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    酶解法制備低值魚調(diào)味料基質(zhì)的工藝研究

    2022-06-05 02:21:56趙敏楊保衛(wèi)
    中國調(diào)味品 2022年6期
    關(guān)鍵詞:低值酶制劑木瓜

    趙敏,楊保衛(wèi)

    (江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院 酒店學(xué)院,江蘇 淮安 223003)

    我國淡水資源豐富[1],根據(jù)相關(guān)資料顯示,我國2008年淡水魚類的總產(chǎn)量約為1998.4萬噸,到2015年總產(chǎn)量升至2715.01萬噸,而淡水魚占所有魚類總產(chǎn)量的比值也從69.8%攀升至88.5%[2-3]。可見不光是淡水魚產(chǎn)量不斷在提升,淡水魚占我國魚類總產(chǎn)量的比值也在不斷攀升,而在淡水水產(chǎn)中,低值魚的占比每年都能穩(wěn)定在15%~20%左右,產(chǎn)量也不容小覷,具有很大的開發(fā)潛力[4]。

    低值魚泛指形體較小、可食用部分較少的各式小雜魚,這類魚的單種產(chǎn)量均不高,且市場價值都比較低,一般不作為單獨種類上市出售,整體利用價值有限,可以理解為“低價值”的魚,嚴(yán)格意義上來說是缺乏單種整體利用價值,但綜合利用起來還是有一定價值的[5]。常見的淡水低值魚種類有中華鳑鲏(RhodeussinensisGunther)、麥穗魚(Pseudorasboraparva)、棒花魚(Abbottinarivularis)、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)等[6]。這些淡水魚總體產(chǎn)量可觀,但實際直接產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)價值較低,在捕撈后漁民一般將其直接丟棄或者以廉價出售作為禽類飼料、廢料,不僅沒有帶來經(jīng)濟(jì)價值而且污染環(huán)境、浪費資源。隨著食品加工技術(shù)的進(jìn)步,現(xiàn)階段也有不少關(guān)于低值魚深加工產(chǎn)品的研究,例如魚粉[7]、魚糜[8]、魚松[9]、魚蛋白水解制品[10]等,但目前的相關(guān)研究與低值魚產(chǎn)量逐年增加、資源浪費嚴(yán)重的現(xiàn)狀相比,還存在著極大的不協(xié)調(diào)。

    本研究以低值魚為原料制備調(diào)味料基質(zhì),與傳統(tǒng)海水魚制備魚露的方式不同,淡水低值魚類更易受腐敗菌影響,一般使用加鹽發(fā)酵法制備淡水水產(chǎn)調(diào)味料,但此種工藝下生產(chǎn)的調(diào)味料極不穩(wěn)定。本文擬采用現(xiàn)代酶解技術(shù)制備低值魚調(diào)味料基質(zhì),首先對比幾種單酶對低值魚蛋白液水解度(degree of hydrolysis, DH,%)的影響,從中選取合適的單酶制劑進(jìn)行兩兩復(fù)配,最終以復(fù)配酶組合形式進(jìn)行復(fù)配酶解實驗。利用單因素實驗、響應(yīng)面實驗等重點對低值魚復(fù)配酶水解工藝進(jìn)行優(yōu)化,提高低值魚蛋白DH值,酶解所獲得的酶解蛋白底液,再通過干燥即可制得調(diào)味料基質(zhì)蛋白粉。

    1 材料與方法

    1.1 原料及試劑

    洪澤湖低值魚,品種包括中華鳑鲏魚(身長3~6 cm之間,單體重約5 g)、白條魚(身長10~20 cm,單體重約15~30 g)、麥穗魚(身長3~10 cm,單體重約5~10 g)、棒花魚(身長5~8 cm之間,單體重約5 g):淮安益地農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司提供;堿性蛋白酶(400000 U/g)、中性蛋白酶(270000 U/g)、木瓜蛋白酶(800000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(60000 U/g):江蘇銳陽生物科技有限公司;無水乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、95%乙醇:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;甲基紅、甲基綠:上海展云化工有限公司;次甲基藍(lán):天津福晨化學(xué)試劑廠。

    1.2 儀器與設(shè)備

    HH-6型恒溫水浴鍋 常州潤華儀器制造有限公司;DHG-9053A型恒溫鼓風(fēng)干燥機(jī) 無錫瑞瑪特科技有限公司;DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;TD5A型低速臺式離心機(jī) 常州金壇良友儀器有限公司;DS-1型高速組織搗碎機(jī)、LP502B型電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;pHS-3C型精密pH計 上海葉拓科技有限公司;SVAC1-2 SHELLAB真空干燥箱 美國SHELLAB公司;FOSS KJELTEC 2300全自動凱氏定氮儀 珠海市造鑫企業(yè)有限公司;RE-1002旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海秉越電子儀器有限公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 工藝流程

    去內(nèi)臟→清洗→瀝干→打漿→酶解→滅酶→離心→反壓濃縮→真空干燥→半成品。

    1.3.2 操作要點

    1.3.2.1 酶解

    參照文獻(xiàn)[11]的方法,首先進(jìn)行多種單酶對比實驗,在此基礎(chǔ)上進(jìn)行混合酶制劑的復(fù)配,酶解過程中生成的苦味物質(zhì)與酶解時間有關(guān),復(fù)合酶的使用有利于縮短酶解時間,從而降低苦味物質(zhì)的生成量。

    1.3.2.2 離心

    設(shè)置離心轉(zhuǎn)速為5000 r/min,溫度為4 ℃進(jìn)行低溫離心,取少量上浮的油脂待用,取上清液,余下沉淀物質(zhì)待用。

    1.3.2.3 反壓濃縮

    設(shè)置真空度為0.1 MPa,壓縮溫度為83 ℃,蒸發(fā)速率約為20 mL/min,不同液體量蒸發(fā)速率有差異。

    1.3.3 單酶對魚蛋白水解度的影響

    1.3.3.1 不同種類酶制劑的選擇

    根據(jù)現(xiàn)有相關(guān)研究,選擇堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶4種蛋白酶進(jìn)行單酶水解實驗,分別在不同酶制劑最適的酶解條件下對比其對低值魚蛋白水解度(DH,%)的大小[12]。各種酶制劑最適反應(yīng)條件詳見表1。

    表1 不同酶制劑的最適酶解條件Table 1 The optimum enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes

    1.3.3.2 水解度測定

    參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2016[13]以及梁凱等[14]研究的相關(guān)描述,氨基酸態(tài)氮含量的測定采用甲醛滴定法,而總氮含量則采用自動凱氏定氮法測定。

    1.3.4 復(fù)合酶對魚蛋白水解度的影響

    分別在4種單酶最適的pH環(huán)境下進(jìn)行酶解實驗,各實驗組魚蛋白樣品中均加入3倍質(zhì)量的無菌水,控制其他條件不變(時間5 h、溫度50 ℃、加酶量1%),通過對比實驗優(yōu)選出水解效果較好的酶。

    組合復(fù)配多種酶制劑對蛋白質(zhì)的酶解作用相較單一酶而言要更顯著,水解液的風(fēng)味受復(fù)配酶制劑協(xié)同作用的影響較大,一般而言酶制劑種類越多,水解參數(shù)越復(fù)雜,形成酶解溶液的穩(wěn)定性也越難把控[15]。故而進(jìn)行復(fù)配酶酶解實驗,以水解度為評價指標(biāo),酶制劑復(fù)配比、復(fù)配酶用量、酶解pH、酶解溫度這4個因素為自變量,在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

    1.3.5 復(fù)配酶水解工藝優(yōu)化

    1.3.5.1 復(fù)配酶水解單因素實驗

    在上述預(yù)實驗的基礎(chǔ)上采用控制變量法進(jìn)行單因素實驗,4個單因素的梯度分別設(shè)置為:酶制劑復(fù)配(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6;復(fù)配酶用量0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%;酶解pH 6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5以及酶解溫度45,50,55,60,65 ℃。固定參數(shù)為酶解時間5 h、酶制劑復(fù)配比1∶1、復(fù)配酶用量1%、酶解pH 7.0以及酶解溫度50 ℃。

    1.3.5.2 響應(yīng)面實驗優(yōu)化水解工藝

    在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行4因素3水平的響應(yīng)面實驗,優(yōu)化確定最佳的復(fù)配酶水解魚蛋白工藝參數(shù),因素水平設(shè)置詳見表2。

    表2 響應(yīng)面因素水平表

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    運用Design Expert 8.0軟件、IBM SPSS Statistics 21.0以及Origin 7.5等軟件進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計、統(tǒng)計學(xué)分析以及繪圖。所有實驗均為3次平行實驗后的平均值。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 單酶對魚蛋白水解度的影響

    魚蛋白的水解度受不同單酶制劑的影響見圖1,由于酶切點不同,各酶制劑的酶解效果也不一樣[16]。

    圖1 單酶對魚蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of single enzyme on the degree of hydrolysis of fish protein

    由圖1可知,各單酶酶解魚蛋白的總體變化趨勢相似,隨著酶解時間的延長,DH均呈現(xiàn)上升趨勢。其中,對魚蛋白水解效果最好的是堿性蛋白酶,而最差的是風(fēng)味蛋白酶,中性蛋白酶與木瓜蛋白酶的效果居中。而且當(dāng)酶解時間在0~1 h范圍內(nèi)時,魚蛋白的DH值上升最為顯著,當(dāng)酶解時間超過3 h之后,魚蛋白的DH值上升趨勢逐漸趨于平穩(wěn)。綜合考慮,剔除酶解效果最差的風(fēng)味蛋白酶,下一步實驗選取堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶這3種酶制劑進(jìn)行兩兩復(fù)配。

    2.2 不同復(fù)配酶對魚蛋白水解度的影響

    圖2 復(fù)配酶對魚蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of complex enzymes on the degree of hydrolysis of fish protein

    由圖2可知,不同復(fù)配酶的酶解效果隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)的趨勢,整體趨勢與單酶酶解類似,但具體幅度存在差異,當(dāng)酶解時間在0~2 h范圍內(nèi)時,DH值的上升幅度最大,當(dāng)酶解時間超過2 h時,隨著時間的延長,3組復(fù)配酶對DH的增強(qiáng)效果均趨于平緩。其中,中性蛋白酶+木瓜蛋白酶復(fù)配組的水解效果最好,水解效果最差的是堿性蛋白酶+木瓜蛋白酶復(fù)配組,堿性蛋白酶+中性蛋白酶復(fù)配組水解效果居中。究其原因可能是各個單酶制劑的最佳酶解條件和酶切肽鏈點各不相同,將不同單酶復(fù)配后可能產(chǎn)生協(xié)同作用,但也可能產(chǎn)生拮抗作用,所以出現(xiàn)不同單酶復(fù)配后酶解效果差異較大的局面[17]。綜合考慮,選擇木瓜蛋白酶+中性蛋白酶的組合進(jìn)行下一步的復(fù)配酶解實驗。

    2.3 復(fù)配酶水解魚蛋白單因素實驗

    2.3.1 復(fù)配酶配比對魚蛋白DH的影響

    圖3 復(fù)配酶配比對魚蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of ratios of complex enzymes on the degree of hydrolysis of fish protein

    在前期實驗的基礎(chǔ)上,選擇中性蛋白酶+木瓜蛋白酶的復(fù)配組合,考察在不同復(fù)配比例下對魚蛋白DH的影響效果。由圖3可知,在復(fù)配酶(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)配比由1∶1變化至1∶6的范圍區(qū)間,魚蛋白的DH值由34.3%下降到28.8%,且呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。綜合考慮,選擇中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶復(fù)配配比1∶1~1∶3為下一步響應(yīng)面優(yōu)化的實驗范圍。

    2.3.2 復(fù)配酶用量對魚蛋白DH的影響

    圖4 復(fù)配酶用量對魚蛋白水解度的影響

    由圖4可知,當(dāng)復(fù)配酶用量由0.25%增加至1.5%時,魚蛋白的DH值總體呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢,而且加酶量在0.25%~1%的范圍內(nèi)時,DH值上升幅度較大、速率較快,當(dāng)加酶量超過1%時,DH值呈現(xiàn)較為平穩(wěn)的上升趨勢,增長速率明顯變慢,這是因為當(dāng)復(fù)配酶濃度增加到一定程度時,水解溶液已趨向于飽和狀態(tài),魚蛋白的DH值不會隨著加酶量的增加而明顯上升。另外,從水解過程成本控制的角度出發(fā),綜合考慮后選擇復(fù)配酶用量0.75%~1.25%為下一步響應(yīng)面優(yōu)化的實驗范圍。

    2.3.3 酶解pH對魚蛋白DH的影響

    圖5 pH對魚蛋白水解度的影響Fig.5 Effect of pH on the degree of hydrolysis of fish protein

    根據(jù)中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的建議反應(yīng)條件確定復(fù)配酶水解魚蛋白pH值單因素范圍為6~8.5。由圖5可知,隨著pH值的增加,魚蛋白的DH值呈現(xiàn)先上升后逐漸下降的趨勢,在pH值為7時,即溶液達(dá)到中性環(huán)境時,DH達(dá)到最大值,為34.8%;當(dāng)酶解pH值大于7時,即溶液向堿性趨近時,DH值呈現(xiàn)顯著下降趨勢(p<0.05)。綜合考慮,選擇酶解pH值7為下一步響應(yīng)面實驗的中心點。

    2.3.4 酶解溫度對魚蛋白DH的影響

    圖6 溫度對魚蛋白水解度的影響

    由圖6可知,魚蛋白DH值隨著溫度的變化而產(chǎn)生了較大變化,隨著溫度由40 ℃升高至65 ℃的過程中,DH值的變化呈現(xiàn)先上升后緩慢下降的趨勢,這是因為適當(dāng)?shù)臏囟饶苡行嵘复俜磻?yīng)速率,加劇蛋白質(zhì)水解反應(yīng)程度[18],DH值在反應(yīng)溫度為55 ℃時達(dá)到最大值35.2%,當(dāng)溫度超過55 ℃時,DH值逐漸下降。綜合考慮,選擇酶解溫度55 ℃作為下一步響應(yīng)面實驗的中心點。

    2.4 復(fù)配酶水解魚蛋白響應(yīng)面優(yōu)化

    2.4.1 響應(yīng)面設(shè)計結(jié)果及方差分析

    使用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行BBD實驗組合設(shè)計4因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗,以魚蛋白DH值為響應(yīng)值Y,設(shè)計方案及結(jié)果見表3,方差分析結(jié)果見表4。

    表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 The design and results of BBD experiments

    續(xù) 表

    表4 方差分析結(jié)果Table 4 The results of variance analysis

    對實驗設(shè)計組配的29組數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面擬合以及統(tǒng)計學(xué)分析,可得魚蛋白的DH值關(guān)于所選4個因素的擬合回歸方程,具體如下:

    Y(DH,%)=34.86-0.98A+0.59B-0.44C-1.12D+0.45AB+0.30AC-1.20AD-0.40BC+0.63BD+0.83CD-0.51A2-2.09B2-2.17C2-1.90D2。

    由表3和表4所得數(shù)據(jù)可知,所構(gòu)建的模型的p<0.0001,表明該模型極顯著,而失擬項的p=0.0731,>0.05,說明失擬項不顯著(p>0.05),模型的擬合程度良好,該回歸方程可用于描述復(fù)配酶配比(A)、加酶量(B)、酶解pH值(C)以及酶解溫度(D)和魚蛋白水解程度的關(guān)系。方差分析結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)R2=0.9486,遠(yuǎn)大于0.9,說明模型預(yù)測值與真實值的相關(guān)性很高[19]。比較F值大小可得,4個因素中,對魚蛋白DH值影響程度的大小依次為D>A>B>C,與單因素實驗結(jié)果契合,其中一次項A、B、D和二次項B2、C2、D2極顯著(p<0.01),而顯著項有一次項C和交互項CD(p<0.05),其余各項不顯著(p>0.05)。

    2.4.2 響應(yīng)曲面與等高線分析

    Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法在生物培養(yǎng)基優(yōu)化、藥劑制備以及食品加工工藝優(yōu)化中已被廣泛應(yīng)用。3D響應(yīng)曲面直接顯示出了各因素對魚蛋白酶解工藝的影響趨勢,而平面等高線圖中線與線之間的疏密度則表現(xiàn)了兩個不同因素交互對魚蛋白酶解工藝的影響程度,3D曲面圖坡度越陡、等高線呈橢圓形且越密集,說明該交互項對魚蛋白酶解工藝的影響越大[20]。呈顯著性的交互項等高線圖及響應(yīng)曲面圖見圖7。

    a

    b

    由圖7可知,圖7中b的響應(yīng)面坡度較圖7中a的要陡峭,且等高線也較為密集,這說明復(fù)配酶配比、酶解溫度這兩個因素之間的交互對魚蛋白酶解工藝的影響最為顯著,這與表4中方差分析所顯示的結(jié)論一致。而其余各因素之間的3D響應(yīng)曲面圖、等高線圖較為稀疏。

    2.4.3 復(fù)配酶最佳水解工藝及驗證

    使用Design Expert 8.0軟件對響應(yīng)面實驗結(jié)果進(jìn)行最終優(yōu)化求解,將目標(biāo)值魚蛋白的DH設(shè)為最大值,所得復(fù)配酶最佳水解工藝見表5。

    表5 復(fù)配酶最佳水解工藝

    軟件顯示第一組的酶解工藝參數(shù)最優(yōu),在此參數(shù)下進(jìn)行5組平行實驗,最終得到的DH值為35.41%的可能性高達(dá)93.5%。根據(jù)實際操作情況,確定復(fù)配酶水解魚蛋白的工藝參數(shù)為:復(fù)配酶配比1∶1、加酶量1%、酶解pH 6.9、酶解溫度55 ℃,在此條件下再進(jìn)行驗證實驗,最終結(jié)果顯示魚蛋白的DH值為(35.32±0.21)%,與預(yù)測值的差異僅為0.25%,由此可驗證本研究所得的理論模型與實際情況有較好的擬合度,能有效地反映出復(fù)配酶配比、加酶量、酶解pH以及酶解溫度等因素與魚蛋白DH值的關(guān)系,可用于指導(dǎo)復(fù)配酶水解魚蛋白的實際生產(chǎn)。

    3 結(jié)論

    本研究用現(xiàn)代酶解技術(shù)制備低值魚調(diào)味料基質(zhì),首先對比了中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶這4種單酶對魚蛋白DH值的影響,選取了堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶這3種酶制劑進(jìn)行兩兩復(fù)配,最終選擇木瓜蛋白酶+中性蛋白酶的組合進(jìn)行復(fù)配酶解實驗。以魚蛋白的DH值為目標(biāo)值,在單因素實驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面實驗,優(yōu)化低值魚蛋白復(fù)配酶水解工藝,響應(yīng)面實驗所得模型擬合程度良好(p<0.0001),得出最終的最優(yōu)水解工藝參數(shù)為:復(fù)配酶配比(中性蛋白酶∶木瓜蛋白酶)1∶1、加酶量1%、酶解pH 6.9、酶解溫度55 ℃。驗證實驗證明,在此工藝條件下進(jìn)行水解,魚蛋白DH值最高,為(35.32±0.21)%,較優(yōu)化之前的各組有顯著提升(p<0.05)。該研究為酶解法制備低值魚調(diào)味料基質(zhì)提供了科學(xué)指導(dǎo),不僅對價值較低的魚類資源進(jìn)行了有效利用,而且對豐富調(diào)味品市場的產(chǎn)品種類提供了新方向。

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