食品中沙門氏菌緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的優(yōu)化

王樂 陳佳 秦麗

摘 要：目的：優(yōu)化食品中沙門氏菌緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的配比，縮短檢驗周期，使食品安全預(yù)警時間點前移。方法：通過吸光度法和平板計數(shù)法同時測定不同優(yōu)化條件下緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中沙門氏菌的生長曲線，對結(jié)果進行處理分析，確定最優(yōu)方案，并采用實時熒光PCR法進行菌種驗證。結(jié)果：吸光度法和平板計數(shù)法曲線變化基本一致，隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母添加量的增加，沙門氏菌的調(diào)整期縮短，對數(shù)期斜率和穩(wěn)定期數(shù)值呈增大的趨勢。當改良緩沖蛋白胨水中酵母浸膏的添加量為9 g/L時，食品中沙門氏菌的前增菌時間縮短到8～10 h。通過實時熒光PCR法的驗證，確定改良緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基特異性良好。結(jié)論：根據(jù)實際情況選擇緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母的添加量，優(yōu)化后的緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基檢測時間短、特異性強，可用于食品中沙門氏菌的快速檢測，為商品化緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：食品;沙門氏菌;緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基;優(yōu)化

Optimization of Buffered Peptone Water Medium for Salmonella in Food

WANG Le1， CHEN Jia2， QIN Li3*

（1.Zhangjiakou Food and Drug Inspection Center， Zhangjiakou 075000， China; 2.College of Chemical Technology， Shijiazhuang University， Shijiazhuang 050035， China; 3.Hebei Intellectual Property Protection Center， Shijiazhuang 050000， China）

Abstract： Objective： By optimizing the ratio of buffered peptone water medium for Salmonella in food， the detection period is shortened and the time point of food safety warning is moved forward. Method： The growth curve of Salmonella in buffered peptone water medium under different optimized conditions was determined by absorbance method and plate counting method simultaneously. The results were processed and analyzed to determine the optimal plan， and the real-time fluorescent PCR method was used to verify the strains. Result： The curve changes of absorbance method and plate counting method were basically the same. With the increase of yeast addition in buffered peptone water medium， the adjustment period of Salmonella was shortened， and the slope of logarithmic phase and the value of stable phase increased. When the addition amount of yeast extract in modified buffered peptone water was 9 g/L， the pre-enrichment time of Salmonella in food was shortened to 8～10 h. The specificity of the modified buffered peptone water medium was confirmed by real-time fluorescence PCR method. Conclusion： The amount of yeast added in the buffered peptone water medium should be selected according to the actual situation. The optimized buffered peptone water medium has a short detection time and strong specificity， and can be used for the rapid detection of Salmonella in food. This study can provide a reference for the production of commercial buffered peptone water medium.

Keywords： food; Salmonella; buffered peptone water medium; optimization

沙門氏菌（Salmonella）是一種最常見的、能引起人畜共患病的食源性致病菌，在人和動物體中有廣泛的寄主[1]。我國由沙門氏菌引起的食源性疾病居細菌性食源性疾病的首位[2]。在消費者食用被沙門氏菌污染的食物后，會出現(xiàn)腹瀉、腸胃炎、發(fā)熱和敗血癥等一系列癥狀[3]。

近年來，隨著生活水平的提高，人們對食品安全問題的重視日益增加。食品中富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，是食源性致病菌生長、繁殖的良好基質(zhì)，而且食品在加工、包裝、配送及儲存等過程中也極易受到食源性致病菌污染[4]。因此，加強對食品中食源性致病菌的檢測就顯得十分重要。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，沙門氏菌在食源性致病菌中排名第一，世界各國對于食品中沙門氏菌的檢測要求都十分嚴格，沙門氏菌污染一直是食品行業(yè)檢測的重要指標之一[5]。

目前，沙門氏菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學方法和PCR法[6-8]。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，多重PCR法、實時熒光PCR法、側(cè)向流動檢測法等一系列新方法也逐步開始應(yīng)用于食品中沙門氏菌的檢驗[9-11]。但傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代檢測技術(shù)都必須以目標菌的富集為前提，從而進行后續(xù)的檢測[12]。前增菌過程可以實現(xiàn)目標菌的富集，是縮短增菌時間、降低背景干擾的有效手段[13]。沙門氏菌現(xiàn)行國家標準方法的前增菌是采用緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基使樣品中菌體恢復(fù)并大量增殖的過程，此步驟對后續(xù)檢出率的影響至關(guān)重要，但其所需的檢測時間較長[14]。因此，本研究以緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過酵母添加量的優(yōu)化，以期得到一種快速、特異性強的培養(yǎng)基，從而縮短前增菌時間，為我國食品安全的風險監(jiān)測提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

實驗所用的鼠傷寒沙門氏菌（CMCC50976）購于中國醫(yī)學細菌保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

酵母浸膏（Becton，Dickinson and Company）;磷酸鹽緩沖液、營養(yǎng)瓊脂、緩沖蛋白胨水、平板計數(shù)瓊脂（北京路橋技術(shù)股份有限公司）;細菌基因組DNA提取試劑盒、2×PCR Master Mix（天根生化科技北京有限公司）;引物及探針（生工生物工程上海股份有限公司）。

二級生物安全柜;多功能酶標儀（Synergy HTX）;恒溫培養(yǎng)箱（PHCbi）;電子天平（ME4002E）;Sigma 3K15冷凍離心機（德國Sigma公司）;LightCycler 480II實時熒光定量PCR儀（德國羅氏診斷有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的制備

把-80 ℃保存的鼠傷寒沙門氏菌CMCC50976加入到無菌磷酸鹽緩沖液中，挑取菌懸液在營養(yǎng)瓊脂平板上劃線，36 ℃培養(yǎng)24 h，重復(fù)一次。挑取活化好的單菌落接種于磷酸鹽緩沖液中，振蕩均勻，將菌懸液的麥氏濁度控制在0.5～0.6。對上述菌懸液進行10倍梯度稀釋，吸取100 μL菌懸液接種于平板計數(shù)瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。菌懸液的濃度為7.7×106 CFU/mL。

1.3.2 酵母浸膏添加量的篩選

以緩沖蛋白胨水為基礎(chǔ)，分別添加終濃度為

0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和11 g/L的酵母浸膏，每瓶分裝100 mL，高壓滅菌。對添加不同濃度酵母浸膏（0 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L、9 g/L和11 g/L）的改良緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基接種1 mL 1.3.1中濃度為7.7×10-6 CFU/mL的鼠傷寒沙門氏菌?？瞻着囵B(yǎng)基作為對照，與接種后的培養(yǎng)基同時放入36 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.3 沙門氏菌OD550值的測定

沙門氏菌菌懸液培養(yǎng)2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h、18 h、20 h、22 h和24 h后，分別用酶標儀測量550 nm波長下空白培養(yǎng)基和菌懸液的OD550值。以O(shè)D550值的大小衡量沙門氏菌生物量的多少，篩選出最佳酵母浸膏的添加量。

1.3.4 沙門氏菌平板計數(shù)法的驗證

同時吸取1 mL菌懸液，10倍梯度稀釋后接種在平板計數(shù)瓊脂上，36 ℃培養(yǎng)48 h后計數(shù)。

1.3.5 實時熒光PCR法的特異性驗證

采用試劑盒法對培養(yǎng)10 h后酵母浸膏濃度為9 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液進行DNA模板的提取，采用實時熒光PCR法驗證其特異性。試驗重復(fù)3次，設(shè)置陽性對照（沙門氏菌菌懸液基因組DNA），陰性對照（其他菌菌懸液基因組DNA）和空白對照（添加無菌水）。

實時熒光PCR法引物序列為P1：5'-CTCACCAGGAGATTACAACATGG-3';P2：5'AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC-3'。實時熒光PCR法探針序列為“FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMARA”。最終反應(yīng)體系為2×PCR Master Mix 12.5 μL;上下游引物各0.5 μL;探針0.5 μL;DNA模板5 μL;雙蒸水補足25 μL。反應(yīng)程序為：預(yù)變性95 ℃，10 min;95 ℃，15 s;65 ℃，30 s;40個循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長曲線測定結(jié)果

由圖1可知，沙門氏菌菌懸液OD550值隨生長時間增加呈現(xiàn)上升的趨勢，18 h后進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)24 h前沒有出現(xiàn)衰亡期。添加酵母浸膏的改良緩沖蛋白胨水菌懸液，培養(yǎng)2 h后均結(jié)束調(diào)整期，進入對數(shù)增長期;緩沖蛋白胨水菌懸液，培養(yǎng)4 h后，才結(jié)束調(diào)整期，進入對數(shù)增長期。從整體趨勢分析，改良緩沖蛋白胨水的增菌速度明顯高于緩沖蛋白胨水，沙門氏菌在添加酵母浸膏的培養(yǎng)基中能夠更快地恢復(fù)活性。隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母添加量的增加，對數(shù)期斜率和穩(wěn)定期數(shù)值基本呈增大的趨勢。

2.2 平板計數(shù)測定的驗證結(jié)果

由表1可知，不同酵母浸膏添加量的緩沖蛋白胨水菌懸液平板計數(shù)測定結(jié)果與OD550值的變化趨勢基本相同，沙門氏菌的數(shù)量隨時間增加呈現(xiàn)上升的趨勢，與2.1中OD550值的變化趨勢一致。

2.3 沙門氏菌第8 h和第18 h OD550值的比較

由圖2可知，在第8 h，緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值最低，酵母浸膏添加量為3 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值是其3倍。說明酵母浸膏的添加可以促進沙門氏菌的生長。隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏添加量的增加，菌懸液的OD550值呈緩慢增長趨勢，不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值沒有顯著差異。在第18 h，緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值最低，隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏添加量的增加，菌懸液的OD550值逐步增加，差異顯著。酵母浸膏添加量為11 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值達到0.38。《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》（GB 4789.4—2016）規(guī)定的預(yù)增菌時間為8～18 h。因此，增加緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏的添加量可以使菌懸液提前達到所需的OD550值，從而縮短前增菌時間。

2.4 緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏添加量的篩選結(jié)果

由于在第8 h不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值沒有顯著差異，而在第18 h不同酵母浸膏添加量的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值差異顯著。因此，根據(jù)第18 h菌懸液的OD550值篩選緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母浸膏的添加量。由表2可知，第18 h緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值為0.11。酵母浸膏添加量為3 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第16 h可超過此OD550值;酵母浸膏添加量為5 g/L和7 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第12 h可超過此OD550值;酵母浸膏添加量為9 g/L和11 g/L的改良緩沖蛋白胨水菌懸液的OD550值在第10 h可超過此OD550值。從經(jīng)濟成本考慮，酵母浸膏的添加量為9 g/L是最佳培養(yǎng)基配比。該改良培養(yǎng)基能充分提供食品中沙門氏菌恢復(fù)、生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，使沙門氏菌的前增菌時間縮短到8～10 h。

2.5 實時熒光PCR法的特異性驗證結(jié)果

如圖3所示，酵母浸膏添加量為9 g/L的改良緩沖蛋白胨水對食品中沙門氏菌特異性良好，可以實現(xiàn)食品中沙門氏菌的快速檢測。

3 結(jié)論與討論

食源性致病菌的檢測是食品安全監(jiān)管的重要環(huán)節(jié)。沙門氏菌污染造成的食品安全事件時有發(fā)生，通常在感染沙門氏菌后12～72 h內(nèi)出現(xiàn)臨床癥狀，主要包括惡心、頭痛、嘔吐、發(fā)燒、腹痛和腹瀉等[15-16]。因此，從食品生產(chǎn)、加工、運輸?shù)雀鱾€環(huán)節(jié)加強對食源性致病菌的檢測顯得至關(guān)重要。

培養(yǎng)基為微生物生長提供了適合的環(huán)境條件和所需的營養(yǎng)物質(zhì)，微生物前增菌是影響微生物檢測的重要因素[17]。目前，國內(nèi)外許多學者已對培養(yǎng)基的優(yōu)化開展了多種研究[18]。本研究以緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過添加酵母浸膏促進沙門氏菌的恢復(fù)和生長。研究表明，隨著緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基中酵母添加量的增加，沙門氏菌的調(diào)整期縮短，對數(shù)期斜率和穩(wěn)定期數(shù)值呈增大的趨勢。調(diào)整期縮短表示沙門氏菌在添加酵母浸膏情況下恢復(fù)能力增強，可以更快地適應(yīng)環(huán)境;對數(shù)期斜率增大表示沙門氏菌的生物量的增速加大，該培養(yǎng)基的配比適合沙門氏菌的生長。吸光度法測定沙門氏菌的生長曲線沒有出現(xiàn)下降的趨勢，因為吸光度法只能測出細菌總數(shù)，而不是活菌數(shù)量。因此，本研究通過平板計數(shù)法與之對比，結(jié)果表明吸光度法和平板計數(shù)法測定的生長曲線基本一致，這說明培養(yǎng)基中營養(yǎng)比較豐富，沙門氏菌沒有達到衰亡期。食品中沙門氏菌在酵母浸膏添加量為9 g/L的改良緩沖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h后，菌懸液的OD550值達到0.13，超過其在緩沖蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后達到的OD550值，改良緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的前增菌時間縮短了8 h。通過實時熒光PCR法的驗證，確定該改良緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基特異性良好，可以滿足目標菌的檢測要求。因此，食品中沙門氏菌的前增菌時間可以縮短到8～10 h。

本研究優(yōu)化了食品中沙門氏菌緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基的配比，通過添加酵母浸膏縮短了前增菌所需的檢驗時間，滿足了快速檢測的需求，為我國食品檢驗工作提供了參考。在加工過程中，食品中的微生物可能會受到高溫或低溫的損傷，處于難培養(yǎng)或活的非可培養(yǎng)狀態(tài)（Viable but Non-Culturable，VBNC）[19]。當食源性致病菌進入這一狀態(tài)后，將無法采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法進行檢驗，但該致病菌仍能存活，這種現(xiàn)象會對食品安全構(gòu)成潛在的威脅。因此，本研究下一步的研究方向?qū)剿髋囵B(yǎng)基對微生物菌體損傷的修復(fù)能力，為食源性致病菌的檢測提供更可靠的依據(jù)。

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