采集時(shí)間均為2014年9月。標(biāo)本經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院詹若挺研究員鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紫云英苷、迷迭香酸、咖啡酸的含量測(cè)定。

1.2.1.1 色譜條件。C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，洗脫程序：0～5 min，23%乙腈;5～15 min，23%～27%乙腈;15～25 min，27%～23%乙腈。流量0.8 mL/min，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.1.2 對(duì)照品溶液制備。精密稱定咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇制成混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，含0.445 0 mg/mL咖啡酸、0.607 2 mg/mL紫云英苷、0.442 5 mg/mL迷迭香酸。

1.2.1.3 供試品溶液制備。精密稱定S1～S20樣品適量（過(guò)二號(hào)篩），放置塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，稱定重量，超聲1 h（40 kHz，280 W），放置到室溫后，補(bǔ)足減失的重量，搖勻后離心，取上清液，即得。

1.2.1.4 方法學(xué)考察。

（1）線性關(guān)系考察。精密移取“1.2.1.2”的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，稀釋成一系列濃度對(duì)照品溶液，根據(jù)“1.2.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）。

（2）精密度考察。參照“1.2.1.3”方法制備供試品（S1）溶液，根據(jù)“1.2.1.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣6次，計(jì)算紫云英苷、咖啡酸和迷迭香酸含量的RSD值。

（3）重復(fù)性考察。取S1藥材6份供試品溶液，按照“1.2.1.1”色譜條件測(cè)定，計(jì)算咖啡酸、紫云英苷和迷迭香酸含量的RSD值。

（4）穩(wěn)定性考察。取S1樣品，按照“1.2.1.3”方法制備1份供試品溶液，按照“1.2.1.1”色譜條件，在2、4、12、24、48 h分別進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算咖啡、迷迭香酸和紫云英苷對(duì)應(yīng)色譜峰面積的RSD值。

（5）加樣回收試驗(yàn)。精密稱定已知含量的S1樣品，3份0.4 g、3份0.5 g、3份0.6 g;再精密加入70%乙醇配制的高、中、低3種濃度混標(biāo)溶液100 mL（相當(dāng)于藥材原有含量的80%、100%、120%），之后按照“1.2.1.1”色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算涼粉草藥材中咖啡酸、紫云英苷和迷迭香酸含量的平均加樣回收率。

1.2.2 總黃酮、總酚酸、總糖的含量測(cè)定。

1.2.2.1 總黃酮測(cè)定方法。參考李培源等[18]的方法，采用NaNO2-Al（NO）3-NaOH法測(cè)定涼粉草中總黃酮含量，以蘆丁為對(duì)照品，測(cè)定波長(zhǎng)為507 nm。

1.2.2.2 總酚酸測(cè)定方法。參考胡紹德等[19]的方法，采用酒石酸亞鐵法測(cè)定涼粉草中總酚酸含量，以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，測(cè)定波長(zhǎng)為535 nm。

1.2.2.3 總糖測(cè)定方法。參考林麗等[20]的方法，采用硫酸-蒽酮法測(cè)定涼粉草中總糖含量，以D-無(wú)水葡萄糖為對(duì)照品，測(cè)定波長(zhǎng)為560 nm。

1.2.2.4 方法學(xué)考察。

（1）線性關(guān)系考察。配制一系列濃度的蘆丁、沒(méi)食子酸、D-無(wú)水葡萄糖溶液，分別按照“1.2.2.1”“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（r）。

（2）重復(fù)性考察。取S1樣品，分別按照“1.2.2.1”“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法測(cè)定供試品各6份，計(jì)算總黃酮、總酚酸和總糖含量的RSD值。

（3）精密度考察。取S1樣品，分別按照“1.2.2.1”“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法測(cè)定供試品各1份，連續(xù)測(cè)定6次，計(jì)算總糖、總酚酸和總黃酮含量的RSD值。

（4）穩(wěn)定性考察。取S1樣品，分別按照“1.2.2.1”“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法在2、4、12、24、48 h進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算總黃酮、總酚酸和總糖含量的RSD值。

（5）加樣回收試驗(yàn)。取S1樣品0.5 g，精密稱定，平行操作18份，分為3組，每組6份，分別精密加入蘆丁對(duì)照品、食子酸對(duì)照品、D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（每份均相當(dāng)于原藥材含量100%），按照“1.2.2.1”“1.2.2.2”“1.2.2.3”方法進(jìn)行供試品處理，計(jì)算涼粉草藥材中總糖、總酚酸、總黃酮含量平均加樣回收率和RSD。

1.2.3 樣品含量測(cè)定。取S1～S20按照“1.2.1”“1.2.2”方法制備并測(cè)定樣品，計(jì)算每個(gè)產(chǎn)地樣品中紫云英苷、迷迭香酸、咖啡酸、總黃酮、總酚酸和總糖的含量。

1.2.4 主成分分析。將涼粉草中6個(gè)化學(xué)成分含量作為變量，導(dǎo)入SPSS 19.0軟件標(biāo)準(zhǔn)化處理，先進(jìn)行降維處理，再進(jìn)行主成分分析，采用方差貢獻(xiàn)率作為主成分提取標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算主成分貢獻(xiàn)率;運(yùn)用主成分分析的方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)特征向量，計(jì)算各主成分得分表達(dá)式，用于揭示不同產(chǎn)地涼粉草各成分含量與涼粉草質(zhì)量的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫云英苷、迷迭香酸、咖啡酸的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品與樣品的高效液相色譜峰圖。從圖1可以看出，在同一色譜條件下，混合標(biāo)準(zhǔn)品與樣品在相同的保留時(shí)間內(nèi)有對(duì)應(yīng)的色譜峰。

2.1.2 方法學(xué)考察。

（1）線性關(guān)系。按照“1.2.1.4”方法測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。

（2）精密度。按照“1.2.1.4”方法操作，計(jì)算得出紫云英苷、咖啡酸和迷迭香酸對(duì)應(yīng)峰面積的RSD值分別為0.87%、2.68%、0.24%，表明儀器精密度良好。

（3）重復(fù)性。按照“1.2.1.4”方法操作，計(jì)算得出咖啡酸、紫云英苷和迷迭香酸含量的RSD值分別為0.15%、0.37%、0.88%，表明該方法重復(fù)性良好。

（4）穩(wěn)定性。按照“1.2.1.4”方法操作，計(jì)算得出咖啡、迷迭香酸和紫云英苷對(duì)應(yīng)色譜峰面積的RSD值分別為0.26%、0.21%、0.70%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

（5）加樣回收。按照“1.2.1.4”方法操作，計(jì)算得出涼粉草藥材中咖啡酸、紫云英苷和迷迭香酸含量的平均加樣回收率分別為104.01%、99.92%、97.55%，RSD值分別為2.34%、2.19%、2.34%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2 總黃酮、總酚酸、總糖的含量測(cè)定

2.2.1 線性關(guān)系。按照“1.2.2.4”方法測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算相應(yīng)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。

2.2.2 重復(fù)性。按照“1.2.2.4”方法操作，計(jì)算得出總黃酮、總酚酸和總糖含量的RSD值分別為1.25%、1.33%、2.97%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3 精密度。按照“1.2.2.4”方法操作，計(jì)算得出總糖、總酚酸和總黃酮含量的RSD值分別為0.43%、0.36%、0.67%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性。按照“1.2.2.4”方法操作，計(jì)算得出總黃酮、總酚酸和總糖含量的RSD值分別為0.28%、0.40%、0.69%，表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 加樣回收。按照“1.2.2.4”方法操作，計(jì)算得出涼粉草藥材中總糖、總酚酸和總黃酮含量的平均加樣回收率分別為100.45%、96.56%、100.60%，RSD分別為0.59%、1.28%、3.14%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.3 樣品含量測(cè)定 按照“1.2.3”方法操作，計(jì)算每個(gè)產(chǎn)地樣品中紫云英苷、迷迭香酸、咖啡酸、總黃酮、總酚酸和總糖的含量，結(jié)果如表4。從表4可以看出，樣品中咖啡酸含量為0.05～0.20 mg/g，紫云英苷含量為0.26～4.49 mg/g，迷迭香酸含量為2.40～5.29 mg/g，總黃酮含量為77.26～136.31 mg/g，總酚酸含量為12.38～26.84 mg/g，總糖含量為52.36～198.68 mg/g。6種成分在不同產(chǎn)地的涼粉草中含量均有差異。其中，紫云英苷在不同產(chǎn)地涼粉草之間含量差異最大，含量高低極值之比約為17.3;而不同產(chǎn)地涼粉草所含總黃酮的量相差最小，含量高低極值之比約為1.8。

2.4 主成分分析 在SPSS 19.0軟件中導(dǎo)入6種成分含量，通過(guò)主成分分析獲得3個(gè)主成分（F1、F2、F3），如表5中顯示，3個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到87.395%，表明提取的主成分可以代表大部分涼粉草化學(xué)成分含量的信息。從表6可以看出，以6個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)的特征向量作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，在第1主成分特征向量中，荷載量較高的成分是迷迭香酸和總黃酮;在第2主成分特征向量中，荷載量較高的成分是紫云英苷和總酚酸;在第3主成分特征向量中，荷載量較高的成分是總糖。結(jié)合每個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分析，可知對(duì)涼粉草質(zhì)量貢獻(xiàn)率較高的是黃酮類和酚酸類成分。

運(yùn)用主成分分析的方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)特征向量，計(jì)算各主成分得分表達(dá)式（公式1～3）及綜合主成分得分表達(dá)式（公式4），可用于揭示不同產(chǎn)地涼粉草各成分含量與涼粉草質(zhì)量的關(guān)系，且從結(jié)果可知涼粉草質(zhì)量表現(xiàn)出地域差異的特性，由通過(guò)主成分得分表達(dá)式計(jì)算各產(chǎn)地質(zhì)量綜合得分（表7）。從表7可以看出，相對(duì)于其他幾個(gè)產(chǎn)地，廣東平

遠(yuǎn)上舉鎮(zhèn)（S05）、福建武平縣下壩鄉(xiāng)（S16）、福建長(zhǎng)汀縣（S12）質(zhì)量總體上較好。

F1=0.51×Zx1+0.10×Zx2+0.49×Zx3+0.52×Zx4-0.20×Zx5 （1）

F2=-0.19×Zx1+0.69×Zx2+0.22×Zx3+0.27×Zx4+0.56×Zx5（2）

F3=-0.27×Zx1-0.26×Zx2-0.32×Zx3+0.29×Zx4+0.52×Zx5（3）

F=0.440 5F1+0.287 3F2+0.146 0F3（4）

3 結(jié)論與討論

該試驗(yàn)前期研究中發(fā)現(xiàn)咖啡酸對(duì)涼粉草指紋圖譜貢獻(xiàn)率大[5]，所以選擇紫云英苷、迷迭香酸和咖啡酸作為含量測(cè)定的指標(biāo)。該研究結(jié)果表明，不同來(lái)源的涼粉草中咖啡酸含量較低，并不適合作為其質(zhì)量指標(biāo)，而紫云英苷含量具有顯著差異性，可作為下一步活性驗(yàn)證成分，根據(jù)其活性作用效

果，考慮將其列入涼粉草質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)。涼粉草中多糖含量依次為葉>根>莖，不同的品種（直立性與匍匐型）及不同產(chǎn)地涼粉草多糖含量、特性黏度、質(zhì)構(gòu)通過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)其具有明顯差異性[21]。該試驗(yàn)選取涼粉草全草為試驗(yàn)材料，且不同產(chǎn)地、不同品種的多糖含量不一，與林麗華等[21]的研究結(jié)果一致，可對(duì)多糖成分進(jìn)行進(jìn)一步研究。

通過(guò)主成分分析法對(duì)涼粉草咖啡酸、紫云英苷、迷迭香酸、總黃酮、總酚酸和總糖測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，在20份不同產(chǎn)地的樣本中的含量均有較大差異，且黃酮類、酚酸類成分對(duì)涼粉草質(zhì)量有較大貢獻(xiàn)。依據(jù)主成分綜合得分進(jìn)行評(píng)價(jià)排名的方式，以廣東平遠(yuǎn)上舉鎮(zhèn)、福建武平縣下壩鄉(xiāng)、福建長(zhǎng)汀縣種植的涼粉草質(zhì)量較高，且上述地區(qū)在地理位置上接壤，可考慮在此地區(qū)對(duì)涼粉草種植進(jìn)行推廣。

對(duì)比前人[22]對(duì)涼粉草中成分含量測(cè)定的結(jié)果，該研究同時(shí)對(duì)多種成分進(jìn)行測(cè)定，采用主成分分析對(duì)6種成分含量進(jìn)行分析，建立的分析方法更為全面直觀，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的涼粉草在化學(xué)物質(zhì)成分上存在差異，提高涼粉草質(zhì)量評(píng)價(jià)水平對(duì)提高涼粉草資源質(zhì)量有重要意義。

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