褐飛虱致害性變異機(jī)制研究進(jìn)展

袁龍宇，李燕芳，肖漢祥，齊國君，張振飛

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

盡管目前有各種各樣的植物保護(hù)方法，但是昆蟲和病原體仍然造成了世界作物至少15%的損失(Oerkeetal., 2006)。為了控制害蟲侵害，確保糧食供應(yīng)，抗蟲作物品種的推廣作為一種經(jīng)濟(jì)且環(huán)保的措施得到了廣泛關(guān)注。然而在實(shí)際的應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，植食性害蟲能夠克服寄主的抗性，使害蟲種群致害寄主的能力逐漸增強(qiáng)，造成抗蟲品種使用年限縮短。褐飛虱Nilaparvatalugens是水稻重大害蟲之一(婁永根和程家安, 1997)。培育并推廣抗褐飛虱水稻品種是控制該重大害蟲的重要綠色防控手段，但田間褐飛虱種群只需要經(jīng)過7～10代的選擇即可適應(yīng)抗蟲水稻品種(Itokawa and Kisimoto, 1981; Pathak and Heinrichs, 1982)。例如，自國際水稻研究所推廣應(yīng)用第1個(gè)抗褐飛虱水稻品種IR26(含抗蟲基因Bph1)以來,不斷出現(xiàn)新品種抗性下降乃至抗性完全喪失的現(xiàn)象。由于上述的原因，導(dǎo)致了以下兩種后果：一方面不斷產(chǎn)生新的致害型害蟲種群，另一方面導(dǎo)致抗蟲品種的使用壽命縮短，已成為該蟲高效治理的主要障礙(Kobayashi, 2016)。在早期的相關(guān)研究中，國內(nèi)外昆蟲學(xué)家使用生物型(biotype)來區(qū)分褐飛虱對(duì)水稻致害性不同的個(gè)體或種群，不同的“生物型”往往擁有相似的形態(tài)特征但卻具有對(duì)水稻不同的致害表型(Claridge and Den Hollander, 1983)。隨著研究的深入發(fā)展，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)褐飛虱致害性的增強(qiáng)實(shí)際上應(yīng)該是一種適應(yīng)性進(jìn)化的現(xiàn)象，具體來說是褐飛虱在這種適應(yīng)性進(jìn)化過程中，與致害性相關(guān)的某些等位基因頻率發(fā)生變化，因此可以將這些等位基因作為褐飛虱致害性相關(guān)的分子標(biāo)記(Kobayashi, 2014)。目前，不僅有使用分子標(biāo)記的方式來解釋褐飛虱致害性表型內(nèi)在機(jī)制的探索，同時(shí)還有許多褐飛虱致害不同抗蟲水稻品種的致害性變異的分子機(jī)制研究。本文在此基礎(chǔ)上綜述了褐飛虱致害性變異的遺傳基礎(chǔ)、分子標(biāo)記、變異的主動(dòng)機(jī)制和被動(dòng)機(jī)制，不僅有助于揭示褐飛虱與水稻的互作機(jī)制，而且有助于我們更好理解褐飛虱對(duì)寄主水稻的適應(yīng)性機(jī)制，對(duì)延長抗蟲水稻品種的使用壽命、做好褐飛虱的致害性監(jiān)測(cè)以及制定褐飛虱可持續(xù)防治策略制定均有重要意義。

1 致害性變異的遺傳基礎(chǔ)

昆蟲的致害性是指昆蟲對(duì)寄主植物的致害能力，致害性個(gè)體可以在寄主植物上存活并為害，而非致害性個(gè)體則不能存活為害(黃富, 1989)。致害性作為反映昆蟲適應(yīng)寄主植物選擇壓力程度的一種性狀，其形成過程有時(shí)也會(huì)伴隨著適合度代價(jià)，如蜜露量(Panguiaetal., 1980)和存活率的降低(俞曉平等, 1993)。

不同生物型個(gè)體一般具有相似的形態(tài)特征但對(duì)相同寄主植物產(chǎn)生不同的致害特性(Claridge and Den Hollander, 1983)。有不少研究顯示，許多致害性變異的現(xiàn)象在多種植食性昆蟲中均有發(fā)現(xiàn)(紀(jì)銳, 2013)，其中包括褐飛虱Nilaparvatalugens、稻癭蚊OrseoliaoryzaeWood-Mason、小麥黑森癭蚊Mayetioladestructor、煙粉虱Bemisiatabaci、麥二叉蚜Schizaphisgraminum等種類。在上述的種類中，相關(guān)研究鑒定出不少的致害性變異種群，其中麥二叉蚜12個(gè)，稻癭蚊14個(gè)，小麥黑森癭蚊13個(gè)，煙粉虱24個(gè)，而在褐飛虱中鑒定出11個(gè)致害性變異種群(Thongphaketal., 1999; Katiyaretal., 2000; Shufranetal., 2000; Sardesaietal., 2001; 程遐年等, 2003; 張揚(yáng), 2005; 羅晨, 2005)。

關(guān)于褐飛虱生物型的提出，最早始于1971年，國際水稻研究所于菲律賓呂宋島多個(gè)地點(diǎn)采集的褐飛虱在TN1和Mudgo水稻上飼養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)不同種群在Mudgo上的存活率存在顯著差異(Athwaletal., 1971)。隨后，通過把田間采集的褐飛虱在多種不同抗蟲品種水稻上飼養(yǎng)，相繼發(fā)現(xiàn)了能適應(yīng)TN1、Mudgo、ASD7和Rathu heenati等抗蟲品種的褐飛虱生物型I、生物型II、生物型III和生物型IV(Claridge and Den Hollander, 1980; 張焓嬌, 2018)。為了解釋褐飛虱不同致害性種群的形成原因，國內(nèi)早期研究中發(fā)現(xiàn)褐飛虱生物型I在抗性品種的連續(xù)選擇下，其致害性逐步增強(qiáng)并形成能致害抗性品種的褐飛虱生物型II，而生物型II在感蟲品種水稻飼養(yǎng)后，致害力會(huì)慢慢減弱，退化為生物型I，說明褐飛虱致害性在世代間是可變異的(肖英方等, 1994; 王桂榮等, 1999)。

早期的研究認(rèn)為褐飛虱不同生物型與水稻抗蟲品種之間存在“基因?qū)颉钡年P(guān)系，不同致害性的褐飛虱種群可以表示為不同生物型，主要是因?yàn)楹诛w虱致害性由單基因控制(Barrion and Saxena, 1985; 劉芳等, 2003)。也有人認(rèn)為單基因或微效多基因是昆蟲克服水稻抗性的遺傳機(jī)制(周金明, 2017)。隨著研究的深入，目前越來越多的研究顯示，褐飛虱對(duì)抗蟲品種的適應(yīng)實(shí)際上是受多基因控制的，在遺傳中可以導(dǎo)致生物型的多基因型現(xiàn)象(Claridge and Den Hollander, 1983; Tanaka, 1999; Downieetal., 2010; Kobayashi, 2016)。

隨著抗蟲水稻中抗蟲基因不斷的被挖掘，目前已經(jīng)有31個(gè)抗褐飛虱基因被發(fā)現(xiàn)，其中有3個(gè)基因被克隆(杜波等, 2018)，并且不同的致害性種群在繁殖、交配選擇等生理方面并無顯著差異，所以“生物型”可能不適合來描述褐飛虱致害性的差異(Claridge and Den Hollander, 1983; 姜人春, 1999)。褐飛虱中不同“生物型”所指的種群只是在其對(duì)不同抗性品種寄主的致害能力上有區(qū)別，不同“生物型”種群對(duì)抗性品種寄主適應(yīng)性的差別實(shí)際上是反映了種群中的致害性相關(guān)基因具有不同的等位基因頻率(Downieetal., 2010; Kobayashi, 2016)。從種群遺傳的角度來說就是，褐飛虱物種中包含了適應(yīng)不同抗性品種水稻相關(guān)的等位基因，具有不同致害力的種群則是由種群中等位基因的頻率改變而形成的(圖1)。

圖1 褐飛虱致害性生物型種群和非致害性生物型種群轉(zhuǎn)換示意圖Fig.1 Transformation of different ‘Biotype’ populations contained both virulent and avirulent genotypes of brown planthoppers注：Vr，致害性基因型；Avr，非致害性基因型。Note: Vr, virulent genotype; Avr, avirulent genotype.

2 致害性變異的分子標(biāo)記

物種的遺傳性狀是由其基因決定的，基因中DNA分子的堿基序列的變化也能影響遺傳性狀的變化。目前分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展極大程度地促進(jìn)了害蟲致害性遺傳機(jī)制的研究。為了比較具有不同致害能力的害蟲個(gè)體或群體間在DNA水平上的差異，一些學(xué)者進(jìn)行了尋找與致害性相關(guān)的分子標(biāo)記的嘗試。如通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)或線粒體DNA(Mitochondrial DNA, mtDNA)來區(qū)分麥二叉蚜的不同生物型(Aikhionbareetal., 1998; Aikhionbare and Mayo, 2000)；用擴(kuò)增的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Polymorphism, AFLP)作為標(biāo)記來分析稻癭蚊或煙粉虱生物型的轉(zhuǎn)化(Behuraetal.,2000；Katiyaretal., 2000)；用序列特征性擴(kuò)增區(qū)域(SCARs)標(biāo)記來檢測(cè)稻癭蚊的生物型(Behuraetal., 2000)。早期的研究在褐飛虱中通過RAPD方法，已發(fā)現(xiàn)不同致害性種群存在明顯的遺傳分化(王桂榮等, 2001; 傅強(qiáng)等, 2004)。近年來的相關(guān)遺傳連鎖作圖研究，主要是基于簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat, SSR)標(biāo)記和單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)標(biāo)記進(jìn)行，從褐飛虱的染色體上也定位到了一些與致害性相關(guān)的DNA分子標(biāo)記(Jingetal., 2011; Jairinetal., 2013; Jingetal., 2014; Kobayashietal., 2014)。用SNP作為分子標(biāo)記去分析同種害蟲致害性的變化，既能為快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供便利，又有助于加深對(duì)害蟲致害性進(jìn)化遺傳機(jī)制的理解(Morinetal., 2004)。Kobayashi等(2014)通過數(shù)量性狀位點(diǎn)分析和BSA(Bulked Segregant Analysis)性狀定位，獲得了褐飛虱致害攜Bph1抗蟲基因水稻品種的5個(gè)SNP分子標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)這些標(biāo)記位于一個(gè)隱性的致害性基因中。Kobayashi(2016)指出，致害性的進(jìn)化實(shí)際上是由多基因共同控制的，在致害性進(jìn)化中仍存在許多未知的遺傳變異。

隨著褐飛虱全基因組測(cè)序的完成(Xueetal., 2014)，從全基因組范圍去進(jìn)一步尋找致害性相關(guān)的SNP分子標(biāo)記是有必要的且在理論上也是可行的。通過對(duì)比高致害力RH-P和低致害力TN1-P兩個(gè)褐飛虱群體在基因組水平、基因表達(dá)水平的聯(lián)合分析后，發(fā)現(xiàn)影響褐飛虱對(duì)Bph3抗性基因水稻致害的基因主要集中在被動(dòng)防御基因上，如P450基因、酯酶基因和表皮蛋白等(龐銳, 2017)。褐飛虱致害性重測(cè)序的基因組信息中，發(fā)現(xiàn)了有42種基因可能與褐飛虱致害性變異相關(guān)，而且通過RNAi的方式驗(yàn)證了其中變異程度高、受選擇區(qū)域多的基因中有19種基因(P450, 神經(jīng)肽受體F, innexin shaking-B蛋白等)影響褐飛虱在RH抗蟲水稻上的致害性(袁龍宇, 2020)。因此致害性變異可通過相關(guān)的SNP分子標(biāo)記進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)，但現(xiàn)有的SNP分子標(biāo)記信息仍比較欠缺。

3 致害性變異的主動(dòng)適應(yīng)機(jī)制

在數(shù)百萬年的進(jìn)化過程中，植物已進(jìn)化出針對(duì)植食性昆蟲的防御策略，這些策略導(dǎo)致基因組和代謝水平上的多種分子相互作用(婁永根&程家安, 1997)。生物體生存的能力取決于其對(duì)外部刺激快速有效的作出反應(yīng)并可持續(xù)防御的能力。這些防御利用有毒化合物或使用機(jī)械防御結(jié)構(gòu)(例如刺和毛)直接保護(hù)植物，或通過吸引食草攻擊者的天敵或寄生蟲的分子相互作用間接保護(hù)植物(Baldwin, 2010; Wu and Baldwin, 2010)。植物快速識(shí)別和響應(yīng)草食動(dòng)物的手段包括對(duì)寄主效應(yīng)子的感知(Maffeietal., 2012)、各種信號(hào)離子的排出/流入(Bricchietal., 2013)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)活化和蛋白磷酸化(Arimuraetal., 2011)、NADPH氧化酶的活化以及活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的產(chǎn)生(Marinoetal., 2012)等。這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致植物激素茉莉酸(JA)和水楊酸(SA)的產(chǎn)量增加(Consalesetal., 2012)、乙烯含量的增加(Scalaetal.,2013)、后期防御反應(yīng)基因的表達(dá)與揮發(fā)性有機(jī)化合物的釋放(Karbanetal., 2010)以及有毒化合物的生產(chǎn)(Karban, 2011)等。

昆蟲在長期的適應(yīng)性進(jìn)化過程中可以通過其唾液中的某些成分來影響植物的防御，使其適應(yīng)植物的抗性(Hogenhout and Bos, 2011)，如圖2。例如，在“植物-蚜蟲”相互作用關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，蚜蟲唾液中誘導(dǎo)子可刺激植物SA途徑介導(dǎo)的防御反應(yīng)關(guān)鍵酶基因表達(dá)(Moran and Thompson, 2001)，這種刺激SA途徑基因表達(dá)的現(xiàn)象，有可能導(dǎo)致對(duì)抗蚜蟲更有效的JA途徑基因表達(dá)的抑制(Zarateetal., 2007)。另外，谷實(shí)夜蛾Helicoverpazea的唾液葡萄糖氧化酶(GOX)可以抑制煙草中抗性物質(zhì)煙堿的產(chǎn)生(Musseretal., 2002)，同樣的機(jī)制在蚜蟲中也存在(Ejaouannetetal., 2014)。在刺吸式口器昆蟲巢菜修尾蚜Megouraviciae、黑尾葉蟬NephotettixbipunctatusFabricius及褐飛虱唾液腺中還發(fā)現(xiàn)了一類能夠結(jié)合Ca2+的蛋白，可以通過抑制胼胝質(zhì)的形成來應(yīng)對(duì)植物堵塞反應(yīng)的策略(Willetal., 2007; Konishietal., 2009)。此外有研究顯示，褐飛虱唾液中的某種成分能夠激活水稻本身的β-1, 3-葡聚糖酶分解胼胝質(zhì)，使褐飛虱能夠順利取食(Haoetal., 2008)。Huang等人鑒定出一種褐飛虱唾液鞘蛋白基因Nlshp，該基因的表達(dá)被dsRNA抑制后，褐飛虱唾液腺鞘在抗性水稻上不能正常形成，影響唾液的分泌，說明該蛋白在褐飛虱取食過程中起著關(guān)鍵作用(Huangetal., 2015)。Ye等人(2017)發(fā)現(xiàn)在褐飛虱唾液中存在一種鈣離子結(jié)合蛋白NlSEF1，該蛋白能誘導(dǎo)水稻體內(nèi)Ca2+和H2O2的升高，引起一系列水稻防御反應(yīng)，導(dǎo)致褐飛虱的攝食和存活率下降。Shangguan等(2018)發(fā)現(xiàn)了褐飛虱分泌的另一類粘蛋白樣蛋白(NlMLP)。NlMLP在褐飛虱唾液腺中高表達(dá)，在稻飛虱取食水稻過程中分泌到水稻組織內(nèi)。NlMLP能誘導(dǎo)水稻細(xì)胞死亡，能上調(diào)水稻防御相關(guān)基因表達(dá)和胼胝質(zhì)沉積。近期作者也發(fā)現(xiàn)一種唾液蛋白NlSP7能調(diào)控褐飛虱在不同抗蟲水稻的取食行為影響褐飛虱的致害性，同時(shí)NlSP7還能夠調(diào)控水稻麥黃酮代謝影響水稻防御反應(yīng)(另文發(fā)表)。

圖2 褐飛虱唾液對(duì)植物防御反應(yīng)的影響Fig.2 Influence of brown planthopper saliva on plant defense response

4 致害性變異的被動(dòng)適應(yīng)機(jī)制

當(dāng)昆蟲在取食植物過程中不可避免地?cái)z取了寄主植物被誘導(dǎo)產(chǎn)生的毒性物質(zhì)時(shí)，可以通過多種機(jī)制去適應(yīng)這些毒性物質(zhì)并形成抗性(Desprésetal., 2007)。這些致害機(jī)制中，由代謝酶減少攝入、增強(qiáng)對(duì)植物防御化合物的代謝能力或盡量排泄出去、以及降低害蟲靶標(biāo)對(duì)防御化合物的敏感性，在害蟲致害寄主時(shí)起著更重要的作用(Uemuraetal., 2019)。

昆蟲的中腸中包含多種與消化、解毒、糖代謝等相關(guān)的酶類，在昆蟲與植物的相互作用中起到重要作用。2016年鄭瑜從褐飛虱中腸轉(zhuǎn)錄組中篩選出與消化、解毒以及糖代謝等有差異表達(dá)的基因，成功克隆了18個(gè)重要的差異表達(dá)基因(鄭瑜, 2016)。褐飛虱體內(nèi)3種主要的解毒酶(P450、谷胱甘肽和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)和保護(hù)酶的活性在取食抗蟲水稻品種后均會(huì)明顯升高(呂仲賢等, 1997; 周亦紅等, 2003; Yangetal., 2005; 劉玉坤等, 2011)。褐飛虱取食抗蟲水稻品種YHY15(含抗褐飛虱基因Bph15)后，3個(gè)P450基因(CYP4C61、CYP6AX1和CYP6AY1)的表達(dá)量上調(diào)，RNAi結(jié)果表明：CYP4C61可促進(jìn)褐飛虱在YHY15上取食(Pengetal., 2017)。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶也被證實(shí)參與褐飛虱對(duì)寄主植物的適應(yīng)(Sunetal., 2013)。為探索害蟲適應(yīng)抗蟲作物的潛在新基因，轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用不斷增多。Zhang等(2019)利用敏感水稻品種Nipponbare和Bph6轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻品種以及最新的測(cè)序技術(shù)，鑒定出1 893個(gè)差異表達(dá)基因，其中細(xì)胞凋亡和自噬、以及解毒等基因在取食抗蟲水稻品種的褐飛虱中上調(diào)。

在分子水平上，代謝酶基因受抗性植株或者植物抗性物質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)的現(xiàn)象也越來越多地被發(fā)現(xiàn)(Fengetal., 2001; Lietal., 2007)。例如，禹海鑫(2013)在褐飛虱唾液腺中發(fā)現(xiàn)的基因Nl4777與Bos等(2010)研究的豌豆蚜MP43效應(yīng)子屬于高度同源基因。褐飛虱唾液中含有β-葡萄糖苷酶，用該酶處理抗性水稻可以明顯增加水楊酸、乙烯和過氧化氫的含量，降低了茉莉酸的含量。結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶處理與褐飛虱取食水稻的作用結(jié)果相似，都激活了水稻防御信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(王霞等, 2007)。Ji等(2017)在唾液腺中鑒定出內(nèi)源性β-1，4-葡聚糖酶(NlEG1)；NlEG1能促進(jìn)褐飛虱口針進(jìn)入水稻韌皮部，并降解細(xì)胞壁中的纖維素。在褐飛虱中腸中發(fā)現(xiàn)的胰脂肪酶基因，主要通過調(diào)節(jié)褐飛虱的三酰甘油代謝和取食行為來影響褐飛虱的致害性(Yuanetal., 2020)。因此，昆蟲對(duì)植物毒性物質(zhì)代謝能力的增強(qiáng)是其致害性提高的主要因素之一。

5 展望

隨著各種組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，褐飛虱及水稻的基因組學(xué)研究已取得了一些進(jìn)展。目前，一方面在水稻種質(zhì)資源中檢測(cè)出許多褐飛虱抗性基因(Akankshaetal., 2019)。并且克隆并鑒定了幾個(gè)抗性基因如Bph15、Bph9、Bph3等(杜波等, 2016)，這為闡明褐飛虱致害性不同抗性水稻品種的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。另一方面褐飛虱的基因組已測(cè)序，褐飛虱唾液的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)也在迅速積累中(Huangetal., 2019)。不同水稻品種在抗性壓力下褐飛虱種群的基因組變異將成為理解昆蟲對(duì)寄主變異的適應(yīng)性的重要途徑之一。根據(jù)水稻抗褐飛虱基因的類別，在互作過程中褐飛虱也產(chǎn)生了不同的致害機(jī)制，主要分為主動(dòng)適應(yīng)機(jī)制和被動(dòng)適應(yīng)機(jī)制。通過基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組多層次的關(guān)聯(lián)分析褐飛虱致害表型相關(guān)的基因變異，并根據(jù)致害性變異機(jī)制的類型，通過RNAi、CRISPR/Cas9等基因技術(shù)研究這些基因調(diào)控褐飛虱致害性變異的機(jī)制，對(duì)昆蟲致害性相關(guān)基因的多樣性和等位基因的功能進(jìn)行探索，將有助于揭示植物與植食性昆蟲協(xié)同進(jìn)化的過程，有助于提升糧食生產(chǎn)過程中害蟲可持續(xù)控制的理論。