四溴間甲酚磺酚酞褪色分光光度法測定拉米夫定

劉 艷*， 李 巍， 江 虹

(長江師范學院化學化工學院，重慶 408100)

拉米夫定是一種具有代表性的核苷類抗病毒藥物，在臨床上廣泛用于乙肝病毒感染所致的肝膽疾病及艾滋病毒的治療。由于該藥對肝病治療需在長期服用后才會有一定的療效，而長期服用又易產(chǎn)生耐藥性，且不能輕易停藥，如若停藥則會導(dǎo)致病情反復(fù)發(fā)作，不僅不能治療肝病，還會加重對肝臟的損傷，使病情更為嚴重，同時也會產(chǎn)生某些副作用(如惡心、嘔吐、消化不良、頭暈、頭痛等等)。這些不良影響均與用藥的劑量有關(guān)。因此，合理用藥，控制好用藥質(zhì)量顯得非常重要，而對藥物中拉米夫定含量的快速檢測方法進行研究顯得很有必要。目前，國內(nèi)外對拉米夫定的檢測研究主要是高效液相色譜法[1 - 4]和液-質(zhì)聯(lián)用法[5 - 8]，偶見國內(nèi)有電化學法[9]的報道，國外有分光光度法[10]的報道。

本工作采用四溴間甲酚磺酚酞作為探針，用雙波長褪色光度法來研究檢測拉米夫定的分析方法，尚未見文獻報道。該方法簡便、快速，適于市售藥物中拉米夫定的分析。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

U-3010型紫外-可見分光光度計(日本，日立公司)。

拉米夫定對照品(99.7%～99.9%，批號：101007-201502，中國食品藥品檢定研究院)溶液：準確稱取拉米夫定對照品適量，加少量水溶解后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用水稀至刻度；操作溶液由貯備液稀釋(貯備溶液為229.3 mg/L，操作溶液為22.93 mg/L)，置于4 ℃冰箱中保存。四溴間甲酚磺酚酞(分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司)溶液：1.00 mmol/L。HCl(分析純，重慶華東化工有限公司)：0.10 mol/L。三羥甲基氨基甲烷(Tris)(分析純，齊一生物科技有限公司)緩沖溶液：0.20 mol/L。Tris-HCl溶液：pH=3.5～9.2(用酸度計測定0.10 mol/L HCl與0.20 mol/L Tris的混合溶液的pH值)。水為自制超純水。

拉米夫定片：葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司，簡寫為1#；福建廣生堂藥業(yè)股份有限公司，簡寫為2#；湖南千金湘江藥業(yè)股份有限公司，簡寫為3#。

1.2 樣液的制備

取1#～3#拉米夫定片各5粒，去薄膜后，置于小燒杯中，分別加水溶解，超聲20 min，取出過濾，濾液置于1 000 mL容量瓶中，用水定容至刻度。取該液5.00 mL，用水定容至100 mL，存于4 ℃冰箱中，待測。

1.3 實驗方法

于10 mL比色管中，加入1.00 mL Tris-HCl緩沖溶液(pH=8.22)和適量22.93 mg/L拉米夫定標準溶液，再加入2.50 mL 1.00 mmol/L四溴間甲酚磺酚酞溶液，搖勻，反應(yīng)20 min后，在分光光度計上，以試劑空白作參比，掃描可見光區(qū)的吸收光譜，分別測定溶液的吸光度A555nm、A655nm和A555+655nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)條件

2.1.1 pH及用量取1.00 mL 22.93 mg/L拉米夫定標準溶液，以及2.50 mL 1.00 mmol/L四溴間甲酚磺酚酞溶液于10 mL比色管中，再加入1.00 mL不同pH(pH=3.5～9.2)的Tris-HCl緩沖溶液，在室溫條件下，考察波長555 nm和655 nm處體系溶液的褪色程度(即負吸光度)。圖1A表明，當pH為8.22時，吸光度絕對值(|A555|、|A655|和|A555+655|)均最大，即在該pH下測定，體系的靈敏度最高。隨后考察了pH=8.22的緩沖溶液的不同用量對體系褪色程度的影響。圖1B圖表明，pH=8.22的Tris-HCl緩沖溶液用量為2.50 mL時，吸光度絕對值最大?？梢姡p波長疊加褪色法比單波長褪色法有更高的靈敏度。

圖1 溶液pH及用量對|A|的影響Fig.1 Effect of pH of solution and butter solution volume on absolute value of absorbance(|A|)

2.1.2 四溴間甲酚磺酚酞濃度移取1.00 mL 22.93 mg/L拉米夫定標準溶液及2.50 mL Tris-HCl溶液(pH=8.22)于10 mL比色管中，再加入不同用量的1.00 mmol/L四溴間甲酚磺酚酞溶液，在室溫下，考察體系在555 nm和655 nm處的褪色程度。圖2表明，四溴間甲酚磺酚酞溶液用量為2.50 mL(即體系溶液中四溴間甲酚磺酚酞濃度為0.250 mmol/L)時，|A555|、|A655|和|A555+655|均最大，即該條件下體系反應(yīng)最為完全，并有相對高的靈敏度。另外，由圖可見，雙波長疊加褪色法比單波長褪色法有更高的靈敏度。

圖2 四溴間甲酚磺酚酞濃度對|A|的影響Fig.2 Effect of concentration of tetrabromointercresol sulfophenolphthalein on |A|

2.1.3 試劑加入順序在上述選定的最佳條件下，考察各物質(zhì)加入的先后順序?qū)w系在555 nm和655 nm處褪色程度的影響。結(jié)果表明，無論以何種試劑加入順序進行反應(yīng)，體系褪色程度的變化幅度不大，可以認為吸光度基本處于同一平臺，不影響反應(yīng)的靈敏度。

2.1.4 反應(yīng)時間及穩(wěn)定性在上述選定條件下，考察體系反應(yīng)時間對體系褪色程度的影響。結(jié)果表明，從反應(yīng)開始至20 min前，隨著反應(yīng)的進行，褪色程度逐漸增強(即負吸光度逐漸增大)。當反應(yīng)時間達到20 min時，負吸光度增至最大值，此時體系反應(yīng)已完全，以后至70 min內(nèi)，隨著時間的增加，負吸光度值基本不變，其穩(wěn)定時間約50 min。實驗選在穩(wěn)定時間區(qū)進行測定。

2.2 新物質(zhì)的褪色光譜特征

四溴間甲酚磺酚酞(酸性染料，以陰離子形式存在于溶液中)與拉米夫定(結(jié)構(gòu)上的氨氮有孤對電子，接受質(zhì)子后形成質(zhì)子化的陽離子)以靜電作用相結(jié)合，生成兩個負吸光強度較大的二元離子締合物，光譜特征曲線見圖3。可知，兩個褪色峰分別位于波長555 nm和655 nm，相對于四溴間甲酚磺酚酞(最大吸收波長位于516 nm，曲線2)分別紅移39 nm和139 nm。波移表明，四溴間甲酚磺酚酞與拉米夫定可以發(fā)生褪色反應(yīng)生成新物質(zhì)。在兩個褪色峰處，新物質(zhì)的負吸光強度與拉米夫定濃度有線性系，服從比爾定律，可用于定量檢測拉米夫定。鑒于吸光度的加和性，當采用吸光度疊加的方法來測定拉米夫定時，除服從比爾定律外，靈敏度還可提高約兩倍。

圖3 四溴間甲酚磺酚酞與拉米夫定的吸收光譜Fig.3 Absorption spectra of tetrabromointercresol sulfonophenolphthalein and lamivudine1:2.29 mg/L lamivudine;2:0.0150 mmol/L tetrabromointercresol sulfonophenolphthalein,pH=8.22;3 - 10:0.459,0.917,1.38,1.83,2.29,2.75,3.21,3.67 mg/L lamivudine -0.250 mmol/L tetrabromointercresol sulfonophenolphthalein,pH=8.22.

2.3 方法學考察

2.3.1 標準曲線、靈敏度及相關(guān)參數(shù)按“1.3”方法，加入22.93 mg/L拉米夫定標準溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 mL及其它試劑溶液，配制拉米夫定標準系列溶液，并測定各溶液的吸光度。標準曲線及相關(guān)參數(shù)見表1?？芍?，拉米夫定在0.04～3.7 mg/L范圍內(nèi)與負吸收強度有很好的線性關(guān)系，且雙波長疊加褪色法比單波長褪色法更靈敏。

表1 標準曲線相關(guān)參數(shù)

2.3.3 樣品測定、準確度和精密度按“1.3”的方法，于10 mL比色管中，加入待測溶液0.50 mL(代替“1.3”中的標準溶液)及其他試劑溶液，用水定容至10 mL。以靈敏度最高的雙波長疊加褪色法(555 nm+655 nm)為例，測定樣液的吸光度(各樣品平行測定5份)，求出待測溶液及藥片中拉米夫定的含量。再取各廠家生產(chǎn)的拉米夫定片各5粒(各平行3份)，加適量水溶解，向平行樣中分別加入不同濃度的拉米夫定標準貯備溶液，按“1.2”樣液的制備方法制得加標待測溶液。再按樣品測定方法，取加標待測溶液0.50 mL(各水平平行配制5份)，測定加標回收率及相對標準偏差，判斷新方法的準確度和精密度。結(jié)果見表2。同時，用高靈敏度的共振瑞利散射(RRS)法進行對照試驗，統(tǒng)計結(jié)果為(90%置信度)：1#，F(xiàn)=1.11

表2 拉米夫定樣品的分析結(jié)果及回收試驗(n=5)

3 結(jié)論

四溴間甲酚磺酚酞在弱堿性溶液中可與拉米夫定作用，生成的新物質(zhì)的雙波長疊加褪色強度(即負吸光強度)與一定濃度范圍內(nèi)的拉米夫定濃度服從比爾定律。方法用于實際藥物中拉米夫定的測定，簡便、快速，并且有較高靈敏度、準確度和精密度，適于市售拉米夫定藥片中拉米夫定的測定。