基于核酸適配體和金納米粒子的痕量肌氨酸測定

周 斌， 陳 堯， 胡晞江*

(1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)，湖北武漢 430014；2.武漢鵬祥醫(yī)療器械有限公司，湖北武漢 430014)

肌氨酸(Sarcosine)為半必須氨基酸甘氨酸的代謝產(chǎn)物，健康男性尿液中含量極低。大量研究發(fā)現(xiàn)，尿液中肌氨酸可作為前列腺癌(Prostate Carcinoma,PCa)早期篩查的有效生物標志物，其疾病診斷的準確性優(yōu)于血液中前列腺特異性抗原[1]。目前，尿液中肌氨酸檢測方法主要有：高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[2]、紙質(zhì)噴霧-質(zhì)譜法(PS -MS)[3]、毛細管電泳-質(zhì)譜法(CE-MS)[4]、微分離子遷移率光譜-質(zhì)譜法(DIMS-MS/MS)[5]、指示劑位移分析法(Indicator Displacementassay)[6]和比色測定法[7]等方法。上述方法各有優(yōu)缺點，色譜法檢測肌氨酸很容易受結(jié)構(gòu)相似的丙氨酸干擾[8]；基于肌氨酸氧化酶比色法易受尿液中基質(zhì)效應影響。因此，構(gòu)建高選擇性和經(jīng)濟實惠的肌氨酸檢測新方法非常迫切。

核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù)篩選分離得到的一類特殊單鏈DNA或RNA分子，它對靶分子呈現(xiàn)高度特異性和獨特親和力，不僅在很大程度上避免了非特異性干擾，而且與靶分子間的親和力也遠高于抗原抗體之間的親和力。目前，已篩選出能特異性識別蛋白質(zhì)、氨基酸等多種物質(zhì)的核酸適配體，并將其成功應用于實際樣品中痕量靶分子的檢測中[9 - 12]。2018年報道了以單鏈DNA形式存在的肌氨酸核酸適配體，并在核酸適配體和互補鏈上分別標記熒光基團和猝滅基團，通過肌氨酸誘導雙鏈DNA的構(gòu)象變化，成功實現(xiàn)人體尿液中肌氨酸檢測，避免了丙氨酸等干擾[13]。本文擬應用非標記的核酸適配體，建立人體尿液中痕量肌氨酸測定的共振散射光譜法，在實現(xiàn)特異性檢測的同時，省去DNA的標記步驟，減少試劑成本。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光分光光度計(日本，日立公司)。

標準品：肌氨酸、甘氨酸(氨基乙酸)、L-丙氨酸和β-丙氨酸(北京北方偉業(yè)計量研究所)；水溶性金納米顆粒(Au NPs)溶液(中科雷鳴北京科技有限公司，0.05 mg/mL)；NaCl(武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限公司)；D -402弱酸性陽離子交換樹脂(常州華特有限公司)。本研究中所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

DNA由上海生工生物工程股份有限公司合成，核酸適配體序列：5′-CGGGACGACCACGCAAATACGAATAGTGTGAACGCGGGAGTCCCG-3′[13]；互補鏈序列5′-ACTATTCGTATTT-3′。

1.2 實驗方法

在EP管中依次加入10 μL核酸適配體，不同體積肌氨酸標準溶液和8 μL互補鏈，混勻，室溫靜置20 min。然后加入60 μL 0.05 mg/mL Au NPs溶液，二次蒸餾水定容至350 μL，混勻，靜置反應20 min。最后加入100 μL NaCl溶液，混勻，室溫放置2 min后，在熒光分光光度計上進行同步掃描(λem=λex)，得共振散射光譜。參數(shù)設(shè)置：電壓400 V，狹縫寬度5 nm。記錄λ372 nm處的共振光散射強度IRLS和試劑空白的I0，ΔIRLS=IRLS-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗設(shè)計

核酸適配體序列參考已篩選的能夠特異性結(jié)合肌氨酸的堿基序列，其與肌氨酸的解離常數(shù)為134.8±1.12 nmol/L[13]，并另外設(shè)計一條與核酸適配體中間段堿基(圖1紅色)完全互補配對的互補鏈?；パa鏈有13個堿基，在合適條件下能夠與核酸適配體形成雙鏈DNA，并在3′和5′末端暴露出部分未配對堿基，未配對堿基通過范德華力吸附到檸檬酸包裹的Au NPs表面，增加了Au NPs的負電荷性，使其在鹽作用下相對不發(fā)生聚集[14]。在加入肌氨酸后，肌氨酸誘導核酸適配體發(fā)生構(gòu)象變化，可能形成類似于莖環(huán)的二級結(jié)構(gòu)，未配對的堿基減少，Au NPs發(fā)生聚集。

圖1 非標記核酸適配體-金納米共振散射光譜法檢測原理示意圖Fig.1 Principle of RLS detection based lable -free aptamer/Au NPs

2.2 共振散射光譜

圖2為體系的共振散射光譜圖，Au NPs在NaCl作用下有明顯的共振散射峰(圖2A曲線1)。已有文獻報道Au NPs的聚集程度與其共振光散射強度密切相關(guān)，聚集程度越高，共振散射光強度越強，說明單獨的Au NPs在高鹽狀態(tài)下已形成聚集體[13,14]。在上述溶液中加入核酸適配體(圖2A曲線4)或互補鏈(圖2A曲線2)或肌氨酸(圖2A曲線3)后，IRLS顯著下降，但峰位和峰形基本不變，提示體系的散射粒子尺寸可能變小，Au NPs分散程度增加；在Au NPs和鹽溶液中，加入經(jīng)過復性的核酸適配體和互補鏈后，體系的散射光同樣下降(圖2A曲線5)，幾乎與曲線2和曲線4重疊。上述結(jié)果充分提示在特定條件下肌氨酸、核酸適配體、互補鏈、核酸適配體和互補鏈復性后的雙鏈DNA均能在一定程度上防止Au NPs聚集。在圖2A曲線5體系的基礎(chǔ)上，再加入待測靶分子肌氨酸，可明顯觀察到共振散射光增強(圖2A曲線6)，這可能是因為肌氨酸結(jié)合核酸適配體，誘導DNA雙鏈構(gòu)象發(fā)生改變，導致其抵抗鹽溶液能力改變[15,16]，增強的ΔIRLS與肌氨酸濃度呈良好的線性關(guān)系(圖2B)。

圖2 Au NPs-核酸適配體-肌氨酸體系的共振光散射光譜Fig.2 Resonance light scattering spectra of Au NPs -aptamer-sarcosine system cAu NPs=9.4 mg/L；c(NaCl)=3.6 μmol/L.

2.3 測定條件的選擇

2.3.1 NaCl濃度影響NaCl濃度是影響Au NPs聚集程度的重要因素[17]，NaCl濃度越高，Au NPs越不穩(wěn)定，易發(fā)生聚集，即使有DNA鏈保護的Au NPs也可能因NaCl濃度過大而發(fā)生明顯的聚集。為了實現(xiàn)檢測體系對肌氨酸檢測的最大靈敏度，本研究考察了NaCl濃度對ΔIRLS的影響，由圖3A可知：在NaCl濃度為2.5～3.6 μmol/L范圍內(nèi)時，隨著濃度增加ΔIRLS增加，在3.6～4.0 μmol/L范圍內(nèi)時，ΔIRLS隨著濃度增加而降低，故本實驗選擇加入3.6 μmol/L NaCl溶液。本研究中使用的NaCl濃度遠低于其它基于Au NPs的比色方法，這主要是因為末端未配對的雙鏈DNA比單鏈DNA對Au NPs保護作用弱。目前也有文獻報道DNA類型及長度不同對Au NPs保護效果有較大差異，當單鏈DNA長度過短時，保護Au NPs作用也有限[18]。

2.3.2 Au NPs用量影響本實驗依靠Au NPs粒子尺寸變化而引起的共振散射光強度進行定量分析，故其濃度對ΔIRLS影響較大(圖3B)。當Au NPs質(zhì)量濃度在8.9～9.4 mg/L之間時，隨著濃度增加ΔIRLS逐漸增加，9.4～9.6 mg/L時ΔIRLS變化不大，趨于穩(wěn)定；當Au NPs質(zhì)量濃度在9.6～10.5 mg/L之間時，隨著其濃度增加ΔIRLS急劇降低。所以選擇Au NPs質(zhì)量濃度為9.4 mg/L。

2.3.3 DNA濃度影響本研究探討了核酸適配體濃度對體系ΔIRLS的影響。由圖3C可知：在核酸適配體濃度為1.1～1.8×10-8mol/L范圍內(nèi)時，隨著濃度增加ΔIRLS增加，在1.8～3.3×10-8mol/L范圍內(nèi)時，ΔIRLS隨著濃度增加而降低，故本實驗選擇加入1.8×10-8mol/L核酸適配體。在此基礎(chǔ)上進一步考察了核酸適配體與其互補鏈濃度比對體系ΔIRLS的影響，結(jié)果表明濃度比為5∶6時ΔIRLS最大(圖3D)。

圖3 實驗條件優(yōu)化Fig.3 Optimization of experimental conditions

2.4 共存物質(zhì)的影響

為了探討方法的特異性，我們考察了三種肌氨酸的類似物(甘氨酸、L-丙氨酸和β-丙氨酸)是否干擾本實驗。固定肌氨酸濃度為4.12×10-7mol/L，當測定誤差小于±10%時，共存物質(zhì)的最高允許量為：10倍甘氨酸(氨基乙酸)，30倍L-丙氨酸和β-丙氨酸。實驗結(jié)果表明尿液中的肌氨酸常見類似物不干擾肌氨酸的測定，可知本方法有一定的抗干擾能力，有望用于實際樣品中的檢測。

2.5 標準曲線，檢出限及精密度

2.5.1 標準曲線的建立以ΔIRLS對肌氨酸濃度繪制工作曲線(圖4)，其回歸方程為：ΔI=143.7c+272.9(c,10-6mol/L)，線性范圍為6.32×10-8～4.40×10-6mol/L。

圖4 共振散射法檢測肌氨酸的標準曲線 Fig.4 The calibration curve of sarcosine

2.5.2 檢出限和精密度根據(jù)實驗方法進行11次空白平行測定，以公式3sb/k(sb為空白溶液標準偏差，k為工作曲線斜率)計算，方法檢出限為1.90×10-8mol/L。對肌氨酸低、中、高三種標準溶液(9.01×10-8mol/L、3.12×10-7mol/L和1.80×10-6mol/L)進行7次平行測定，其相對標準偏差分別為4.4%、7.7%和9.3%。實驗結(jié)果表明方法精密度良好。

2.6 樣品分析和回收率的測定

采集健康成人尿液樣本，低溫離心后留取上清液。樣品采用D -402弱酸性陽離子交換樹脂，混勻，離心，去除尿液中的離子[19]。每份樣品做6次平行測試，實驗結(jié)果如表1所示。

表1 樣品測定結(jié)果及回收試驗(n=6)

3 結(jié)論

本研究基于肌氨酸核酸適配體和Au NPs，建立了一種操作簡便、選擇性高的測定肌氨酸的新方法。該方法通過肌氨酸介導DNA鏈構(gòu)象變化，導致體系A(chǔ)u NPs抵抗鹽溶液能力不同而對肌氨酸進行定量，其線性測定范圍為6.32×10-8～4.40×10-6mol/L，檢出限為1.90×10-8mol/L。與現(xiàn)有方法相比，本方法所用儀器設(shè)備簡單，檢出限滿足需求，選擇性強，試劑成本低。