文華英,賈福晨,靳玉龍,張玉紅
西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)與食品科學(xué)研究所,西藏拉薩 850000
獨(dú)特的生存環(huán)境孕育著獨(dú)特的生物資源,西藏有“世界第三極”之稱,擁有中國(guó)極端環(huán)境條件下寶貴而獨(dú)特的微生物種質(zhì)資源[1]。西藏傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶的制作和食用有數(shù)千年歷史,因氣候環(huán)境和地理因素差異大以及制作工藝的不同[2],孕育出的乳酸菌特性也不同[3],其中不乏具有優(yōu)良益生特性和生產(chǎn)特性的低溫乳酸菌菌株[2],其能在低溫環(huán)境下生長(zhǎng)、繁殖,在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生物修復(fù)、污水處理和醫(yī)藥等領(lǐng)域均具有良好的應(yīng)用[4~6],尤其在食品工業(yè)和水果加工領(lǐng)域,低溫在節(jié)能以及保留住不穩(wěn)定和易揮發(fā)的風(fēng)味化合物,防止污染和消除任何殘留的酶活性等方面的優(yōu)勢(shì)不斷凸顯[5],用低溫工藝取代高溫工藝的趨勢(shì)一直在增長(zhǎng)。
低溫乳酸菌具備保鮮、抑菌和益生功能,可在低溫工藝下發(fā)揮作用,圍繞其開展的低溫發(fā)酵研究涉及發(fā)酵乳制品、青貯飼料、肉制品、泡菜和食品生產(chǎn)等[7,8]。因此,進(jìn)一步加深對(duì)低溫乳酸菌資源的認(rèn)識(shí)和開發(fā),具有重要意義。篩選特性優(yōu)良的低溫乳酸菌,不僅能為低溫發(fā)酵提供菌種資源儲(chǔ)備,還能為篩選優(yōu)異菌株及其商業(yè)化開發(fā)提供依據(jù),為我國(guó)開發(fā)優(yōu)良直投菌劑提供了有利保障[9]。
1.1.1 試驗(yàn)菌株的來源與信息
13 株乳酸菌分離于西藏拉薩市、昌都市、那曲市和日喀則市農(nóng)牧民家采集的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶樣品,
用MEGA7.0軟件繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖1。
圖1 基于16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹
1.1.2 主要培養(yǎng)基及試劑
MRS培養(yǎng)基、MRS肉湯;鳥氨酸脫羧酶生化鑒定管、賴氨酸脫羧酶生化鑒定管、精氨酸脫羧酶生化鑒定管、氨基酸脫羧酶對(duì)照生化鑒定管、Kovacs靛基質(zhì)試劑、蛋白胨水、無菌液體石蠟,環(huán)凱微生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。
1.1.3 主要儀器與設(shè)備
生物顯微鏡(UB203i),北京博雅創(chuàng)新科技發(fā)展有限公司;渦旋振蕩器(Vortex.Genie2),美國(guó)Scientific Industries公司;分析天平(BS223S),賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;紫外可見分光光度計(jì)(UV7502PCS),上海欣茂儀器有限公司;恒溫培養(yǎng)箱(LRH-250)、電熱恒溫水浴鍋(HWS-28),上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;離心機(jī)(TGL-16G),上海安亭科學(xué)儀器廠;pH酸度計(jì)(PH400),安萊立思儀器科技有限公司;等。
1.2.1 菌液的制備
從平板單菌落挑取一環(huán)試驗(yàn)菌株至MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,活化2~3 次。測(cè)定OD600nm值,通過稀釋制備接種濃度為OD600nm值等于0.6的菌液,按3%(v/v)的比例接種。
1.2.2 耐低溫乳酸菌篩選
根據(jù)文獻(xiàn)[10]適當(dāng)修改,菌液接種至含4 mL MRS液體培養(yǎng)基中,放置于10 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 次重復(fù)。分別測(cè)定培養(yǎng)2 d、4 d和6 d時(shí)的OD600nm值和pH值。
1.2.3 不同溫度下生長(zhǎng)情況測(cè)試
根據(jù)文獻(xiàn)[10、11]適當(dāng)修改,菌液接種至含4 mL MRS液體培養(yǎng)基中,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 次重復(fù)。分別放置于15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、37 ℃、40 ℃和45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48~72 h,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值。
1.2.4 耐鹽特性分析
根據(jù)文獻(xiàn)[12、13]進(jìn)行改良,制備NaCl濃度為2%、4%、6%和8%的MRS液體滅菌培養(yǎng)基。將菌液接種至4 mL上述培養(yǎng)基中,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 次重復(fù)。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48~72 h,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值。
1.2.5 耐酸特性分析
根據(jù)文獻(xiàn)[14]進(jìn)行改良,制備pH值為3、3.5、4和5的MRS液體滅菌培養(yǎng)基。將菌液接種至4 mL上述培養(yǎng)基中,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 次重復(fù)。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48~72 h,利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD600nm值。
1.2.6 產(chǎn)酸能力分析
根據(jù)文獻(xiàn)[15]適當(dāng)修改,將菌液接種至4 mL含6%NaCl的MRS液體培養(yǎng)基無菌離心管中,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 次重復(fù)。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48~72 h,使用pH計(jì)測(cè)定菌株培養(yǎng)液的pH值。
1.2.7 降亞硝酸鹽特性分析
(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
根據(jù)《GB5009.33—2016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測(cè)定》中鹽酸萘乙二胺法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(2)菌液中亞硝酸鹽含量測(cè)定
根據(jù)文獻(xiàn)[16]適當(dāng)修改,將菌液接種于2 mL亞硝酸鹽質(zhì)量濃度為125 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中,每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3 次重復(fù)。分別放置于30 ℃、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。于24 h和48 h分別取樣,按照標(biāo)準(zhǔn)回歸方程計(jì)算亞硝酸鹽含量。降解率按以下公式計(jì)算:
式中:X為菌株亞硝酸鹽降解率,%;C0為原培養(yǎng)基中亞硝酸鹽質(zhì)量濃度,μg/mL;C1為測(cè)試樣品亞硝酸鹽質(zhì)量濃度,μg/mL;100為換算系數(shù)。
1.2.8 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)
氨基酸脫羧酶試驗(yàn):根據(jù)文獻(xiàn)[13]進(jìn)行改良,按照氨基酸脫羧酶生化鑒定管(環(huán)凱)說明書操作。
吲哚試驗(yàn):配制5 mL/管的蛋白胨水培養(yǎng)基,高溫滅菌。菌液接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中,未接種的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對(duì)照,37 ℃恒溫培養(yǎng)48~72 h。向培養(yǎng)基中滴加5~8 滴靛基質(zhì)試劑,并輕搖試管觀察顏色變化。若液面出現(xiàn)紅色則為陽性結(jié)果,否則為陰性結(jié)果。
采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA);使用Excel軟件進(jìn)性數(shù)據(jù)分析并繪制柱狀圖和折線圖,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
2.1.1 低溫生長(zhǎng)能力測(cè)試
13 株乳酸菌在10 ℃條件下培養(yǎng)2 天、4 天以及6 天,測(cè)定OD600nm值和pH值,統(tǒng)計(jì)如表1。從表1可以看出,10 ℃條件下CD3和CD5生長(zhǎng)速度最快,OD600nm值高且pH值低的8 株菌分別為CD5、CD3、CD33、RK17、CD14、NQ9、NQ37、CD10,以此8 株菌開展后續(xù)特性分析試驗(yàn)。
表1 13 株乳酸菌10 ℃條件下培養(yǎng)2 天、4 天及6 天的菌液OD600 nm值和pH值
2.1.2 不同溫度下生長(zhǎng)能力分析
共計(jì)9 株菌,設(shè)置7 個(gè)溫度梯度,測(cè)試不同溫度下OD600nm值,繪制生長(zhǎng)曲線見圖2。結(jié)果顯示:CD3和CD5的生長(zhǎng)情況明顯好于其余試驗(yàn)菌株;其中CD5最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃,其余均為30 ℃;RK17、CD33對(duì)溫度最敏感,RK17在20 ℃后生長(zhǎng)迅速,CD33在20~30 ℃條件下生長(zhǎng)較為良好,二者在37 ℃時(shí)生長(zhǎng)明顯下降;RK23在30~40 ℃區(qū)間生長(zhǎng)差異不大。因結(jié)果顯示試驗(yàn)菌株最適生長(zhǎng)溫度多為30 ℃,而文獻(xiàn)多以37 ℃為試驗(yàn)溫度,遂設(shè)置30 ℃和37 ℃兩個(gè)試驗(yàn)溫度開展后續(xù)特性研究試驗(yàn),對(duì)比差異。
2.2.1 耐鹽能力分析
耐鹽能力見表2??梢钥闯觯?%NaCl濃度環(huán)境下,30 ℃時(shí),CD3和CD5生長(zhǎng)良好,CD14和CD33能生長(zhǎng);37 ℃時(shí),NQ37微弱生長(zhǎng),其余7 株能生長(zhǎng)。綜上,30 ℃條件下的CD3和CD5耐鹽性能最好。
表2 不同鹽度條件下8 株乳酸菌的生長(zhǎng)特性測(cè)定
2.2.2 耐酸能力分析
8 株乳酸菌,設(shè)置4個(gè)pH梯度,耐酸能力見表3??梢钥闯?,30 ℃條件下的CD3和CD5耐酸性能最好,其余菌株在pH值3.5及更低pH值條件下均微弱生長(zhǎng)或不生長(zhǎng),體現(xiàn)出較差的耐酸性能。
表3 不同pH值條件下8 株乳酸菌的生長(zhǎng)特性測(cè)定
2.2.3 產(chǎn)酸能力分析
根據(jù)顯著性差異分析,由圖3可以看出,培養(yǎng)溫度不同,產(chǎn)酸能力有所差異,但對(duì)CD3和CD5影響較小。綜上,CD5和CD3的產(chǎn)酸能力最強(qiáng),其次為30 ℃時(shí)的CD14和CD33。
圖3 30 ℃和37 ℃培養(yǎng)條件下乳酸菌的pH值對(duì)比
2.2.4 降亞硝酸鹽特性分析
根據(jù)1.2.7(1)方法,測(cè)定不同濃度亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液在反應(yīng)后的OD538nm值,繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4?;貧w方程為:y=0.7363x,R2=0.9974。
圖4 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
試驗(yàn)菌株的亞硝酸降解率如圖5。根據(jù)顯著性分析,從圖5可以看出,菌株培養(yǎng)24h時(shí),CD5、CD3、CD10和NQ9體現(xiàn)出較強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力。在37 ℃時(shí),CD5和CD3降解率接近90%,CD10和NQ9降解率接近70%,顯著高于30 ℃時(shí)。
圖5 24 h時(shí)30 ℃和37 ℃條件下亞硝酸鹽降解率
根據(jù)顯著性分析,從圖6可以看出,菌株培養(yǎng)48 h時(shí),CD5、CD3、CD10和NQ9體現(xiàn)出較強(qiáng)的亞硝酸鹽降解能力。在37 ℃時(shí),CD3和CD5的降解率達(dá)99%,CD10和NQ9達(dá)85%以上,其次RK17達(dá)75%以上。在30 ℃時(shí),CD3和CD5的降解率達(dá)97%,與37 ℃時(shí)無顯著差異。
綜合圖5和圖6可知,CD3和CD5的亞硝酸鹽降解率最高,其次為CD10和NQ9,且在37 ℃條件下比30 ℃時(shí)降解率更高。
圖6 48 h時(shí)30 ℃和37 ℃條件下亞硝酸鹽降解率
2.2.5 氨基酸脫羧酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)
生物胺與吲哚生成結(jié)果如表4所示,8 株試驗(yàn)菌株的賴氨酸、鳥氨酸脫羧酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)反應(yīng)均為陰性;而精氨酸脫羧酶試驗(yàn)中CD3、CD5、CD14和RK17反應(yīng)呈陰性,表明這4 株菌不會(huì)將精氨酸經(jīng)精氨酸脫羧酶作用生成精胺對(duì)人體造成安全隱患,對(duì)比其余4 株陽性結(jié)果菌相對(duì)安全。
表4 乳酸菌生物胺與吲哚生成結(jié)果
本研究以從西藏拉薩市、昌都市、那曲市和日喀則市采集的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶樣品中分離出的13株乳酸菌為試驗(yàn)菌株。通過10 ℃低溫條件培養(yǎng)篩選出的Lactobacillus paracaseiCD3和CD5,最適生長(zhǎng)溫度分別為30 ℃和25 ℃,其耐鹽、耐酸、降亞硝酸鹽特性較好,產(chǎn)酸能力較好,精氨酸、鳥氨酸、賴氨酸脫羧酶試驗(yàn)呈陰性,吲哚試驗(yàn)呈陰性,表明其能適應(yīng)低溫生長(zhǎng),可在高鹽低pH值的環(huán)境中生長(zhǎng),發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸性能較強(qiáng),在發(fā)酵過程中可降解亞硝酸鹽并且不分解精氨酸、鳥氨酸和賴氨酸,以避免對(duì)人體產(chǎn)生危害,可作為低溫發(fā)酵菌種資源。下一步研究將進(jìn)一步探索CD3和CD5的益生和發(fā)酵等特性,研究其作為直投發(fā)酵菌劑是否具有優(yōu)勢(shì)。