微生物群落結(jié)構(gòu)對泡菜質(zhì)量的影響研究進展

徐清萍，法子柱，李雯

(1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，鄭州 450001；2.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450001)

泡菜是以各類蔬菜為主要原料，經(jīng)加工發(fā)酵形成的浸漬成品，在世界各地已有數(shù)千年歷史。泡菜種類很多，包括中式泡菜、西式泡菜、日式泡菜、韓式泡菜。

泡菜發(fā)酵是一個多菌種發(fā)酵的過程。從有益的方面看，蔬菜原料經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵會產(chǎn)生很多化合物，如有機酸(乳酸和醋酸)、二氧化碳、酒精、維生素、益生元和其他香味物質(zhì)，這些產(chǎn)物使泡菜呈現(xiàn)出各種風味和感官特性。由于蔬菜原料及配料的選擇與處理、發(fā)酵工藝和衛(wèi)生條件各有差異[1]，不同產(chǎn)地泡菜制作工藝中形成的菌群各異，繼而進一步影響著泡菜的風味及泡菜中各項指標。從不利的方面看，用于泡菜生產(chǎn)的蔬菜原料表面附著著大量的附生微生物，如霉菌、酵母、腸桿菌科細菌和假單胞菌，而泡菜發(fā)酵系統(tǒng)為有害微生物的生長提供了適宜的條件，如豐富的營養(yǎng)物質(zhì)、適宜的含氧量和pH值。這些有害菌在泡菜中產(chǎn)生有害的代謝物和毒素，對最終產(chǎn)品的質(zhì)量和消費者的健康造成嚴重危害。其次，亞硝酸鹽的積累是泡菜生產(chǎn)中常見的另一個問題。亞硝酸鹽促進致癌N-亞硝基化合物的內(nèi)源性合成，特別是亞硝胺。因此，降低發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽濃度也很重要。蔬菜發(fā)酵過程中腐敗菌和亞硝酸鹽積累是影響腌菜、泡菜產(chǎn)業(yè)和消費者健康的常見問題。

1 泡菜中的微生物菌群及影響因素

泡菜發(fā)酵是一個多菌種發(fā)酵的過程，PCR-DGGE、qPCR、高通量測序技術(shù)、SMRT測序技術(shù)等逐步被用于泡菜發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析[2-4]。

各種研究表明泡菜發(fā)酵是一個多菌種發(fā)酵過程，不同原料、產(chǎn)地、工藝、發(fā)酵階段中的菌群結(jié)構(gòu)也存在著差別。青菜泡菜[5]發(fā)酵過程中，絕對優(yōu)勢真菌德巴利氏酵母(Debaryomyces)貫徹整個發(fā)酵中期，畢氏酵母(Pichia)在發(fā)酵第15天為絕對優(yōu)勢菌，奧默柯達菌(Kodamaeaohmeri)在發(fā)酵第81天為絕對優(yōu)勢菌，檢測到的主要優(yōu)勢真菌有假絲酵母(Candida)等。四川泡菜[6]隨著發(fā)酵代數(shù)的增加，泡菜母水中的細菌與真菌多樣性呈下降趨勢，微生物群落構(gòu)成趨于穩(wěn)定；乳桿菌(Lactobacillus)是達到穩(wěn)態(tài)的泡菜母水中的主要細菌屬，哈薩克斯坦酵母(Kazachstania)是達到穩(wěn)態(tài)的泡菜母水中的主要真菌屬。四川工業(yè)泡菜[7]發(fā)酵過程中，變形菌門是泡菜發(fā)酵前期的優(yōu)勢菌門，而發(fā)酵中期和后期的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門；在整個發(fā)酵過程中，乳桿菌屬的含量呈現(xiàn)出明顯的增加，假單胞菌屬的含量有所降低，鹽單胞菌屬和弧菌屬的含量均基本保持不變。關(guān)于泡菜和辣白菜的細菌多樣性研究結(jié)果表明[8]，辣白菜中乳酸桿菌、菌絲體和魏斯氏菌的相對豐度明顯高于泡菜，而寡養(yǎng)單胞菌和沙雷菌在泡菜中的比例則低于泡菜。

采樣地點和原輔料不同對發(fā)酵泡菜中真菌菌群結(jié)構(gòu)均有一定的影響[9]。不同的貯藏時間對泡菜菌相構(gòu)成[10]有影響，泡菜貯藏階段的乳酸菌以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)為主，但相對豐度因貯藏時間而存在差異；貯藏3年的泡菜以單孢釀酒酵母(Kazachstaniaexigua)和Kazachstaniabulderi為主，貯藏12年的泡菜以膜璞畢赤酵母(Pichiamembranifaciens)為主。

大量研究表明，泡菜發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌和腸桿菌數(shù)量動態(tài)變化，絕對的優(yōu)勢菌——乳酸菌主導(dǎo)了泡菜發(fā)酵，分離的最多的菌(優(yōu)勢菌)為該屬中植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和戊糖乳桿菌(Lactobacilluspentosus)[11]。韓國泡菜中優(yōu)勢乳酸菌屬主要為明串珠菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬，乳酸菌種的分布與演替主要受制作泡菜的原材料、發(fā)酵溫度和鹽濃度等因素影響[12]。鄧維琴等[13]對多代發(fā)酵泡菜中微生物多樣性的研究表明，乳酸菌是泡菜母水中的優(yōu)勢細菌，酵母菌是優(yōu)勢真菌。張其圣等[14]對低鹽泡菜發(fā)酵過程中的乳酸菌群落結(jié)構(gòu)動態(tài)變化的研究表明，發(fā)酵前期的主要優(yōu)勢菌群是乳酸乳球菌和食竇魏斯氏菌，發(fā)酵中、后期的主要優(yōu)勢菌群是戊糖乳桿菌。羅強等[15]從中國北方4個不同地區(qū)的20份傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜樣品中分離乳酸菌，結(jié)果表明各地區(qū)泡菜樣品的微生物菌群組成有差異，其中遼寧和河南的泡菜樣品中微生物種群最為豐富，吉林的泡菜樣品中產(chǎn)酸菌數(shù)量最多。從自然發(fā)酵的蔬菜和水果中分離出來的主要乳酸菌屬包括乳酸桿菌(Lactobacillus)、明串株菌(Leuconostoc)、魏斯氏菌(Weissella)、腸球菌(Enterococcus)和球菌(Pediococcus)等[16-17]。

2 泡菜中的微生物群落結(jié)構(gòu)對泡菜質(zhì)量的影響

泡菜的質(zhì)量指標與泡菜中的菌群結(jié)構(gòu)有著密切的相關(guān)性，有些微生物的存在會導(dǎo)致其質(zhì)量的下降，而有些微生物的存在則起到改善調(diào)節(jié)作用。

2.1 泡菜的質(zhì)構(gòu)及風味

泡菜發(fā)酵過程中的微生物直接影響著泡菜的質(zhì)構(gòu)及風味。陳卓等[18]以分離于自然發(fā)酵泡菜中的植物乳桿菌和酵母菌作為功能菌強化發(fā)酵制作泡菜，結(jié)果表明自然發(fā)酵泡菜風味與人工接種功能菌發(fā)酵泡菜風味差異較大，不同發(fā)酵時間和接種量的泡菜風味物質(zhì)的種類和含量也有所差異。代程洋等[19]對比15株發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentatum)和15株植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)對發(fā)酵泡菜的質(zhì)構(gòu)特性及風味的影響，結(jié)果表明，發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵泡菜的咀嚼性顯著高于植物乳桿菌(P<0.05)，且純種發(fā)酵泡菜的硬度、脆性及咀嚼性均高于自然發(fā)酵組；植物乳桿菌發(fā)酵的泡菜水酸味值和芳香型氣味值顯著高于發(fā)酵乳桿菌(P<0.05)，且略高于自然發(fā)酵組。

2.2 泡菜的品質(zhì)

泡菜發(fā)酵過程中的微生物直接影響著其品質(zhì)的好壞。工業(yè)化泡菜生產(chǎn)中經(jīng)常會出現(xiàn)泡菜發(fā)臭、發(fā)黃、軟腐等品質(zhì)敗壞現(xiàn)象，這些品質(zhì)的改變直接與發(fā)酵過程中的微生物相關(guān)。泡菜發(fā)酵過程中芽孢桿菌和多種酵母菌如假絲酵母、釀酒酵母等常會導(dǎo)致泡菜表面長出一層白膜，即“生花”現(xiàn)象，從而導(dǎo)致品質(zhì)敗壞并產(chǎn)生不愉快的酸臭味[20]。蔡炯等[21]以腐敗四川泡菜為研究對象，對其菌相構(gòu)成和主要腐敗菌特性進行研究，菌株致腐特性結(jié)果顯示B.methylotrophicus、B.subtilis、B.licheniformis、P.peoriae和P.membranifaciens是腐敗泡菜中主要的腐敗微生物。易宇文等[22]從泡菜中分離純化生花菌株，通過分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為畢赤酵母菌。

2.3 生物胺含量

泡菜中的生物胺含量與菌群結(jié)構(gòu)相關(guān)。由于微生物的代謝活動，發(fā)酵食品中可以產(chǎn)生生物胺，泡菜中的天然微生物菌群是影響發(fā)酵過程中形成的生物胺量的一個重要因素。植物乳桿菌是泡菜中最常見的鑒定組，由于受到菌群、輔料、儲藏條件等多種因素的影響，天然發(fā)酵泡菜中的植物乳桿菌菌株可產(chǎn)生不同范圍低濃度的生物胺，但多數(shù)不在毒性范圍內(nèi)[23]。四川泡菜中主要的生物胺為腐胺、尸胺、組胺、酪胺，其中能產(chǎn)生生物胺的細菌包括解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、特基拉芽孢桿菌(Bacillustequilensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)，其中R.ornithinolytica含有賴氨酸脫羧酶cacd基因和組氨酸脫羧酶hdc基因，回接培養(yǎng)基驗證了其具有尸胺和組胺形成能力[24]。

2.4 亞硝酸鹽

亞硝酸鹽的積累是腌菜、泡菜發(fā)酵中常見的問題，尤其是未腌制完全的蔬菜。亞硝酸鹽是能引起癌癥和其他健康問題的N-亞硝基化合物的前體，降低亞硝酸鹽濃度對保證食品安全供應(yīng)具有重要意義。即使是同一品種蔬菜，亞硝酸鹽含量也可能相差很大[25]。泡菜中的亞硝酸鹽含量與發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。泡菜發(fā)酵過程中有些微生物的存在會促進亞硝酸鹽含量的增加，而有些微生物則對其有降解作用。朱琳等[26]對蘿卜泡菜發(fā)酵液中亞硝酸鹽濃度峰值期和回落期時細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性進行研究，結(jié)果表明，伴隨著亞硝酸鹽濃度變化，蘿卜泡菜發(fā)酵過程中細菌群落結(jié)構(gòu)多樣性也發(fā)生演替，與發(fā)酵液中亞硝酸鹽的形成和降解密切相關(guān)。其中，亞硝酸鹽峰值期發(fā)酵液樣品中以變形菌門細菌最為優(yōu)勢，以Erwinia、Aeromonas、Pseudomonas、Shigella和Delftia(5.1%)為主要優(yōu)勢菌屬；厚壁菌門為第二優(yōu)勢菌門，Lactococcus為其中的主要優(yōu)勢屬。回落期發(fā)酵液樣品中以厚壁菌門最為優(yōu)勢，優(yōu)勢屬包括Leuconostoc、Lactococcus、Weissella和Pediococcus等。曹佳璐[27]對重慶家庭制傳統(tǒng)泡菜的分析表明亞硝酸鹽含量僅與費爾斯莫爾德鎮(zhèn)乳桿菌(Lb.versmoldensis)存在顯著正相關(guān)，與Enterobacteriaceae細菌及其他優(yōu)勢菌群無顯著相關(guān)性。

乳酸菌發(fā)酵能降低泡菜中的亞硝酸鹽含量。與自然發(fā)酵相比，接種腸膜明串珠菌[28]發(fā)酵四川泡菜，人工接種混合菌種(檸檬明串珠菌∶植物乳桿菌植物亞種∶短乳桿菌為2∶3∶1，濃度比)[29]發(fā)酵娃娃菜，采用短乳桿菌LactobacillusbrevisAR123單獨發(fā)酵或與商業(yè)發(fā)酵劑混合發(fā)酵泡菜[30]等方式均能降低亞硝酸鹽含量。采用食竇魏斯氏菌(Weissellacibaria)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)共接種發(fā)酵能降低四川泡菜中亞硝酸鹽和生物胺的濃度[31]。泡菜中的某些乳酸菌對亞硝酸鹽具有降解作用。宋昊芮等[32]從低鹽泡菜發(fā)酵中分離到的多株乳酸菌，對亞硝酸鹽分解能力最強的是干酪乳桿菌，其次是植物乳桿菌，分解能力最差的是食品乳桿菌。郭志華等[33]從泡菜中篩選出6株降解亞硝酸鹽的乳酸菌，其中4株鑒定為植物乳桿菌，2株鑒定為發(fā)酵乳桿菌，其中發(fā)酵乳桿菌JYF2和JYF3具有抑菌性，對革蘭氏陽性菌的抑制作用大于革蘭氏陰性菌。

2.5 雜菌污染

泡菜中的菌群結(jié)構(gòu)與雜菌污染密切相關(guān)，泡菜發(fā)酵過程中存在著雜菌及致病菌污染風險。楊麗等[34]對檢索結(jié)果中13篇文獻的50批次四川泡菜發(fā)酵過程中大腸桿菌消長數(shù)據(jù)進行定量系統(tǒng)評價，結(jié)果表明，四川泡菜發(fā)酵過程中，大腸桿菌在數(shù)量上大體呈現(xiàn)為先升后降的動態(tài)變化模式，大腸桿菌數(shù)量的峰值與初始值之間有顯著的正向相關(guān)。閆鳴霄等[35]根據(jù)15篇涉及發(fā)酵泡菜中微生物高通量測序數(shù)據(jù)的文獻分析泡菜中食源性致病菌存在的風險，表明泡菜發(fā)酵操作方式和泡菜中食源性致病菌污染風險有明顯關(guān)聯(lián)：家庭泡菜易出現(xiàn)腸桿菌屬和假單胞菌屬致病菌，工業(yè)泡菜中李斯特菌屬致病菌出現(xiàn)機會較大；蘿卜、白菜泡菜中出現(xiàn)致病菌的機會相較其他原料泡菜更大；發(fā)酵時間與葡萄球菌屬和李斯特菌屬致病菌的出現(xiàn)表現(xiàn)出明顯的正相關(guān)；高鹽泡菜中金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特菌有可能生長；中、低鹽泡菜中金黃色葡萄球菌和沙門氏菌都可能出現(xiàn)明顯生長，沙門氏菌尤其具有較大的生長優(yōu)勢?？咕匀樗峋鷮χ虏【哂幸志浴Ｅ莶酥械囊恍┤樗峋哂幸志?，如發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌、植物乳桿菌等[36]。

蔬菜發(fā)酵過程中腐敗菌和亞硝酸鹽積累是影響泡菜產(chǎn)業(yè)和消費者健康的常見問題。由于泡菜生產(chǎn)的蔬菜原料表面附著著大量的附生微生物，乳酸菌只占蔬菜原料原始微生物群系的一小部分。Xia等[37]研究表明增加自然發(fā)酵初期乳酸菌數(shù)和鹽濃度可以抑制有害菌，降低亞硝酸鹽的產(chǎn)量，但增加鹽濃度會抑制乳酸菌的生長，延長發(fā)酵周期，影響風味物質(zhì)。因此，低鹽條件下控制有害細菌生長的發(fā)酵技術(shù)是提高泡菜質(zhì)量的關(guān)鍵。Zheng等[38]利用噬菌體控制泡菜發(fā)酵過程中腐敗菌的生長及亞硝酸鹽的產(chǎn)生。

3 前景和展望

發(fā)酵過程中微生物群落的多樣性與鹽濃度、貯藏溫度有關(guān)，而泡菜的各項質(zhì)量指標變化，包括感官、酸度、亞硝酸鹽、大腸菌群等各項理化及衛(wèi)生指標都與發(fā)酵過程中的菌群種類及群落結(jié)構(gòu)相關(guān)。

乳酸菌中有多種類型菌株可以對食源性致病菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有抑菌性，將其應(yīng)用于泡菜發(fā)酵，在發(fā)酵過程中無明顯亞硝酸鹽高峰[39]。香辛料是泡菜發(fā)酵生產(chǎn)中常用的輔料，不同香辛料對乳酸菌生長及抑菌性的影響不同[40]。這表明通過調(diào)整泡菜發(fā)酵過程中的相關(guān)參數(shù)及使用抑菌性乳酸菌有利于實現(xiàn)對泡菜等食品發(fā)酵、運輸和貯藏過程中致病菌風險控制，防止雜菌污染，有效地延長食品保質(zhì)期。獲得具有抑菌、改善發(fā)酵條件的能力及使用安全的乳酸菌對實現(xiàn)低鹽發(fā)酵及生產(chǎn)健康、高品質(zhì)產(chǎn)品、發(fā)酵過程安全控制具有積極意義。