環(huán)狀RNA_000926通過靶向miR-411-5p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞的增殖和凋亡

王娜，張霞，李淼，張華林，王玉凈（河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 婦科，河北 石家莊 050000）

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年大約有53萬新發(fā)病例和27萬死亡病例[1]。持續(xù)性人乳頭瘤病毒感染是宮頸癌的主要發(fā)病原因。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，接受手術(shù)、放射與化學(xué)治療患者的5 年總生存（OS）率達(dá)80%，復(fù)發(fā)患者的5 年OS 率低于50%[2]。因此，需要更深入地了解宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的病理機制來尋找新的治療靶點，以改善患者預(yù)后。環(huán)狀RNA（circular RNA,circRNA）是一類內(nèi)源性非編碼RNA，circRNA 的結(jié)構(gòu)是一個獨特的閉環(huán)，因此，在各種生物學(xué)過程中不易降解和穩(wěn)定表達(dá)。研究結(jié)果[3-4]發(fā)現(xiàn)，circRNA在多種類型惡性腫瘤中起重要作用。circ_000926 在腎細(xì)胞癌中高表達(dá)，并通過下調(diào)其表達(dá)可抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力[5]。然而，circ_000926在宮頸癌中的作用及其機制尚不清楚。miRNA 是小的單鏈RNA，其長度為20～25個核苷酸，可作為基因調(diào)控的關(guān)鍵功能因子[6]。miR-411-5p 能夠抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[7]，但其在宮頸癌中表達(dá)失調(diào)的機制尚未明了。本研究通過檢測宮頸癌組織和細(xì)胞中circ_000926 和miR-411-5p 表達(dá)水平，通過體外實驗探討過表達(dá)或沉默circ_000926對宮頸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響及其作用機制，為尋求宮頸癌特異性靶向治療方法提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本、細(xì)胞及主要試劑

收集2019年5月至2020年9月在河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院手術(shù)切除的30例宮頸癌患者的癌及癌旁組織標(biāo)本，所有組織標(biāo)本均經(jīng)過病理學(xué)診斷。組織標(biāo)本收集后，立即保存于-80 ℃液氮中。所有患者術(shù)前均告知并簽署知情同意書，研究方案征得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。人宮頸癌細(xì)胞HeLa和SiHa和正常宮頸細(xì)胞Ect1/E6E7均購自美國模式培養(yǎng)物集存庫。DMEM培養(yǎng)基、LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒、TRIzol試劑、PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自美國Invitrogen 公司，雙熒光素酶載體、circ_000926 過表達(dá)質(zhì)粒和空白質(zhì)粒、circ_000926小干擾RNA和陰性對照寡核苷酸、miR-411-5p模擬物（mimic）及其陰性對照購自上海吉瑪公司，CCK-8試劑、RIPA裂解液、BCA蛋白試劑盒、TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天公司，細(xì)胞核增殖抗原標(biāo)志物Ki67抗體（ab15580）、BAX 抗體（ab32503）、Caspase-3抗體（ab32351）和Caspase-9抗體（ab32539）、β-actin抗體（ab8227）及羊抗兔IgG（ab6721）均購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

將所有細(xì)胞在含有10%胎牛血清和1%鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液，直到細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期。

按照LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑盒說明將circ_000926 過表達(dá)質(zhì)粒和空白質(zhì)粒（pc-NC）、circ_000926 小干擾RNA 和陰性對照寡核苷酸（si-NC）、miR-411-5p mimic 和陰性對照（miR-NC）分別轉(zhuǎn)染至HeLa和SiHa細(xì)胞，實驗分為pc-circ_000926組、pc-NC組、si-circ_000926組、si-NC組、miR-411-5p mimic 組和miR-NC 組。轉(zhuǎn)染48 h 后，采用qPCR 檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后，方可進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 qPCR 法檢測宮頸癌組織和細(xì)胞中circ_000926和miR-411-5p的表達(dá)

用TRIzol 試劑提取組織和細(xì)胞中總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，后采用SYBR-Green PCR 試劑和ABI7500FAST Real-Time PCR 儀進(jìn)行實時熒光定量PCR（qPCR）。引物序列：circ_000926 上游為5′-TTG TGCTTTCTGGAGGGTCT-3′，下游為5′-GCACAA ATAAACCCCACATTTT-3′；miR-411-5p上游為5′-TCGCTGTAGTAGACCGTAT-3′，下游為5′-GCACCT CAGGCTTGTACC-3′；GAPDH上游為5'-GAAGGT GAGGTCGGAGTC-3'，下游為 5'-GAAGAGTGG ATGGGATTC-3'；U6 上游為5'-GCTTCGGCAGCA CATATACTAA-3'，下游為5'-GCTTCACAATTTGC GTGTCAT-3'。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)。以GAPDH和U6為內(nèi)參，通過2-△△Ct方法計算circ_000926和miR-411-5p的相對表達(dá)量。

1.4 CCK-8法檢測宮頸癌細(xì)胞的增殖活力

將對數(shù)生長期的各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞接種于96 孔板（2×103個細(xì)胞/孔），待細(xì)胞貼壁后加入20 μL CCK-8試劑，在37 ℃、5%CO2環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24、48、72 和96 h 時，用酶標(biāo)儀檢測在450 nm 波長處各組細(xì)胞的光密度（D）值，并繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.5 TUNEL法檢測宮頸癌細(xì)胞的凋亡水平

將各組孔細(xì)胞接種在1 cm×1 cm 的玻片上，置于24孔板中，PBS洗滌3次。加入4%多聚甲醛固定30 min，PBS 洗滌1 次。根據(jù)制造商說明，使用TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測盒試劑進(jìn)行染色，37 ℃避光處理1 h，PBS洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察，隨機選取5個視野，通過計算TUNEL陽性細(xì)胞核數(shù)量占DAPI染色核數(shù)量的比例，計算凋亡細(xì)胞數(shù)的百分比。

1.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞Ccirc_000926 與miR-411-5p之間的靶向關(guān)系

通過在線網(wǎng)站StarBase 預(yù)測circ_000926 與miR-411-5p 之間存在互補的結(jié)合位點。使用LipofectamineTM2000 將circ_000926-野生型（WT）和circ_000926-突變型（MUT）報告基因質(zhì)粒分別與miR-411-5p mimic、miR-NC共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，48 h后，按照試劑盒說明書方法，在Dual-Luciferase?Reporter Assay System上測定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.7 WB法檢測宮頸癌細(xì)胞中Ki67、BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)水平

用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞中總蛋白，使用BCA法對蛋白進(jìn)行定量，進(jìn)行10%SDS-PAGE，將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，10%脫脂牛奶中封閉2 h，加入Ki67（1∶1 000）、BAX（1∶1 000）、Caspase-3（1∶1 000）、Caspase-9（1∶1 000）和β-actin（1∶500）一抗，4 ℃過夜培養(yǎng)。TBST洗膜后，在羊抗兔二抗（1∶2 000）中處置1 h后，使用ECL電化學(xué)發(fā)光法顯影。采用ImageJ圖像分析軟件分析目的蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參對照計算蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

qPCR法、CCK-8法、TUNEL法和WB法等實驗均獨立重復(fù)3次。采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以GraphPad Prism8.0軟件作圖。符合正態(tài)分布的計量資料以表示，兩組間差異比較采用t檢驗，多組間差異比較采用單因素方差分析，以P＜0.05或P＜0.01表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織和細(xì)胞中circ_000926 高表達(dá)、miR-411-5p低表達(dá)

qPCR法檢測結(jié)果（圖1）顯示，與癌旁組織相比，宮頸癌組織中circ_000926 表達(dá)水平顯著升高、miR-411-5p表達(dá)水平顯著降低（均P＜0.01）；與Ect1/E6E7 細(xì)胞相比，HeLa和SiHa細(xì)胞中circ_000926表達(dá)水平均顯著升高、miR-411-5p表達(dá)水平均顯著降低（均P＜0.01）。結(jié)果表明，宮頸癌組織和細(xì)胞中circ_000926顯著高表達(dá)、miR-411-5p顯著低表達(dá)。

2.2 干擾circ_000926對HeLa和SiHa細(xì)胞增殖的影響

qPCR檢測結(jié)果顯示，與pc-NC組相比，pc-circ_000926組HeLa 和SiHa 細(xì)胞中circ_000926 表達(dá)水平均顯著升高（2.89±0.28vs1.06±0.13，2.97±0.23vs0.97±0.16；均P＜0.01）；與si-NC 組相比，si-circ_000926 組HeLa 和SiHa 細(xì)胞中circ_000926 表達(dá)水平均顯著降 低（0.34±0.08vs0.93±0.17，0.41±0.05vs1.02±0.10；均P＜0.01）。CCK-8 法檢測結(jié)果（圖2）顯示，與pc-NC組相比，pc-circ_000926 組HeLa 和SiHa 細(xì)胞增殖活力顯著增強（均P＜0.01）；與si-NC組相比，si-circ_000926 組HeLa 和SiHa細(xì)胞增殖活力均顯著降低（均P＜0.01）。結(jié)果表明，過表達(dá)circ_000926 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖，敲減circ_000926則抑制宮頸癌細(xì)胞增殖。

2.3 過表達(dá)或敲減circ_000926 可抑制或促進(jìn)HeLa和SiHa細(xì)胞凋亡

TUNEL 法檢測結(jié)果（圖3）顯示，與pc-NC 組相比，pc-circ_000926 組HeLa 和SiHa 細(xì)胞凋亡率均顯著降低（均P＜0.01）；與si-NC 組相比，si-circ_000926組細(xì)胞凋亡率均顯著增高（均P＜0.01）。結(jié)果表明，過表達(dá)circ_000926 抑制宮頸癌細(xì)胞凋亡，敲減circ_000926則促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞凋亡。

2.4 circ_000926靶向負(fù)向調(diào)控miR-411-5p表達(dá)

通過在線網(wǎng)站StarBase預(yù)測發(fā)現(xiàn)，circ_000926與miR-411-5p之間存在互補的結(jié)合位點（圖4A）。雙熒光素報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果（圖4B）顯示，與miR-NC組 相比，miR-411-5p mimic 與circ_000926-WT 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01），而與circ_000926-MUT共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的熒光素酶活性無變化（P＞0.05），表明miR-411-5p可以與circ_000926直接結(jié)合。qPCR法檢測結(jié)果（圖4C）顯示，與pc-NC組相比，pc-circ_000926 組細(xì)胞中miR-411-5p 表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）；與si-NC 組相比，si-circ_000926組細(xì)胞中miR-411-5p表達(dá)顯著升高（均P＜0.01）。實驗結(jié)果表明，miR-411-5p 是circ_000926 的靶基因，circ_000926可負(fù)向調(diào)控miR-411-5p表達(dá)。

2.5 過表達(dá)或敲減circ_000926 對宮頸癌細(xì)胞中增殖與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

WB 法檢測結(jié)果（圖5）顯示，與pc-NC 組相比，pc-circ_000926 組HeLa 和SiHa 細(xì) 胞 中Ki67 蛋白的表達(dá)顯著升高（均P＜0.01），而BAX、Caspase-3 和Caspase-9蛋白的表達(dá)顯著降低（均P＜0.01）；與si-NC組相比，si-circ_000926 組HeLa 和SiHa 細(xì)胞中Ki67蛋白的表達(dá)顯著降低（均P＜0.01），BAX、Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)顯著升高（均P＜0.01）。結(jié)果表明，過表達(dá)circ_000926 可上調(diào)Ki67 蛋白的表達(dá)，并下調(diào)BAX、Caspase-3 和Caspase-9 蛋白的表達(dá)；敲減circ_000926表達(dá)后結(jié)果則相反。

2.6 過表達(dá)miR-411-5p 可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)circ_000926對宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡的作用

轉(zhuǎn)染miR-411-5p mimic后，CCK-8法、TUNEL法和WB法檢測結(jié)果顯示，與pc-NC組相比，pc-circ_000926組HeLa 和SiHa 細(xì)胞增殖活性均顯著增高（均P＜0.01，圖6A）、細(xì)胞凋亡率均顯著降低（均P＜0.01，圖6B），Ki67蛋白的表達(dá)顯著升高、BAX蛋白的表達(dá)顯著降低（均P＜0.01，圖6C）；與pc-circ_000926 組相比，pc-circ_000926+miR-411-5p mimic 組HeLa 和SiHa 細(xì)胞增殖活性顯著降低（均P＜0.05，圖6A）、細(xì)胞凋亡率顯著升高（均P＜0.05，圖6B），Ki67蛋白的表達(dá)顯著降低、BAX 蛋白的表達(dá)顯著增加（均P＜0.01，圖6C）。結(jié)果表明，過表達(dá)miR-411-5p可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)circ_000926對宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的作用。

3 討論

宮頸癌是發(fā)展中國家女性發(fā)病率與病死率較高的惡性腫瘤之一，手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療對于晚期宮頸癌患者的療效并不理想[8]，亟待尋找新的治療方法。circRNA 是穩(wěn)定的RNA 分子，通常起著miRNA海綿的作用，以調(diào)節(jié)基因表達(dá)、參與不同的病理反應(yīng)[9]，其可作為腫瘤診斷和預(yù)后評估的標(biāo)志物及潛在的治療靶點。

越來越多的證據(jù)表明，circRNA在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤中發(fā)揮重要作用。例如，circ_102002在甲狀腺乳頭癌中高表達(dá)，其通過靶向miR-488-3p/HAS2軸促進(jìn)甲狀腺乳頭癌細(xì)胞的遷移和EMT[10]；circ_0000218通過靶向吸附miR-1182 促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[11]；circRNA_400029 通過調(diào)控miR-1285-3p/TLN1軸促進(jìn)宮頸癌的惡性生物學(xué)行為，并抑制細(xì)胞凋亡，下調(diào)circRNA_400029 可抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長[12]。據(jù)報道[5]，circ_000926 在腎細(xì)胞癌中上調(diào)，敲減circ_000926 通過靶向miR-411/CDH2 軸抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、侵襲和EMT。本研究發(fā)現(xiàn)，circ_000926在宮頸癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，其可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖而抑制細(xì)胞凋亡。

miRNA 在細(xì)胞增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能[13-14]。多數(shù)研究表明，miR-411-5p 在多數(shù)腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。例如，miR-411-5p在乳腺癌中下調(diào)，SNHG15 通過調(diào)節(jié)miR-411-5p/VASP軸促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡[15]；miR-411-5p在前列腺癌中低表達(dá)，其通過靶向SMAD3/TGFBR2 抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并抑制裸鼠體內(nèi)腫瘤生長[16]。本研究通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-411-5p 與circ_000926序列間存在特異性結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果證實circ_000926 與miR-411-5p 直接結(jié)合且負(fù)向調(diào)控miR-411-5p表達(dá)；此外，上調(diào)miR-411-5p表達(dá)可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)circ_000926對宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞增殖、凋亡的影響。

綜上所述，本研究證實circ_000926 能夠通過靶向吸附miR-411-5p 促進(jìn)宮頸癌HeLa 和SiHa 細(xì)胞的增殖，并抑制其凋亡，為宮頸癌治療和預(yù)后提供了潛在靶點。未來還需進(jìn)行體內(nèi)實驗，進(jìn)一步驗證本實驗結(jié)論。