香薷精油與多酚的提取及抗氧化活性研究

陳林林，張佳欣，吳嘉樹，李偉，范天嬌，楊茜瑤，鄭鳳鳴

(哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，哈爾濱 150028)

香薷全草可入藥，是一種藥食同源的植物，主要生長在丘陵和路邊[1]。香薷富含化合物，目前已鑒定出60多種，主要為萜烯、酯、醇、酚、醛等[2]。在食品中可以作為調(diào)味品、添香劑[3]。香薷通過萃取得到的精油能夠延緩甚至抑制微生物對食品的作用，可以作為一種天然抗菌劑，用于食品保鮮[4-5]。因香薷精油特有的風味，可應用于飲料、糕點等食品行業(yè)中[6]。

多酚作為香薷次生代謝產(chǎn)生的一類天然有機化合物，存在于香薷的各種組織中[7]，可以減少細胞和組織中的氧化損傷，是一種天然的抗氧化劑，主要應用在醫(yī)藥、食品等領域[8]。郭彩慧等[9]測定了青花椒中多酚的抗氧化能力，結果表明多酚是一種有效的抗氧化劑。陳仕學等[10]從不同類型的茶葉中提取茶多酚，并對其抗氧化能力進行檢測，實驗結果表明不同茶葉中的茶多酚清除自由基的能力不同。

本文利用水蒸氣蒸餾提取香薷中的精油，并用有機溶劑提取殘渣中的多酚。利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術分析精油成分組成，高效液相色譜法確定多酚溶液中成分組成并對精油以及殘渣中的多酚進行了抗氧化活性研究，為香薷的利用提供了依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

香薷：黑龍江省牡丹江市；乙酸鈉：天津市福晨化學試劑廠；冰醋酸：天津市永大化學試劑有限公司；三氯化鐵：天津市雙船化學試劑廠；抗壞血酸(VC)：西隴化工股份有限公司；鄰苯三酚(焦性沒食子酸)：天津市光復精細化工研究所；2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：薩恩化學技術(上海)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：東京化成工業(yè)株式會社；三羥甲基氨基甲烷(Tris)：天津市泰興試劑廠；2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)。

UV 5100B型紫外可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；TU-1900型紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；DC-2006型低溫恒溫槽 寧波海曙天恒儀器廠；GC7890B/MS5977B型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司；Ultimate 3000型高效液相色譜儀 美國賽默飛世爾公司；XT 220A型精密電子天平 瑞士普利賽斯儀器公司；W501型升降恒溫水浴鍋 上海申勝生物技術有限公司；R-1001型旋轉蒸發(fā)儀 鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2 香薷精油的提取

取干燥的香薷籽粒150 g放于3 L的三頸燒瓶中，通過水蒸汽蒸餾從香薷中提取精油。加入體積為2 L的蒸餾水，使其完全浸泡，并放置在油浴鍋中在115 ℃油浴加熱。加熱5～7 h，當回流管中不再餾出精油，停止加熱，降至室溫后，收集從回流管蒸餾的精油，并將該混合物于4 ℃冷藏16 h，收集精油，稱取質(zhì)量，平行3次[11-12]，按公式(1)計算精油得率：

(1)

式中：m為收集的精油質(zhì)量，g；m0為香薷籽?？傎|(zhì)量，g。

1.3 殘渣中多酚含量的計算

用紗布包裹提取精油后的香薷殘渣，擠壓除去大部分水分，再置于烘箱中烘干，除去殘渣中的水分并用粉碎機粉碎。取2 g粉碎后的殘渣置于錐形瓶中，采用超聲波輔助法，加入60%的乙醇溶液20 mL，采用層析分離法[13]使多酚溶液濃度為29.46 mg/mL。用預處理后的AB-8大孔樹脂并加入10 mL的多酚溶液，采用pH為6的50%乙醇對多酚純化，吸附時間為6 h，得到多酚提取液，于45 ℃在60 min時測定上層清液的吸光度。

制備濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸溶液，隨后稱取0.25 g硫酸亞鐵和1.25 g酒石酸鈉，用蒸餾水溶解定容至250 mL，得到酒石酸亞鐵顯色劑。準確稱量0.1362 g磷酸二氫鈉，2.0315 g磷酸氫二鈉，溶解稀釋至100 mL，制得pH為7.5的緩沖溶液[14]。

量取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL的沒食子酸溶液，加入2 mL著色劑和5 mL緩沖液，定容至10 mL，并于540 nm處測量吸光值，按公式(2)計算多酚得率：

(2)

式中：C0為多酚濃度，mg/mL；V0為提取后溶液體積，mL；m0為加入殘渣質(zhì)量，g。

1.4 GC-MS分析香薷精油成分組成

采用GC-MS對香薷精油的組成成分及對應的含量進行分析檢測，方法測定的條件如下：

GC分析條件：色譜柱：彈性石英毛細管柱HP-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)；載氣為氦氣，氦氣流量：1 mL/min；進樣口的溫度為250 ℃，進樣分流，進樣分流比為100∶1；程序升溫：柱溫在60 ℃保持1 min，隨后以8 ℃/min升至240 ℃，并保持5 min。

MS分析條件：電離方式為EI離子源；離子源溫度是230 ℃；質(zhì)量掃描范圍：33～550 amu；四級桿溫度：150 ℃；電離電壓：70 eV[15]。

1.5 HPLC確定多酚提取液的成分組成

對殘渣中多酚的提取液進行液相色譜分析，分析條件：色譜柱：XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相是色譜級別的甲醇(A)-純水(B)進行梯度洗脫：0～10 min：26% A，74% B；10～10.1 min：50% A，50% B；10.1～25 min：50% A，50% B。流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為280 nm；每次進樣10 μL[16]。

1.6 香薷精油及多酚提取液抗氧化能力測定

1.6.1 清除DPPH自由基能力

以無水乙醇為溶劑，制備不同濃度梯度的香薷精油溶液，制得的香薷精油質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1，3，5，7，9 mg/mL，以同樣濃度的VC溶液和BHT溶液作為樣品對照溶液。將無水乙醇作為對照溶液，量取1 mL待測液，4 mL DPPH溶液(2×10-4mol/L)，放于避光處，室溫下靜置30 min，于517 nm測吸光度A。同樣條件下測定1 mL待測液，4 mL無水乙醇的吸光度記為A0；1 mL無水乙醇，4 mL DPPH的吸光度記為A1[17]，按公式(3)計算清除率：

(3)

1.6.2 清除超氧陰離子自由基能力

量取體積為0.1 mL不同濃度梯度的待測液，添加0.5 mL吐溫80溶液和6 mL Tris鹽酸緩沖溶液(50 mmol/L，pH 8.2)，25 ℃反應20 min后加入體積為0.1 mL 25 ℃的鄰苯三酚溶液(10 mmol/L)反應4 min，再加入6 mol/L的鹽酸溶液。將待測溶液放于420 nm處測定吸光值A，用蒸餾水替代樣品，取同組的相同樣品溶液，加入6 mL緩沖溶液，加蒸餾水使體積與樣品組一致，然后測量其吸光度A1。將VC、BHT配成濃度梯度與待測樣品一樣的溶液，替代香薷精油和多酚提取液加入試管中，其他具體操作步驟相同，分別測得A、A0、A1[18-19]，按公式(3)計算清除率。

1.6.3 清除ABTS+自由基能力

準確稱取0.1921 g ABTS與0.0331 g過硫酸鉀混合，并用蒸餾水稀釋體積至50 mL，ABTS溶液為7 mmol/L，室溫條件下避光靜置12～16 h后加入磷酸鹽緩沖液(0.01 mol/L，pH 7.4)，734 nm處該混合溶液的吸光值為0.70。隨后，將1 mL不同濃度的待測溶液和5 mL制得的ABTS反應液振蕩使其混合均勻，放置在室溫下靜置10 min后在734 nm處測吸光值記為As。在相同條件下，以不加入樣品的ABTS溶液為對照組，測其吸光值記為A0[20-21]，按公式(4)計算清除率：

(4)

1.6.4 FRAP總抗氧化能力

準確稱取4.0678 g乙酸鈉，加4 mL冰醋酸，定容至250 mL；準確稱取0.0781 g TPTZ粉末，加83 μL濃鹽酸，并用蒸餾水定容至25 mL；精準稱取0.1621 g的FeCl3，加入30 mL蒸餾水，充分搖晃使其均勻。將制備的溶液按照10∶1∶1進行混合，得到FRAP溶液。量取1 mL不同梯度濃度的待測液加入FRAP溶液6 mL，在37 ℃的水浴中搖勻，加熱10 min，并在593 nm處測量吸光值A[22]。

2 結果與討論

2.1 GC-MS分析香薷精油成分

采用水蒸氣蒸餾法對香薷籽粒進行蒸餾，共計3次，結果見表1。

表1 香薷中精油得率Table 1 The extraction rate of essential oils from Elsholtzia ciliata

由表1可知，通過水蒸氣蒸餾法從香薷中得到的精油平均得率為0.4135%。香薷精油相對標準偏差為4.7400%，相對標準偏差小于5%，說明精油產(chǎn)率數(shù)據(jù)符合實驗要求，實驗操作誤差小，重復性好，收集的精油可以用于接下來抗氧化活性的研究。

2.2 沒食子酸標準曲線的繪制

按照1.3中的步驟在沒食子酸濃度和吸光度值之間建立標準曲線，結果見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 The standard curve of gallic acid

回歸方程為Y=0.0141X+0.0006，r=0.9981，濃度范圍在0～10 μg/mL，線性關系良好，可以將沒食子酸用作對照，用于計算提取液中多酚的濃度。

2.3 GC-MS測定香薷精油成分

圖2 香薷精油的GC-MS總離子流譜圖Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of Elsholtzia ciliataessential oils

由圖2可知，在香薷精油中檢測到25種成分。使用NIST 98質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫作為對照，定性分析這25種成分，并使用峰面積歸一化方法定量分析了香薷精油的成分，結果見表2。

表2 香薷精油成分GC-MS解析結果Table 2 GC-MS analysis results of Elsholtzia ciliataessential oil components

續(xù) 表

由表2可知，所鑒定的香薷精油共有25種成分，其中，香薷酮相對含量最高(46.50%)，其次是1-甲基-3-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯(43.08%)，蛇麻烯的相對含量為2.79%，芳樟醇為1.61%。通過計算得知，這4種物質(zhì)占香薷精油總含量的93.98%，可以認為是香薷精油香氣的主要成分。

2.4 高效液相色譜法確定多酚提取液成分

圖3 多酚提取液的液相色譜圖Fig.3 The liquid chromatogram of polyphenol extract

根據(jù)圖3中峰面積的計算，多酚提取液中多酚的相對含量為41.24%。其中保留時間為8.870 min的組分峰值最高，故而可認為該組分為香薷多酚的主要組成成分。計算出多酚提取液中的多酚含量為45.5125 mg/mL。

2.5 香薷精油及多酚提取液抗氧化能力測定

2.5.1 清除DPPH自由基能力

圖4 清除DPPH自由基能力Fig.4 The DPPH free radical scavenging ability

由圖4可知，在0～9.0 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，每個樣品的DPPH自由基的清除率均呈現(xiàn)上升趨勢(P<0.05)，其中VC的上升趨勢相對平緩。在該濃度范圍內(nèi)VC的最大清除率為65.16%，BHT的最大清除率為63.09%。多酚提取液清除率在濃度為5 mg/mL時超過BHT，當濃度超過7 mg/mL時，多酚提取液清除率超過VC，在9.0 mg/mL時，達到最大值68.36%，隨著濃度的繼續(xù)增加，對DPPH自由基的清除能力保持上升的趨勢(P<0.01)；對于DPPH自由基的清除能力，香薷精油小于VC、多酚提取液和BHT，清除率在濃度為9.0 mg/mL時達到最大值60.59%，是同濃度下BHT的96.04%，香薷精油隨著濃度的增加，清除率接近BHT(P<0.01)。

2.5.2 清除超氧陰離子自由基能力

圖5 超氧陰離子自由基清除能力Fig.5 The superoxide anion free radical scavenging ability

由圖5可知，樣品濃度在0～1.0 mg/mL范圍內(nèi)時，每個樣品都呈現(xiàn)出急劇上升的趨勢(P<0.05)，在1.0～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)VC、香薷精油和BHT的清除能力逐漸趨于平緩，多酚提取液的清除率保持上升的趨勢(P<0.05)。在該濃度范圍中VC的最大清除率為91.55%，BHT的最大清除率為90.57%。當濃度超過1.0 mg/mL時，多酚提取液對超氧陰離子自由基的清除能力開始超過BHT，并在3 mg/mL時超過VC，在5.0 mg/mL時清除率最高，達到95.54%，而且多酚提取液的清除能力隨著濃度的增加而增大(P<0.01)；對于超氧陰離子自由基的清除能力，香薷精油低于VC、多酚提取液和BHT，在5.0 mg/mL可達到最大值89.82%，是同濃度下BHT清除率的99.17%，隨著濃度的增加，清除能力逐漸接近于BHT(P<0.01)。

2.5.3 清除ABTS+自由基能力

圖6 ABTS+自由基清除能力Fig.6 The ABTS+ free radical scavenging ability

由圖6可知，當濃度在0～0.5 mg/mL范圍內(nèi)，各樣品對ABTS+自由基清除能力均有明顯增強的趨勢(P<0.05)，當濃度高于0.1 mg/mL時各樣品的抗氧化能力增加的趨勢變得緩慢。在該濃度范圍中VC的最大清除率為87.40%，BHT的最大清除率為69.20%。對于ABTS+自由基的清除能力，多酚提取液>VC>BHT>香薷精油。多酚提取液的最大清除率在0.5 mg/mL時達到最大值，是同濃度下VC的104.92%，BHT的132.51%；香薷精油的最大清除能力在0.5 mg/mL時達到最大值，是同濃度下BHT清除能力的94.94%，隨著濃度的增加，清除能力逐漸接近BHT(P<0.05)。

2.5.4 FRAP總抗氧化能力

圖7 FRAP總抗氧化能力Fig.7 FRAP total antioxidant capacity

由圖7可知，當濃度在0～0.09 mg/mL范圍內(nèi)，各樣品FRAP總抗氧化能力隨濃度增長明顯增強(P<0.05)；多酚提取液的FRAP總抗氧化能力高于BHT，小于VC和香薷精油，在0.09 mg/mL時對FRAP總抗氧化能力最強，是同濃度下BHT的102.21%，VC的95.15%，并且隨濃度的升高呈現(xiàn)穩(wěn)定上升的趨勢；在濃度大于0.03 mg/mL時，香薷精油的FRAP總抗氧化能力>VC>多酚提取液>BHT，在0.09 mg/mL時FRAP總抗氧化能力是VC的100.31%，BHT的107.75%。

2.5.5 抗氧化活性間的相關性分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進行相關性分析，采用Pearson進行顯著性檢驗，以P<0.05為顯著性檢驗標準。

表3 香薷精油的4種抗氧化性評價方法的相關性Table 3 The correlation of four antioxidant evaluation methods of Elsholtzia ciliata essential oils

由表3可知，在測定香薷精油的抗氧化活性中，香薷精油對DPPH自由基的清除能力與超氧陰離子自由基、ABTS+自由基的清除能力、FRAP的總還原能力之間的線性關系非常顯著(P<0.01)；對于超氧陰離子自由基的清除能力和FRAP的總還原能力之間同樣存在非常顯著的線性關系(P<0.01)，香薷精油對于其他抗氧化活性基團指標之間的相關程度并不明顯。

表4 香薷多酚提取液的4種抗氧化性評價方法的相關性Table 4 The correlation of four antioxidant evaluation methods of Elsholtzia ciliata polyphenol extract

由表4可知，在4種用于測定香薷殘渣中多酚提取液抗氧化活性的評價方法中，多酚對于DPPH自由基與超氧陰離子自由基、ABTS+自由基、FRAP總還原能力存在的線性關系非常顯著(P<0.01)；超氧陰離子自由基的清除能力與FRAP總還原能力之間線性關系非常顯著(P<0.01)，超氧陰離子自由基還與ABTS+自由基呈現(xiàn)線性相關(P<0.05)；對于ABTS+自由基的清除能力與FRAP總還原能力線性關系顯著(P<0.05)，多酚提取液對于其他抗氧化活性基團指標之間的相關程度并不明顯。

3 結論

利用水蒸氣蒸餾法提取香薷中的精油并對殘渣中的多酚進行有機溶劑提取，分別采用GC-MS和HPLC分析精油和多酚提取液的組分。所鑒定的香薷精油4種主要成分是香薷酮(46.5%)、1-甲基-3-(1-甲基乙烯基)環(huán)己烯(43.08%)、葎草烯(2.79%)和芳樟醇(1.61%)。這4種物質(zhì)占香薷精油總含量的93.98%，可以認為是香薷精油香氣的主要來源。研究發(fā)現(xiàn)香薷精油和多酚提取液清除DPPH·與O2-·、ABTS+·、FRAP的總還原能力線性關系呈現(xiàn)非常顯著相關(P<0.01)，對超氧陰離子自由基的清除能力與FRAP的總還原能力的線性關系同樣非常顯著(P<0.01)。香薷精油及香薷殘渣中的多酚具有一定的抗氧化能力，可以作為食品防腐劑與抗氧化劑，為香薷的開發(fā)和利用提供了一定的理論依據(jù)。