基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討圣草酚對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟的影響及分子機(jī)制?

劉曉穎，阿力木·艾麥爾，樊 栩，王為蘭，王新繪，李金耀?

(1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830017；2.新疆大學(xué) 資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830017)

0 引言

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell,DC）是最有效的抗原呈遞細(xì)胞，在上皮及上皮下組織形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，感知從機(jī)體不同部位進(jìn)入的病原體，調(diào)節(jié)先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答[1]，并涉及不同的細(xì)胞因子和不同的轉(zhuǎn)錄因子.DC以不成熟狀態(tài)分布在外周組織，識(shí)別病原微生物等危險(xiǎn)信號(hào)后，通過模式識(shí)別受體（PRRs）激活成為成熟狀態(tài)DC.不成熟DC抗原吞噬能力強(qiáng)、抗原遞呈能力弱，而成熟DC抗原吞噬能力弱、抗原遞呈能力強(qiáng)，并且能夠遷移到引流淋巴結(jié)，將抗原遞呈給初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)，清除病原微生物.同時(shí)，炎性DC被招募到炎癥部位，產(chǎn)生大量的腫瘤壞死因子α（TNF-α）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），在炎癥的啟動(dòng)過程及病原體清除中起關(guān)鍵作用[2].

中藥具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠通過抑制DC的成熟來抑制對(duì)炎癥或自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答[3].目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的對(duì)DC具有抑制作用的天然產(chǎn)物有多種，如山奈酚[4]、青藤堿[5]、黃芩苷和梔子苷[6]及西瑞香素[7]等.因此，探討中藥活性成分抑制DC成熟的作用機(jī)制已成為研究熱點(diǎn).隨著生物醫(yī)學(xué)大數(shù)據(jù)研究的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已成為一種系統(tǒng)的藥物靶點(diǎn)分析和作用機(jī)制探討的方法，推動(dòng)了從“一靶一藥”模式向“網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)、多成分治療”模式的轉(zhuǎn)變，從網(wǎng)絡(luò)的角度描述機(jī)體生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復(fù)雜相互作用[8].

圣草酚（eriodictyol,ER）是一種二氫黃酮類化合物，廣泛存在于蔬菜、水果和中藥中，在柑橘類水果中含量最豐富[9]，具有抗氧化、抗炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)、心臟保護(hù)、抗糖尿病、抗肥胖、肝保護(hù)等作用[10].針對(duì)圣草酚抗炎機(jī)制的研究已有多篇報(bào)道，圣草酚在白介素-1β（IL-1β）刺激的軟骨細(xì)胞中通過激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路抑制NF-κB途徑，降低了iNOS、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮（NO）的產(chǎn)生，抑制了TNF-α、IL-6和IL-8以及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-3和MMP-13的表達(dá)，圣草酚抑制了IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11].此外，圣草酚可顯著抑制葡聚糖硫酸鈉鹽（DSS）誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎模型中炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)水平，增加轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素氧合酶-1（HO-1）和醌氧化還原酶1（NQO1）表達(dá)，顯示出良好的治療效果[12].圣草酚還對(duì)細(xì)菌脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）具有保護(hù)作用，主要是通過抑制ALI小鼠肺組織中COX-2/NLRP3/NF-κB信號(hào)通路，和小鼠支氣管肺泡灌洗液中的炎癥介質(zhì)IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α的表達(dá)，減輕肺的干濕比，改善肺的病理變化[13].

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，系統(tǒng)預(yù)測圣草酚抗炎及抑制DC成熟的關(guān)鍵靶點(diǎn)、作用通路以及相互關(guān)系，結(jié)合分子對(duì)接驗(yàn)證，推測圣草酚具有抗炎及免疫抑制的功能，但與DC成熟及功能相關(guān)的細(xì)胞表面共刺激分子及細(xì)胞因子的表達(dá)是否具有抑制作用還不明確.在細(xì)胞水平測定小鼠骨髓來源的DC成熟及細(xì)胞因子表達(dá)，探討圣草酚抗炎及抑制DC成熟的作用機(jī)理，為圣草酚作為免疫抑制劑用于治療炎癥及自身免疫性疾病提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

圣草酚購于上海源葉生物科技有限公司（HPLC≥98%）；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（PBS）購于Gibco公司；胎牛血清購于江蘇恩莫阿賽生物技術(shù)有限公司；粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）購于PeproTech公司；流式抗體PE-CD40、APC-86購于BD Biosciences公司；Western blot抗體及ELISA試劑盒購于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；Nc-細(xì)胞核/質(zhì)蛋白抽提試劑盒購于康為世紀(jì)生物科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購于Thermo公司；細(xì)菌脂多糖（LPS）和二甲基亞砜（DMSO）購于Sigma公司；6～8周齡的BALB/c小鼠購于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.2 圣草酚靶點(diǎn)預(yù)測

通過Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch）數(shù)據(jù)庫對(duì)圣草酚進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，使用Uniprot（https://www.uniprot.org）數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化命名并去重.

1.3 三種模型關(guān)鍵靶點(diǎn)預(yù)測

在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org）和DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://www.drugbank.com）中分別以“dendritic cell”“immunosuppression”和“inflammatory response”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，整合三種模型靶點(diǎn)的基因名.使用Uniprot數(shù)據(jù)庫對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行規(guī)范化命名并去重.將藥物預(yù)測靶點(diǎn)與模型靶點(diǎn)繪制韋恩圖并取交集部分，整理共同的靶點(diǎn)基因，得到關(guān)鍵靶點(diǎn).

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)

將整理的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/,version 11.0），選擇物種為“Homo sapiens”，獲取蛋白質(zhì)相互作用信息，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，將得到的“TSV”文件導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進(jìn)行分析，結(jié)果按照degree值排列.

1.5 構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò)圖

通過數(shù)據(jù)整理得到圣草酚與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系表，利用Cytoscape 3.6.1導(dǎo)入對(duì)應(yīng)關(guān)系表，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”互作網(wǎng)絡(luò).通過軟件設(shè)置調(diào)整，將活性成分設(shè)為綠色棱形，關(guān)鍵靶點(diǎn)設(shè)為藍(lán)色橢圓形，模型為橙色長方形.

1.6 靶點(diǎn)的KEGG和GO的富集分析

通過Metascape（http://metascape.org）對(duì)共同靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG及GO富集分析，探討作用靶點(diǎn)涉及的信號(hào)通路及參與的生物學(xué)功能，并通過R語言進(jìn)行可視化.

1.7 核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證

選擇三種模型共有核心靶點(diǎn)，在PubChem數(shù)據(jù)庫中下載圣草酚3D結(jié)構(gòu)式，在PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/）中下載核心靶點(diǎn)的蛋白結(jié)構(gòu)，利用Autodock Vina軟件對(duì)圣草酚與靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接模擬.

1.8 小鼠骨髓來源DC誘導(dǎo)培養(yǎng)

取BALB/c小鼠股骨和脛骨，70%乙醇浸泡3 min，PBS洗滌3次，用RPMI-1640培養(yǎng)基反復(fù)吹打骨髓，制成單細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心7 min，棄上清.用6 mL RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青霉素–鏈霉素和20 ng/mL GM-CSF）接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)平皿中，于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).培養(yǎng)第2天和第5天更換一半培養(yǎng)基，第3天更換全部培養(yǎng)基，第7天收集細(xì)胞.

1.9 流式細(xì)胞術(shù)檢測DC表面分子表達(dá)

不同濃度的圣草酚單獨(dú)或與LPS聯(lián)用處理DC 12 h后，收集細(xì)胞，1 200 r/min離心7 min，收集上清4°C保存?zhèn)溆?PBS洗滌1次，加入PE-CD40、APC-CD86抗體，常溫避光染色15 min；PBS洗滌1次，用250 μL PBS重懸細(xì)胞，銅網(wǎng)過濾至流式管中，采用流式細(xì)胞儀（BD Biosciences）檢測，F(xiàn)lowJo 7.6軟件分析數(shù)據(jù).

1.10 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測DC細(xì)胞因子的表達(dá)

不同濃度的圣草酚單獨(dú)或與LPS聯(lián)用處理DC 12 h后，收集上清，采用對(duì)應(yīng)的ELISA試劑盒檢測TNF-α及IL-6的含量，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀檢測OD450值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度.

1.11 Western blot驗(yàn)證靶點(diǎn)

圣草酚與LPS聯(lián)用處理DC 12 h后，不加刺激物為陰性對(duì)照組，以LPS為陽性對(duì)照，按照蛋白抽提試劑盒說明書提取胞質(zhì)蛋白.蛋白按照定量試劑盒說明書定量后，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳.凝膠轉(zhuǎn)至NC膜，5%脫脂奶粉37°C封閉2 h，TBST緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween 20）洗滌3次，加入一抗4°C孵育過夜.TBST洗膜后與HRP標(biāo)記的二抗（1∶1 000）37°C孵育2 h，加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在Image Quant LAS4000mini上曝光并拍照.β-actin作為內(nèi)參蛋白.

1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，處理組與對(duì)照組用one-way ANOVA進(jìn)行分析，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與分析

2.1 圣草酚靶點(diǎn)及三種模型靶點(diǎn)預(yù)測及相互作用分析

通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫預(yù)測到圣草酚96個(gè)靶點(diǎn).通過GeneCards檢索到DC相關(guān)靶點(diǎn)7 512個(gè)，涉及圣草酚72個(gè)（圖1A）.通過GeneCards檢索到免疫抑制相關(guān)靶點(diǎn)433個(gè)，涉及圣草酚14個(gè)（圖1B）.通過GeneCards（score＞5）和DrugBank共檢索到炎癥反應(yīng)相關(guān)靶點(diǎn)1 711個(gè)，涉及圣草酚48個(gè)（圖1C）.對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)進(jìn)行分析，得到degree值前20位的靶點(diǎn)即核心靶點(diǎn)（圖2）.三種模型（DC、免疫抑制及炎癥反應(yīng)）中共有靶點(diǎn)包括AKT1、SRC、PTGS2、HIF1A、MMP9、MMP2及KDR等.

圖1 圣草酚靶點(diǎn)與三種模型靶點(diǎn)的Vene圖

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中degree值較高的靶點(diǎn)

2.2 構(gòu)建并分析“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將圣草酚和關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)關(guān)系表導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1，構(gòu)建“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖（圖3）.網(wǎng)絡(luò)圖中共包含節(jié)點(diǎn)（node）81個(gè)，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的作用關(guān)系，即邊（edge）210條，展示了天然產(chǎn)物具有多靶點(diǎn)的作用.

圖3 圣草酚與靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 GO生物學(xué)過程富集分析和KEGG富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對(duì)77個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO生物學(xué)過程及KEGG通路富集分析.主要分析GO生物學(xué)過程（GOBP）和KEGG通路富集結(jié)果，前20位富集分析結(jié)果見圖4、圖5.三種模型富集的GOBP主要集中在response to oxidative stress positive regulation of cell migration，positive regulation of cell motility等，說明圣草酚與細(xì)胞的遷移及抗氧化作用相關(guān).KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，主要涉及Pathways in cancer，Ras signaling pathway，PI3K-Akt signaling pathway，EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance，c-type lectin receptor signaling pathway及TNF signaling pathway等，說明圣草酚可能具有免疫調(diào)節(jié)及抗炎的功能.

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO富集分析

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

2.4 分子對(duì)接結(jié)果

基質(zhì)金屬蛋白酶在DC穿過細(xì)胞外基質(zhì)的遷移中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[14]，遷移后的DC表達(dá)更高水平的CD40、CD80和CD86共刺激分子并誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[15].因此選擇MMP9、MMP2與圣草酚做分子對(duì)接（圖6）.其中與MMP9對(duì)接親和力（affinity）為-10.4 kcal/mol，與MMP2對(duì)接親和力為-7.1 kcal/mol，表明MMP9與圣草酚相互作用更強(qiáng).

圖6 圣草酚與MMPs分子對(duì)接結(jié)果

2.5 圣草酚對(duì)DC表面分子表達(dá)的影響

成熟的DC會(huì)增加細(xì)胞表面共刺激分子如CD40、CD80和CD86的表達(dá)[16].不同濃度（210 μM、280 μM和350 μM）圣草酚單獨(dú)處理DC時(shí)，對(duì)細(xì)胞群狀態(tài)及比例無顯著影響，對(duì)細(xì)胞表面分子CD40及CD86的表達(dá)也無顯著抑制作用（圖7A）.與LPS聯(lián)用處理DC時(shí)，所選三個(gè)濃度均對(duì)細(xì)胞群狀態(tài)及比例無影響，280 μM的圣草酚能極顯著抑制細(xì)胞表面分子CD40及CD86的表達(dá)（P ＜0.001）（圖7B），說明圣草酚能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的DC成熟.

圖7 圣草酚對(duì)DC成熟的影響

2.6 圣草酚對(duì)DC細(xì)胞因子表達(dá)的影響

不同濃度（210 μM、280 μM和350 μM）圣草酚單獨(dú)處理DC時(shí)，與未處理組相比，TNF-α的表達(dá)無顯著性差異，但極顯著降低了IL-6的表達(dá)（P ＜0.001）（圖8A）.與LPS聯(lián)用時(shí)，與LPS組相比，圣草酚極顯著抑制了TNF-α和IL-6的表達(dá)（P ＜0.001）（圖8B）.

圖8 圣草酚對(duì)DC細(xì)胞因子表達(dá)的影響

2.7 圣草酚抑制MMP9表達(dá)

基于上述結(jié)果，確定圣草酚體外抑制DC的最佳濃度為280 μM.因此選用280 μM圣草酚與LPS聯(lián)用處理DC，12 h后收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，Western blot檢測MMP9表達(dá).結(jié)果顯示，圣草酚可以極顯著降低LPS誘導(dǎo)的DC胞內(nèi)MMP9的表達(dá)（P ＜0.01）（圖9），這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及細(xì)胞水平檢測結(jié)果一致，證明圣草酚可以通過抑制MMPs的表達(dá)抑制DC遷移，進(jìn)而影響DC功能.

圖9 圣草酚對(duì)MMP9表達(dá)的影響

3 討論

本研究經(jīng)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，圣草酚作用于DC、免疫抑制、炎癥的共有靶點(diǎn)包括AKT1、SRC、PTGS2、HIF1A、MMP9、MMP2及KDR等；主要涉及癌癥的信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抗性、c型凝集素受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路等信號(hào)通路，表現(xiàn)了圣草酚免疫調(diào)節(jié)及抗炎的功能.

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被認(rèn)為是炎癥相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的重要途徑.作為一種膜蛋白，PI3K接收來自酪氨酸激酶受體、細(xì)胞因子受體、CD19、B細(xì)胞受體和G蛋白偶聯(lián)受體的傳入信號(hào)，直接或間接激活A(yù)kt及其下游因子.Akt具有調(diào)控蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、葡萄糖代謝和神經(jīng)變性等功能[17?19].肉桂醛（CA）是從肉桂樹皮中分離得到的一種活性物質(zhì)，具有抗真菌、抗細(xì)菌、抗炎、抗突變和抗氧化等作用.研究發(fā)現(xiàn)，CA抑制RA-FLS中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，明顯改善Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，同時(shí)減少促炎因子表達(dá)，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[20].植物衍生物激動(dòng)子皂苷（KD）與血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR2）激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，抑制DC和DC調(diào)節(jié)的CD8+T細(xì)胞代謝相關(guān)的PI3K-Akt通路，降低線粒體膜電位和糖脂利用率，阻斷DC誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞免疫應(yīng)答，從而抑制自身免疫性肝損傷[21].研究表明，圣草酚通過抑制Akt通路的激活，增加關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞FOXO1的表達(dá)，具有潛在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[22].本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的圣草酚作用信號(hào)通路Ras signaling pathway和EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance參與細(xì)胞的遷移、生長及存活等過程.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)圣草酚作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一血管內(nèi)皮生長因子受體-2（KDR）能激活另一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)SRC，通過PI3K-Akt途徑促進(jìn)MMP合成[23]，從而影響細(xì)胞遷移.MMP調(diào)節(jié)發(fā)育、損傷及修復(fù)中的生理及病理活動(dòng)，如形態(tài)發(fā)生、血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)重塑、細(xì)胞遷移等[24].與此相一致，我們的實(shí)驗(yàn)證明，圣草酚能夠抑制LPS誘導(dǎo)的DC胞內(nèi)MMP9的表達(dá)，推測圣草酚能夠通過阻斷DC遷移抑制炎癥反應(yīng).

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的圣草酚作用靶點(diǎn)PTGS2又稱前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2），具有促進(jìn)血管生成及通過NF-κB途徑參與炎癥反應(yīng)的作用，核心靶點(diǎn)HIF1A參與Th17細(xì)胞的分化過程，進(jìn)而影響炎癥反應(yīng)及自身免疫性疾病發(fā)生.PI3K/Akt途徑激活下游NF-κB途徑，進(jìn)而調(diào)控DC促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)，NF-κB也調(diào)控CD40和MMP9的表達(dá)，我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，圣草酚能極顯著降低LPS誘導(dǎo)的CD40和CD86的表達(dá)及TNF-α和IL-6的分泌水平，進(jìn)而抑制DC的成熟及功能，因此，圣草酚能通過多個(gè)靶點(diǎn)及多條途徑參與抗炎及免疫調(diào)節(jié)作用.

綜上所述，圣草酚可能通過調(diào)控PI3K-Akt信號(hào)通路等多條信號(hào)通路，作用于MMP等多個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，抑制DC成熟和遷移，具有潛在的治療炎癥相關(guān)疾病的作用.但其對(duì)信號(hào)分析的調(diào)控及分子作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究.