肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達(dá)情況及與疾病發(fā)生的機(jī)制研究

張彥驊 李怡林 朱學(xué)喆 劉博

【關(guān)鍵詞】子宮內(nèi)膜異位癥;肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1;表達(dá);疾病發(fā)生;機(jī)制

【中圖分類號(hào)】R711.22 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2026-5328（2022）03--03

子宮內(nèi)膜異位癥（EM）是婦科常見(jiàn)疾病之一，發(fā)病率10%～15%，其中76%在25～45歲[1]。主要指子宮內(nèi)膜組織種植于或者浸潤(rùn)于宮體之外的地方，異位內(nèi)膜可以出現(xiàn)在全身任何部位，一般位于卵巢、宮骶韌帶等，其特征是雌激素依賴和炎性介導(dǎo)，其生物學(xué)行為與癌癥類似，如其細(xì)胞具有遷移、侵襲、再發(fā)甚至惡變等。EM主要分為三種類型，卵巢型、腹膜型及深部結(jié)節(jié)型，目前，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，主要有以下學(xué)說(shuō)，種植學(xué)說(shuō)、體腔上皮化生學(xué)說(shuō)、誘導(dǎo)學(xué)說(shuō)[2]。子宮內(nèi)膜異位癥的治療方案，因病情的輕重，患者的年齡和生育情況而有所不同。近年來(lái)腹腔鏡的廣泛應(yīng)用，已使子宮內(nèi)膜異位癥的治療有了一種新的選擇，但是仍然有內(nèi)異癥治療效果不佳，反復(fù)復(fù)發(fā)的問(wèn)題。所有治療效果不理想的原因主要在于EM的發(fā)病原因不清楚[3]。因此，探討EM的發(fā)病機(jī)制是目前研究中最亟待解決的問(wèn)題。lncRNA在婦科疾病中發(fā)揮著重要的作用，但是關(guān)于其在EM中的承擔(dān)的具體作用不清楚，另外AFAP1-AS1通過(guò)下調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著的變化，并且得知此變化與EMT時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化具有一致性，但是關(guān)于AFAP1-AS1和EMT之間關(guān)系研究，其機(jī)理并不明確，另外，AFAP1-AS1的下調(diào)在體內(nèi)及體外的結(jié)果是否具有一致性[4]，因此，本研究為了驗(yàn)證EM中l(wèi)ncRNA以及探討EM中的EMT現(xiàn)象，探討AFAP1-AS1和EMT之間的關(guān)系，研究其機(jī)理發(fā)生的過(guò)程，為EM提出新的標(biāo)記物及EM的治療提供新的思路。

1. 資料與方法

1.1一般資料

項(xiàng)目通過(guò)我院倫理委員會(huì)審查，以我院2020.9-2021.2月期間因卵巢子宮內(nèi)膜異位癥在婦一科接受手術(shù)治療的患者30例為研究對(duì)象（實(shí)驗(yàn)組），收集其異位內(nèi)膜組織及在位內(nèi)膜組織，以術(shù)后病理科石蠟病檢作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)收集同期非子宮內(nèi)膜異位癥患者30例正常內(nèi)膜組織（對(duì)照組）。實(shí)驗(yàn)組30例患者年齡36～76歲，平均（55.32±9.41）歲，在病理分級(jí)方面，Ⅰ+Ⅱ級(jí)17例，Ⅲ級(jí)13例;在病理分期方面，Ⅰ+Ⅱ期20例，Ⅲ+Ⅳ期10例。對(duì)照組30例患者年齡33～71歲，平均（53.65±8.65）歲。兩組患者的一般資料比較差異均不顯著（P>0.05）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①一般病例資料完善;②入院實(shí)驗(yàn)組初步診斷均考慮卵巢子宮內(nèi)膜異位癥且均為初次治療，對(duì)照組為非子宮內(nèi)膜異位癥，且無(wú)子宮內(nèi)膜良性病變或子宮內(nèi)膜惡性病變的患者[5];③入院后患者均行手術(shù)治療且術(shù)后有明確的石蠟病理診斷結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：①實(shí)驗(yàn)組既有卵巢子宮內(nèi)膜異位癥，同時(shí)合并有卵巢其他囊腫的患者。對(duì)照組患者有子宮異常出血或有分泌雌激素的卵巢腫瘤或長(zhǎng)期服用雌、孕激素史的患者;②術(shù)后病理診斷結(jié)果缺失。

1.2方法

1.2.1 AFAP1-AS1在異位組織、在位組織及正常組織中的表達(dá)

1.2.1.1組織的獲取

收集我院30例確診為EM的患者的異位內(nèi)膜組織及在位內(nèi)膜組織，另外取30例正常內(nèi)膜組織。標(biāo)本采集以后立即保存在RNAlater保存液，另外收集患者臨床資料。

1.2.1.2細(xì)胞培養(yǎng)

正常內(nèi)膜細(xì)胞用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，EM患者內(nèi)膜細(xì)胞用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件均5%CO2，37℃。

1.2.1.3細(xì)胞總RNA抽提

（1）待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行抽提;（2）棄培養(yǎng)液，PBS清洗2次，加入2ml Trizol，吹打，混勻，靜置孵育;（3）取1ml轉(zhuǎn)移至1.5ml的EP管，加入0.2ml氯仿，震蕩，靜置;（4）離心，取上層水相約600μl至新的EP管;（5）加0.5ml異丙醇，靜置，離心，棄上清;（6）用1ml 75%的乙醇洗滌;（7）離心，棄上清，干燥;（8）加入ddH2O 30μl溶解，水浴10min;（9）根據(jù)1OD260相當(dāng)于40μg/ml，確定RNA量，根據(jù)OD260/OD280判斷RNA純度，RNA樣品置于-80℃保存。

1.2.1.4組織標(biāo)本總RNA抽提

（1）取出保存的組織，研磨;（2）移至含1mlTRIzol RNA的EP管，震蕩，靜置;（3）加入0.2ml氯仿，震蕩，靜置;（4）離心，吸上清至新的EP管;（5）加0.5ml異丙醇，顛倒，靜置;離心，去上清;（6）加入lml 75%乙醇洗滌;離心，棄上清，干燥;（7）加入30μlddH2O進(jìn)行講解，水浴;（8）根據(jù)1OD260相當(dāng)于40μg/ml，確定RNA量，根據(jù)OD260/OD280判斷RNA純度，RNA樣品置于-80℃保存。

1.2.1.5反轉(zhuǎn)錄

利用逆轉(zhuǎn)錄試劑操作。取0.5μgRNA融于2ul DEPC中，加入轉(zhuǎn)錄引物1μl，用DEPC補(bǔ)至5μl，變性，冷卻。再加2μl的5XReaction Buffer，0.5μl的RNAse抑制劑，1μ1的dNTP，0.5μ1逆轉(zhuǎn)錄酶RTase，1μlDEPC，使總體積為10μ1，混勻。水浴10min，之后42℃，60min，最后70℃，10min，冷卻。置于-20℃保存。

1.2.1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR

（1）引物序列：UCA1（F：CCCGAGGACCGAAGATCAAA;R：GGCATGAGTGCAGTTGAGGA）;HNF1A-AS1（F：TTACAGACCCGGGATAGGTC;R：CTGTTCTCTCAGGTGTCCGG）;MALAT-1（F：AAGTGTGTCCCTTTGCGTCT;R：TATCCTAGCCTGTCTTGAGC）;KLKP1（F：TCACACTTCCATGGTCCAAA;R：CGCCTAATTCCACTCCAAAGG）;AFAP1-AS1（F：TCCTCAGGTGGGCAAGTGACA;R：CGACCGGCTACTGAGAAGGCTT）AFAP1（F：CGATTGAACCCCGCTCGGTC;R：TTAACACCAGCCGGGCGATCC）;ZEB1（F：ATGCGGAGGGTATATAGAGTGT;R：AAGGATAAAGGTCCGATGAGAT）;（2）配置相應(yīng)反應(yīng)體系：試劑盒（2×）：5μl;上游引物（10μM）：0.4μl;反向PCR引物（10μM）：0.4μl;cDNA：1μl;ddH2O：3.2μl;（3）反應(yīng)條件：95℃變形30s，1cycle;95℃變形3s;60℃退火3s，40cycles。

1.2.1.7免疫組化法

（1）取出保存的組織進(jìn)行固定，制作蠟塊，再切片，貼片。（2）烤片：于60℃烤箱中烘烤60min左右。（3）脫蠟、復(fù)水：二甲苯Ⅰ（5min），二甲苯Ⅱ（5mim），無(wú)水酒精Ⅰ（2mim），無(wú)水酒精Ⅱ（2min），95%酒精（2min），85%酒精（2min），70%酒精（2min），50%酒精（2min），30%酒精（2min）。（4）用PBS洗3次，3min/次。（5）修復(fù)抗原：切片于pH7.2的檸檬酸鈉修復(fù)液，高壓冒氣2min，冷卻。（6）所有切片均加入過(guò)氧化酶阻斷劑，孵育，PBS洗3次，5min/次。（7）除去PBS，所有切片均加入BSA，孵育，PBS洗3次，5min/次。（8）加一抗：除去PBS，所有切片均加入一抗，4℃過(guò)夜。孵育，除去多余液體，PBS洗3次，5min/次。（9）加二抗：除去PBS，所有切片均加入二抗，孵育，PBS洗3次，5min/次。（10）加DAB：除去PBS，所有切片均加入DAB顯色液，根據(jù)顯色的情況判斷顯色的時(shí)間，最后用蒸餾水終止。⑾復(fù)染：棄蒸餾水，所有切片均加入蘇木素，最后用蒸餾水終止顯色。⑿脫水：按照以下順序進(jìn)行浸泡，無(wú)水乙醇30%，50%、70%、80%、95%、100%、100%，均2min，最后放二甲苯溶液中。⒀晾干，加中性樹(shù)脂，蓋玻片封好。⒁拍照。

1.2.2 AFAP1-AS1下調(diào)與EMT的關(guān)系研究

1.2.2.1細(xì)胞分離和培養(yǎng)

（1）組織的獲?。喝〗】翟谖粌?nèi)膜組織及EM患者異位內(nèi)膜組織，均培養(yǎng)于含有2%雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基中。（2）消化：將組織移至無(wú)菌的培養(yǎng)皿，用PBS洗3次，接著放入含有2%雙抗的PBS中，剪碎，用PBS洗3次，沉淀，取上清，加入Ⅳ型膠原酶消化液，封管，水浴，消化1h，震搖，直至呈現(xiàn)粘稠狀，加DNaseⅠ，消化。（3）分離和純化：取出上述消化液，依次經(jīng)過(guò)100目和400目篩網(wǎng)過(guò)濾。（4）傳代培養(yǎng)：觀察細(xì)胞匯合度，達(dá)到80%即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，去除培養(yǎng)基，加PBS洗2次，去除PBS，加胰蛋白酶，消化，顯微鏡觀察，觀察細(xì)胞的形態(tài)是否出現(xiàn)變化，若變化，立即加血清終止，吹打，離心，去除上清，沉淀，于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2.2細(xì)胞凍存和復(fù)蘇

（1）細(xì)胞凍存：觀察細(xì)胞匯合度情況，達(dá)到80%時(shí)即可凍存細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，加PBS洗2次，加胰蛋白酶，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，消化，觀察細(xì)胞的形態(tài)，若出現(xiàn)變化，加血清立即終止消化，吹打，離心，去除上清，加細(xì)胞凍存液，封口，保存，于-80℃冰箱過(guò)夜。（2）細(xì)胞復(fù)蘇：取出凍存的細(xì)胞，水浴，離心，棄上清，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24h更換培養(yǎng)基。

1.2.2.3電鏡觀察

（1）取材。（2）固定：用2.5%戊二醛進(jìn)行固定，再用緩沖液清洗3次，10min/次。（3）脫水：用乙醇進(jìn)行脫水，按照以下順序操作，30%乙醇，50%乙醇，70%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，100%乙醇，再用叔丁醇進(jìn)行脫水3次，10min/次，過(guò)夜。（4）冷凍干燥。（5）電鏡觀察。

1.2.2.4 ELISA

（1）樣品制備：取患者外周血，離心，保存;取上述保存的組織。（2）取出條板。（3）孔中加入稀釋液，封反應(yīng)孔，孵育。（4）去除反應(yīng)液。（5）加入生物素化抗體，封住反應(yīng)孔，孵育。（6）洗板，加入酶結(jié)合物稀釋液，封反應(yīng)孔，避光孵育。（7）洗板5次，加入顯色底物，避光孵育。（8）加入終止液，混勻，測(cè)OD值。

1.2.2.5 Edu

（1）取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種，應(yīng)用雌激素進(jìn)行處理。（2）稀釋Edu溶液，制作Edu培養(yǎng)基。（3）孵育，棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，5min/次。（4）加入多聚甲醛進(jìn)行固定，去除固定液。（5）加入甘氨酸，孵育，棄甘氨酸，PBS清洗1次，5min。（6）加入含有TritonX-100的PBS，孵育，再用PBS清洗1次，5min。（7）加入染色反應(yīng)液，避光孵育，棄染色液。（8）加入含有TritonX-100的PBS，搖床，清洗2次，5min/次。（9）加入甲醇洗2次，5min/次，再用PBS清洗1次，5min。（10）加入Hoechst33342反應(yīng)液，避光孵育，棄染色液，再用PBS清洗1次，5min。（11）用顯微鏡觀察，拍照。

1.2.2.6MTT

（1）細(xì)胞接種，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，（2）加入MTT，培養(yǎng)。（3）吸出培養(yǎng)液，加入DMSO液，振蕩，溶解。（4）測(cè)OD值，記錄，繪制。

1.2.2.7細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

（1）劃線，保證沒(méi)孔最低經(jīng)過(guò)3條線。（2）將對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中。（3）劃線。（4）用PBS清洗3次，5min/次，加入無(wú)血清的培養(yǎng)基，進(jìn)行藥物處理。（5）于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，按照0h、24h、48h取樣，拍照。

1.2.2.8 Transwell

（1）種懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度。（2）每個(gè)小孔加入細(xì)胞懸液。（3）加入胎牛血清，培養(yǎng)24h。（4）取出Transwell小室，用PBS清洗，用95%乙醇固定，取上層，下層進(jìn)行染色，再用PBS進(jìn)行清洗。（5）計(jì)數(shù)：再顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)10個(gè)視野，取平均數(shù)。

1.2.2.9細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

（1）取出解凍好的基質(zhì)膠，振蕩，混勻。（2）預(yù)冷。（3）包被基底膜：加入Matrigel溶液，風(fēng)干。（4）水化基底膜：加入BSA的無(wú)血清培養(yǎng)基，孵育。（5）結(jié)晶紫染色同上述步驟。

1.2.2.10 Western Blot

（1）細(xì)胞或組織總蛋白抽提：將異位組織及在位組織標(biāo)本研磨。每200mg組織或細(xì)胞，加入RIPA裂解液，震蕩，離心，取上清。利用蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度，用PBS調(diào)整為4mg/ml，再加入1/5體積緩沖液，煮沸，離心，-20℃保存。（2）電泳：取總蛋白樣品，每孔上樣15μ1，于12%的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，濃縮膠80V，分離膠120V，出凝膠后結(jié)束電泳。（3）電轉(zhuǎn)移：依次按Scotch-Brite墊-Whatman濾紙-凝膠-NC膜-Whatman濾紙-Scotch-brite墊的順序放置，用特制的夾子夾緊，放入塑料支撐體中，然后浸入盛有緩沖液槽中。冰浴，電轉(zhuǎn)移45min，取出NC，以Pre-Stained Protein Ladder條帶為參考，切割PVDF膜。（4）封閉：室溫下，用5%脫脂奶粉在水平脫色搖床上封閉1h。（5）加一抗加二抗：按照抗體說(shuō)明書(shū)稀釋相應(yīng)抗體。將封閉后的NC膜放入塑料皿中，加入上述抗體，轉(zhuǎn)印，振蕩。次日，以TBST漂洗15min×3次。加入羊抗兔，二抗，孵育，用TBST洗膜，15min×3次。（6）發(fā)光底物反應(yīng)：取luminol，A與B液按1：1混勻，滴于NC膜上，并將膜用透明塑料保鮮膜包裹，反應(yīng)2min。（7）顯影曝光：暗室條件下，壓片盒中將感光膠片疊于膜上，用壓片夾夾緊曝光5min，取出膠片，依次顯影、定影，用水沖洗膠片。

1.3觀察指標(biāo)

數(shù)據(jù)由華大基因?qū)λ龀龅臄?shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得AFAP1-AS1在異位組織、在位組織中以及正常內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況，EMT標(biāo)志基因及蛋白、轉(zhuǎn)錄因子在異位組織及在位組織中的表達(dá)情況，結(jié)合收集的上述臨床資料及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析AFAP1-AS1在EM患者中的表達(dá)情況。分析AFAP1-AS1下調(diào)與EMT的關(guān)系。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件，計(jì)數(shù)資料分別用%、X2表示、檢驗(yàn)，計(jì)量資料分別用（x±s）、t表示、檢驗(yàn)，用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析影響因素，P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 結(jié)果

2.1兩組lncRNA AFAP1-AS表達(dá)比較

觀察組患者的lncRNA AFAP1-AS表達(dá)高于對(duì)照組（t=37.619，P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2實(shí)驗(yàn)組lncRNA AFAP1-AS表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析

病理分級(jí)Ⅰ+Ⅱ級(jí)患者的lncRNA AFAP1-AS高表達(dá)率低于Ⅲ級(jí)患者（P<0.05），病理分期Ⅰ+Ⅱ期患者的lncRNA AFAP1-AS高表達(dá)率低于Ⅲ+Ⅳ期患者（P<0.05），肌層無(wú)或淺浸潤(rùn)患者的lncRNA AFAP1-AS高表達(dá)率低于肌層深浸潤(rùn)患者（P<0.05），但不同年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、合并糖尿病、高血壓患者的lncRNA AFAP1-AS高表達(dá)率之間的差異均不顯著（P>0.05）。見(jiàn)表2。

3. 討論

近幾年，EM的致病機(jī)制中提出了上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化學(xué)說(shuō)（EMT）引起人們的關(guān)注[6]。EMT的主要特征有細(xì)胞黏附分子表達(dá)的減少、細(xì)胞角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間充質(zhì)細(xì)胞的特征等[7]。通過(guò)EMT，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型，抑制細(xì)胞的衰老及凋亡的發(fā)生，免疫抑制能力提高。

LncRNA是一類長(zhǎng)度大于200nt，缺乏顯著開(kāi)放閱讀框（ORF）的ncRNA，lncRNA在婦科疾病中發(fā)揮著重要的作用，1ncRNA參與相關(guān)生物學(xué)行為，主要包括基因組印記、修飾染色質(zhì)等，另外主要在轉(zhuǎn)錄開(kāi)始及終止，運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。目前文獻(xiàn)報(bào)道LncRNA不僅與婦科惡性腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系，在EM的病灶組織中也有表達(dá)。但是關(guān)于其在EM中的承擔(dān)的具體作用不清楚。肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1（actin fiber-associated protein 1-antisense RNA1）是新發(fā)現(xiàn)的一種1ncRNA，另外，文獻(xiàn)中表明[8]，AFAP1-AS1通過(guò)下調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生顯著的變化，并且得知此變化與EMT時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化具有一致性，但是關(guān)于AFAP1-AS1和EMT之間關(guān)系研究，其機(jī)理并不明確，另外，AFAP1-AS1的下調(diào)在體內(nèi)及體外的結(jié)果是否具有一致性。

本研究為了驗(yàn)證EM中l(wèi)ncRNA以及探討EM中的EMT現(xiàn)象，探討AFAP1-AS1和EMT之間的關(guān)系，研究其機(jī)理發(fā)生的過(guò)程，并通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以上得出的結(jié)論，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組患者預(yù)后的影響因素包括lncRNA AFAP1-AS表達(dá)、病理分期（P<0.05）。這就為治療EM患者提高新的治療思路。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥中肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1的表達(dá)升高，與疾病發(fā)生的機(jī)制關(guān)系密切。

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基金項(xiàng)目：甘肅省自然科學(xué)基金（20JR10RA422）