蜂巢奇露尾甲幼蟲齡期的劃分

張明明，高傳部，夏 敏*，李 軍*

(1. 南陽師范學院，河南南陽 473061；2. 廣東省科學院動物研究所，廣東省動物保護與資源利用重點實驗室，廣東省野生動物保護與利用公共實驗室，廣州 510260)

蜂巢奇露尾甲AethinatumidaMurray屬鞘翅目Coleoptera露尾甲科Nitidulidae，原分布于撒哈拉沙漠以南的非洲地區(qū)，是西方蜜蜂ApismelliferaL.的巢內(nèi)害蟲(Lundie, 1940; Neumann & Elzen, 2004)。該蟲剛傳入我國時，依據(jù)其英文俗名(Small hive beetles)國內(nèi)稱其為蜂巢小甲蟲或蜂箱小甲蟲，后經(jīng)與中國露尾甲研究專家商議，根據(jù)我國昆蟲中文名確定的基本原則，將此蟲中文名定為蜂巢奇露尾甲(張明明等, 2021)。蜂巢奇露尾甲目前已經(jīng)入侵到美洲、大洋洲、歐洲和亞洲(Cuthbertsonetal., 2013; Neumannetal., 2016; Cervanciaetal., 2016)，成為全球范圍內(nèi)的入侵害蟲之一。近年來，蜂巢奇露尾甲在中國的發(fā)生和危害有加劇的趨勢，2017年10月在廣東省汕尾市新田鎮(zhèn)的蜂場內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)疑似蜂巢奇露尾甲為害，并在廣東省陸河縣的蜂場內(nèi)采集到了其幼蟲和成蟲；2018年6月在廣州市的意蜂試驗蜂場發(fā)現(xiàn)蜂巢奇露尾甲，且為害相對較重(趙紅霞等, 2018; 2019)。隨后在廣西省、云南省、海南省昌江縣昌化鎮(zhèn)和白沙縣細水鄉(xiāng)均發(fā)現(xiàn)蜂巢奇露尾甲為害(金濤等, 2020)。張體銀等(2017)研究發(fā)現(xiàn)蜂巢奇露尾甲的傳入釋放風險、暴露擴散風險、潛在影響和風險等級均為高，有可能成為我國養(yǎng)蜂業(yè)的毀滅性蟲害。鐘義海等(2020)利用有害生物風險評估方法(PRA)對蜂巢奇露尾甲的入侵風險進行了定性及半定量評估，其在中國的綜合風險值(R)為2.09，是對我國養(yǎng)蜂業(yè)具有高度危險性的有害生物。

國外學者認為蜂巢奇露尾甲有4個可識別的幼蟲齡期(Haque & Levot, 2005; Kanga & Somorin, 2012; Scottetal., 2020)，但并未對幼蟲齡期的劃分展開詳細的研究。而幼蟲齡期的劃分是進一步開展害蟲生物學、生態(tài)學研究以及制定防治策略和預測預報害蟲發(fā)生規(guī)律的基礎(魏書軍等, 2006; 董易之等, 2011; 張錦坤等, 2021)。此外，昆蟲幼蟲身體生長具有一定的規(guī)律性，絕大多數(shù)昆蟲體長增長是連續(xù)性的，而頭殼及其他表皮結構的增長是間斷式的，身體骨化程度較高的部分伴隨周期性蛻皮而呈跳躍式增長(陳永年等, 1988; 王小藝等, 2005)，因此本研究選擇頭殼寬這一形態(tài)指標作為劃分幼蟲齡期的依據(jù)。通過測量頭殼寬對蜂巢奇露尾甲幼蟲進行齡期劃分，并對幼蟲的形態(tài)特征進行了描述，旨在為進一步了解蜂巢奇露尾甲幼蟲的發(fā)育情況，準確的預測其發(fā)生時間并采取有效的防治措施奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及飼養(yǎng)方法

試驗所用蟲源采集自廣東省陸河縣蜂場(23°28′N，115°24′E)，幼蟲和成蟲各采集約100頭，帶回廣東省科學院動物研究所實驗室，在溫度27℃±1℃，相對濕度60%±5%，光照周期L ∶ D=16 h ∶ 8 h的人工氣候箱中進行飼養(yǎng)。將幼蟲分裝在飼料盒中，定期供給新鮮的人工飼料，直至幼蟲進入預蛹期，然后挑入養(yǎng)蟲土中進行化蛹，再將羽化的成蟲放入有新鮮飼料和產(chǎn)卵裝置的飼料盒中，孵化后的F1代幼蟲用于頭殼寬測定。

1.2 蜂巢奇露尾甲幼蟲形態(tài)特征

使用Leica M205C體視顯微鏡、LeicaMC190 HD攝像頭和Leica Application SuiteV.9系統(tǒng)觀察蜂巢奇露尾甲老熟幼蟲頭部、胸部及腹部等部位的形態(tài)特征。

1.3 幼蟲分齡形態(tài)指標測量

選取蜂巢奇露尾甲骨化程度較高的頭殼寬作為劃分齡期的形態(tài)指標：頭殼寬(與幼蟲縱軸中線垂直的頭殼最寬處的度量)。觀察時間從F1代初孵幼蟲當天開始，每天定時隨機挑取30頭幼蟲，用75%酒精殺死，使用OLYMPUS體視顯微鏡SZ51(20×目鏡帶刻度)進行觀察測量，直至幼蟲進入預蛹期。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0對蜂巢奇露尾甲頭殼寬測量值進行頻數(shù)分布分析，并繪制相應的頻次分布圖，根據(jù)Dyar規(guī)律(Crosby, 2012)初步劃分幼蟲的齡期數(shù)，并利用Crosby生長法則和回歸分析驗證齡期劃分的合理性。應用Brooks指數(shù)、Crosby指數(shù)和線性回歸的方法驗證分齡的合理性，選擇最佳分齡指標。

當Crosby指數(shù)< 0.1時分齡指標分組劃分合理，當Crosby指數(shù)> 0.1時分齡指標分組不合理。Crosby指數(shù)計算公式：

Brooks指數(shù)=Xn/Xn-1(式中Xn和Xn-1分別表示n齡和n-1齡幼蟲測量值指標的平均值)

Crosby指數(shù)=(bn-bn-1)/bn-1(式中bn和bn-1分別表示第n齡和n-1齡的Brooks指數(shù))

2 結果與分析

2.1 蜂巢奇露尾甲幼蟲的形態(tài)特征

老熟幼蟲(圖1)乳白色，體長9～10 mm，寬1.1～1.5 mm，寡足型；口器前口式，觸角3節(jié)，唇基兩側具隆突；胸足3對，中胸具1對可見氣門(圖1-a)，前胸背板有淺棕色印痕，中縱線乳白色；可見腹節(jié)9節(jié)，無腹足，第1～8腹節(jié)每節(jié)各具1對雙室氣門，尾節(jié)簡單，前后各具1對尾突(圖1-b)。1～3齡幼蟲在形態(tài)結構上與 4齡幼蟲存在差異，中、后胸及腹節(jié)背板中片瘤突：1～3齡幼蟲的中片后方著生3個刺狀瘤突，前1后2，第8腹節(jié)的瘤突大于前7腹節(jié)，瘤突無毛(圖2-A)；4齡幼蟲中、后胸及1～8腹節(jié)背面具1對棕色亞中片，中片后方著生1對刺和1刺狀瘤突，瘤突端部尖銳，瘤突頂端著生1剛毛(圖2-B)。通過分析頭殼寬度值得出，1～2 d、3～4 d、3～6 d、5～16 d的幼蟲可分別劃分為同一齡期，共4個齡期，相鄰齡期有交叉現(xiàn)象。1～2 d為1齡期幼蟲；第3天為2齡幼蟲；3齡、4齡幼蟲齡期交叉明顯；第6天后皆為4齡幼蟲。

圖1 蜂巢奇露尾甲4齡幼蟲背側Fig.1 Dorsal offourth instar larvae of Aethina tumida注：a，4齡幼蟲的中胸氣門；b，4齡幼蟲的2對尾突。Note：a, Meso-metathorax spiracle of fourth instar larvae; b, Two pairs of urogomphi of fourth instar larvae.

圖2 蜂巢奇露尾甲幼蟲背側瘤突Fig.2 Dorsal nodular protrusions of Aethina tumida larvae注：A，1～3齡幼蟲背側瘤突；B，4齡幼蟲背側瘤突。Note: A, Dorsal nodular protrusions of first to third instar larvae; B, Dorsal nodular protrusions of fourth instar larvae.

2.2 蜂巢奇露尾甲幼蟲齡數(shù)的初步劃分

本研究通過對飼養(yǎng)條件下的蜂巢奇露尾甲幼蟲的頭殼寬度(圖3)進行測量，獲得了480個幼蟲頭殼寬度值，將頭殼寬測量值由小到大排序，通過SPSS 26.0處理分析得到頻數(shù)分布表，并繪制頻次分布圖(圖4)，并對幼蟲的頭殼寬和齡期數(shù)進行相關性分析(圖5)。蜂巢奇露尾甲幼蟲頭殼寬值相對集中在4個區(qū)域，峰值分別為0.182 mm、0.286 mm、0.468 mm、0.702 mm(圖4)。因此，根據(jù)Dyar法則可以初步判定蜂巢奇露尾甲幼蟲齡數(shù)為4齡。

圖3 蜂巢奇露尾甲幼蟲分齡的測量指標Fig.3 Measurement index of Aethina tumida larvae instars注：Y，蜂巢奇露尾甲幼蟲的頭殼寬度。Note: Y, Head capsule width of Aethina tumida larvae.

圖4 蜂巢奇露尾甲幼蟲頭殼寬測量值頻次分布圖Fig.4 Frequency distribution of the measured value of the head capsule width of Aethina tumida larvae

2.3 蜂巢奇露尾甲幼蟲Crosby指數(shù)分析

按照頻數(shù)分布表和頻次分布圖，對蜂巢奇露尾甲幼蟲各齡期區(qū)域內(nèi)的測量值進行樣本數(shù)、變幅、均值、變異系數(shù)、Brooks指數(shù)及Crosby指數(shù)統(tǒng)計計算(表1)。Crosby生長法則認為，Crosby指數(shù)大于10%表明分齡指標的分組不合理(Craig, 1975; Loerch and Cameron, 1983)。蜂巢奇露尾甲各齡期頭殼寬平均值分別為 0.184 mm、0.294 mm、0.461 mm、0.728 mm(表1)。不同齡期之間形態(tài)指標的平均值具有顯著性差異，且形態(tài)指標的Crosby指數(shù)小于0.1。說明將蜂巢奇露尾甲幼蟲齡期劃分為4齡是合理的。

圖5 蜂巢奇露尾甲幼蟲的頭殼寬與齡期的相關性分析Fig.5 Correlation analysis of the head capsule width with Aethina tumida instars

2.4 蜂巢奇露尾甲幼蟲形態(tài)指標與齡期的關系

對蜂巢奇露尾甲幼蟲齡期(x)與其對應的頭殼寬的均值進行線性、多項式(二次和三次)及指數(shù)回歸分析(表2)。結果表明，蜂巢奇露尾甲幼蟲分齡指標的線性關系和指數(shù)關系與齡期存在極顯著的相關關系，其中分齡指標與齡期之間的指數(shù)擬合模型的回歸系數(shù)最大，三次線性擬合模型和二次線性擬合模型的回歸系數(shù)次之，直線擬合模型的回歸系數(shù)相比最低。說明根據(jù)頭殼寬劃分蜂巢奇露尾甲幼蟲齡期是合理的，進一步驗證了頻次分布和Crosby指數(shù)分析的結果。

3 結論與討論

Dyar定律認為相鄰齡期的幼蟲其骨化部位以一定的幾何級數(shù)方式增長(Chapman, 1998;彩萬志等, 2001)。賴開平等(2008)通過測量眉斑并脊天牛GleneacantorFabricius幼蟲頭殼寬，推斷出眉斑并脊天牛幼蟲齡期且該結果與實際觀察結果一致。張海濱等(2011)測量了人工飼養(yǎng)的星天牛AnoplophorachinensisForster幼蟲的9個形態(tài)指標，結果表明額寬、上顎長和上顎寬3種骨化程度較高的結構分齡的可靠性優(yōu)于其他。于永浩等(2012)通過對天牛幼蟲頭口寬和前胸背板寬等形態(tài)指標的測量，發(fā)現(xiàn)利用測量頭口寬值判定庶根土天牛Dorysthenesgranulosus幼蟲的蟲齡更科學合理。潘龍等(2015)對青楊脊虎天牛XylotrechusrusticusLinnaeus幼蟲的6項形態(tài)指標進行測量，得出前胸背板寬與蟲齡的擬合度最高為最佳分齡指標。張祖兵等(2020)認為頭殼寬度是判定赤斑白條天牛Batocerarufomaculata(Degeer, 1775)幼蟲齡期的最佳形態(tài)指標。由于幼蟲的頭殼骨化程度較高而且形態(tài)較為穩(wěn)定，故常常將昆蟲幼蟲頭殼寬作為幼蟲齡期劃分的指標。

表1 蜂巢奇露尾甲形態(tài)指標測量值及統(tǒng)計分析結果

表2 蜂巢奇露尾甲幼蟲分齡指標與齡數(shù)之間的關系擬合結果

在蜂箱中，蜂巢奇露尾甲的低齡幼蟲為害狀不明顯，不易被發(fā)現(xiàn)，故在野外難以獲取大量低齡幼蟲，而室內(nèi)飼養(yǎng)能克服此缺點并可以保持幼蟲生長的一致性(賴開平等, 2008; 張祖兵等, 2020)。本研究通過室內(nèi)利用人工飼料飼養(yǎng)蜂巢奇露尾甲，從而獲得充足數(shù)量的低齡幼蟲，因為蜂巢奇露尾甲幼蟲的頭部是骨化程度較高的器官組織，故通過測量蜂巢奇露尾甲幼蟲頭殼寬，并通過頻次分布圖、Crosby指數(shù)和回歸分析結果，判定蜂巢奇露尾甲幼蟲齡期為4齡。Haque和Levot(2005)認為蜂巢奇露尾甲幼蟲有4個齡期，幼蟲攝食可長達6 d，幼蟲在停止取食后仍然可保持4～13 d。Scottetal.(2020)使用鑷子和放大燈在蜂巢中共發(fā)現(xiàn)了133頭幼蟲，其中包括1齡幼蟲7頭、2齡幼蟲22頭、3齡幼蟲47頭、4齡幼蟲57頭；均與本研究結果吻合。Adrianetal.(2012)對蜂巢奇露尾甲幼蟲進行了實驗室競爭性誘捕試驗，結果表明光照對早齡幼蟲的吸引力不顯著，而游蕩期的幼蟲表現(xiàn)出強烈的趨光性，因此飼養(yǎng)條件下光照周期的不同可能會造成幼蟲齡期數(shù)的不同；本研究還發(fā)現(xiàn)1～3齡幼蟲的發(fā)育歷期均相對較短，取樣間隔時間過長可能會造成齡期劃分的誤差。因此本研究通過每天連續(xù)不間斷的取樣方法，從而為數(shù)據(jù)分析的準確性提供了保障；通過分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)2齡幼蟲的發(fā)育歷期相對較短，且2齡和3齡幼蟲齡期有交叉現(xiàn)象，故通過取樣得到的2齡幼蟲數(shù)量較少；1齡和3齡幼蟲的發(fā)育歷期相對稍長，故取樣得到的1齡和3齡幼蟲數(shù)量相對較多且總量差別不大；但由于1齡幼蟲頭殼寬度值變幅較小，所以分布相對集中，而 3齡幼蟲頭殼寬度值變幅相對較大，所以分布相對分散；4齡幼蟲的發(fā)育歷期為最長，所以得到的4齡幼蟲數(shù)量為最多(圖4)。齡期的準確劃分，可以為蜂巢奇露尾甲的生物學習性研究及科學防治方案的制定等提供理論依據(jù)，Kanga和Somorin(2012)測定了蜂巢奇露尾甲1～4齡幼蟲對殺蟲劑和昆蟲生長調(diào)劑的敏感性，篩選出幾種對幼蟲殺滅活性較高的化學藥劑，同時也發(fā)現(xiàn)其中4種昆蟲生長調(diào)節(jié)劑對3齡、4齡幼蟲的生長發(fā)育沒有不良影響；Powelletal.(2017)通過對蜂巢奇露尾甲1～4齡幼蟲的靶位點注射dsRNA來實現(xiàn)RNA干擾，為蜂巢奇露尾甲的生物防治新技術應用提供理論指導。

本研究還對蜂巢奇露尾甲幼蟲的形態(tài)特征進行描述，養(yǎng)蜂者或相關部門可根據(jù)蜂巢奇露尾甲幼蟲的形態(tài)特征，嚴格進行蜂巢或進口蜂產(chǎn)品的檢驗和檢查，提前做好預報和預防工作，以避免或減少該蟲對我國養(yǎng)蜂業(yè)的影響，促進我國蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)的快速健康發(fā)展(泮莞坤, 2016)。關于蜂巢奇露尾甲幼蟲各齡期形態(tài)特征的描述則會做進一步的詳細研究。