CD3ζ鏈引入YRHQ基序可增強(qiáng)靶向HER2的CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性

王田，張征崢，王曉峰，張紫夢(mèng)，張雨晴，馬翠卿，宋淑霞（河北醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室 河北省重大疾病免疫機(jī)制及干預(yù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050017）

近年來(lái)，CAR-T 細(xì)胞療法在難治性急性淋巴細(xì)胞白血病治療中取得了令人矚目的成就[1-3]，然而在實(shí)體瘤治療中仍有諸多挑戰(zhàn)[4]。CAR 的胞內(nèi)信號(hào)不僅對(duì)進(jìn)入實(shí)體瘤的CAR-T 細(xì)胞活化起決定作用，且在一定程度上可決定效應(yīng)性和記憶性CAR-T細(xì)胞的分化，進(jìn)而影響CAR-T細(xì)胞的殺傷活性及持久性[5-6]。適當(dāng)?shù)匦揎桟AR 信號(hào)分子以平衡CAR-T 細(xì)胞在抗原刺激下的激活與分化，是優(yōu)化CAR 結(jié)構(gòu)的一個(gè)重要手段。HER2 是表皮生長(zhǎng)因子受體家族的成員之一，在乳腺癌、肺癌等多種實(shí)體瘤組織中高表達(dá)[7]，而在正常組織中一般不表達(dá)或低表達(dá)。有研究結(jié)果[8]顯示，靶向HER2 的CAR-T 細(xì)胞可浸潤(rùn)到曲妥珠單抗無(wú)法進(jìn)入的乳腺癌組織中，并有效殺傷腫瘤細(xì)胞。YRHQ 氨基酸基序是STAT3 的胞內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)[9]，STAT3是JAK/STAT通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與誘導(dǎo)IFN-γ等多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，并具有抑制Treg細(xì)胞分化、維持CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能的作用[10]。本研究以本室制備的ScFv 為基礎(chǔ)[11]，制備含有CD3ζ 和CD28共刺激信號(hào)的H28ξ-CAR-T細(xì)胞，同時(shí)將CD3ξ鏈的羧基末端倒數(shù)第6 至第9 位氨基酸LHMQ 替換為YRHQ基序，制備了H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞，并對(duì)其抗腫瘤活性進(jìn)行了評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、質(zhì)粒及主要試劑

人胚腎細(xì)胞HEK-293T、卵巢癌細(xì)胞SKOV3、乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-453 和MCF-7、慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pCDH-CMV-GFP和包裝質(zhì)粒pLP-1、pLP-2、pLP-VSVG均為本實(shí)驗(yàn)室保存，人T淋巴細(xì)胞來(lái)自河北省中醫(yī)院健康體檢者。感受態(tài)Stellar 細(xì)胞購(gòu)自日本TaKaRa公司。

限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ購(gòu)自美國(guó)NEB公司，DNA 回收試劑盒購(gòu)自北京生化天根科技有限公司，T4 DNA 連接酶、脂質(zhì)體2000 均購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，人外周血淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锟萍加邢薰?，CD3磁珠、CD28抗體、流式抗體PE Mouse Anti-Human CD3、APC Mouse Anti-Human CD45RO、PE Rat Anti-Human CCR7、Biotin-Protein L及PE Streptavidin均購(gòu)自美國(guó)BD公司，CD3單克隆抗體（OKT3）購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec 公司，重組人IL-2、重組人IL-7均購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司，LDH 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司，IFN-γ、IL-2 ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司，顆粒酶B 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司，兔抗HER2抗體、兔抗PD-1抗體、兔抗TIM-3抗體、兔抗人GAPDH抗體均購(gòu)自杭州華安生物公司，HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自CST公司，熒光二抗購(gòu)自上海Abacm 公司，H28ξ-CAR 和H28ξ(YRHQ)-CAR全長(zhǎng)DNA由南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 慢病毒表達(dá)載體pCDH-HER2-CAR的構(gòu)建

將H28ξ-CAR 或H28ξ（YRHQ）-CAR 全長(zhǎng)DNA序列，經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，通過(guò)常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)分別連接到pCDH-CMV-GFP 載體，獲得pCDH-H28ξ-CAR 和pCDH-H28ξ(YRHQ)-CAR 重組表達(dá)質(zhì)粒。

1.3 慢病毒制備與病毒滴度檢測(cè)

將pCDH-H28ξ-CAR和pCDH-H28ξ(YRHQ)-CAR重組質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒pLP-1、pLP-2、pLP-VSVG按1∶1∶1∶1的比例共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，分別收集48、72 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清，過(guò)濾后經(jīng)20%蔗糖密度梯度超速離心濃縮，獲得攜帶兩種不同HER2-CAR 的慢病毒顆粒，分裝后于-80 ℃保存。

將293T 細(xì)胞接種于24 孔板（3×105個(gè)/孔），培養(yǎng)過(guò)夜，分別用1、2、4 μL的兩種慢病毒感染，72 h后，經(jīng)FCM 檢測(cè)GFP 表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，選取感染效率為10%～40%的組進(jìn)行滴度計(jì)算，計(jì)算公式：慢病毒的滴度（TU/mL）=每孔細(xì)胞總數(shù)×GFP+細(xì)胞百分率×103/加入的病毒體積（μL）。

1.4 HER2-CAR-T細(xì)胞的制備及鑒定

淋巴細(xì)胞分離液分離健康人外周血PBMC，經(jīng)抗CD3 免疫磁珠分選CD3+T 細(xì)胞，F(xiàn)CM 檢測(cè)CD3+T細(xì)胞純度。采用含5 μg/mL 的CD3mAb（OKT3）、0.5 μg/mL的CD28mAb、10 ng/mL的IL-2和IL-7的完全培養(yǎng)基活化CD3+T 細(xì)胞，48 h 后，加入MOI=50 的慢病毒和8 μg/mL 的病毒感染增強(qiáng)液，1 000×g離心1.5 h，未感染病毒的T 細(xì)胞作為陰性對(duì)照。離心后，將細(xì)胞培養(yǎng)板常規(guī)培養(yǎng)12 h或過(guò)夜，離心換液后繼續(xù)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)密度，每48 h 補(bǔ)充1 次IL-2 和IL-7（均補(bǔ)至20 ng/mL），每隔2～3 d 傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。制備的細(xì)胞分別命名為H28ξ-CAR-T 細(xì)胞和H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞。

取感染72 h的T細(xì)胞于流式管中，分別加入生物素標(biāo)記的L-蛋白及PE-Streptavidin，室溫避光處理45 min，通過(guò)FCM檢測(cè)T細(xì)胞表面CAR的表達(dá)率。在感染的第1、3、5及第7天，分別對(duì)CAR-T細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.5 細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定靶細(xì)胞表面HER2 抗原的表達(dá)

取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3、MDA-MB-453和MCF-7細(xì)胞，置于加入了玻片的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待玻片上的細(xì)胞匯合度約80%時(shí)，吸出上清液，PBS洗3 次，經(jīng)4%多聚甲醛固定、山羊血清封閉、兔抗人HER2一抗及抗兔熒光二抗分別處理后，熒光顯微鏡下觀察HER2的表達(dá)。

1.6 LDH 釋放法檢測(cè)HER2-CAR-T 細(xì)胞體外殺傷效果

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3、MDA-MB-453 和MCF-7細(xì)胞，分別置于96孔板中（104個(gè)/孔），培養(yǎng)4 h待細(xì)胞貼壁后，分別按1∶1、5∶1、10∶1、20∶1 的效靶比，將培養(yǎng)8 d、靜息2 d 的CAR-T 細(xì)胞與靶細(xì)胞混合，并設(shè)置培養(yǎng)基、效應(yīng)細(xì)胞及靶細(xì)胞自發(fā)釋放、靶細(xì)胞最大釋放不同對(duì)照，每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)16 h后按LDH試劑盒說(shuō)明檢測(cè)培養(yǎng)上清的光密度（D）值，并計(jì)算細(xì)胞毒活性。細(xì)胞毒活性=（實(shí)驗(yàn)組D值-效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)組D值-靶細(xì)胞自發(fā)組D值）/（靶細(xì)胞最大組D值-靶細(xì)胞自發(fā)組D值）×100%。

1.7 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平

同上以5∶1 的效靶比，將CAR-T 細(xì)胞分別與SKOV3、MDA-MB-453和MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，離心收集上清液，ELISA法檢測(cè)IL-2、IFN-γ和顆粒酶B的水平。

1.8 WB 法檢測(cè)CAR-T 細(xì)胞STAT3 磷酸化水平及PD-1和TIM-3的表達(dá)

將SKOV3 細(xì)胞接種于24 孔板（2×104個(gè)/孔），細(xì)胞貼壁后，加入絲裂霉素C（50 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后按5∶1 的效靶比，加入培養(yǎng)8 d、靜息2 d 的CAR-T 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集各組上清液中懸浮的T 細(xì)胞，提取總蛋白。經(jīng)SDS-PAGE，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后，分別加入兔抗人STAT3（1∶500）、pSTAT3（1∶500）、PD-1（1∶1 000）、TIM-3（1∶1 000）或GAPDH（1∶8 000）一抗，4 ℃過(guò)夜。TBST 洗膜后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫下處理1 h。TBST 洗膜后，滴加ECL 顯色液顯影，采用ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值。

1.9 FCM檢測(cè)HER2-CAR-T細(xì)胞亞型

同1.8 按5∶1 的效靶比，將T 細(xì)胞與絲裂霉素C處理的SKOV3 細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，收集各組懸浮的T細(xì)胞置于流式管中。分別加入抗人APC-CD45RO、抗人PE-CCR7抗體，4 ℃避光處理45 min，洗滌、重懸細(xì)胞，上FCM 檢測(cè)初始T 細(xì)胞（TN）CCR7+CD45RO-、效應(yīng)T 細(xì)胞（TEFF）CCR7-CD45RO-、中央記憶T 細(xì)胞（TCM）CCR7+CD45RO+及效應(yīng)記憶T細(xì)胞（TEM）CCR7-CD45RO+等不同亞型T細(xì)胞的分布。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以上主要實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。采用SPSS16統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料采用單因素方差分析進(jìn)行比較，不符合方差分析的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)的方法，以P＜0.05 或P＜0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功制備攜帶靶向HER2的CAR的慢病毒

成功合成了兩個(gè)CAR的全長(zhǎng)DNA，即H28ξ-CAR和H28ξ(YRHQ)-CAR（圖1A）。其中H28ξ-CAR胞內(nèi)信號(hào)包括CD28 的穿膜和胞內(nèi)段的68 個(gè)氨基酸（第151～218，GenBank:BC112085.1）以及CD3ζ 鏈胞內(nèi)段112 個(gè)氨基酸（第52～163，GenBank:J04132.1）。H28ξ(YRHQ)-CAR 的CD3ζ 胞內(nèi)段羧基末端倒數(shù)第6～9 個(gè)氨基酸由LHMQ 置換成YRHQ，其他與H28ξ-CAR相同。將H28ξ-CAR和H28ξ(YRHQ)-CAR分別經(jīng)EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切后，與經(jīng)同樣酶切的pCDH-CMV-GFP 載體鏈接，獲得pCDH-H28ξ-CAR和pCDH-H28ξ(YRHQ)-CAR重組質(zhì)粒。

FCM 檢測(cè)慢病毒感染293T 細(xì)胞48 h 后的感染效率（圖1B），經(jīng)計(jì)算，病毒滴度（TU/mL）分別為1.72×108和1.65×108。

2.2 成功制備CAR-T細(xì)胞

FCM檢測(cè)結(jié)果（圖2A）顯示，CD3+T細(xì)胞的純度可達(dá)（94.3±3.4）%。兩種攜帶HER2-CAR 的慢病毒以MOI=50感染活化48h的T細(xì)胞，培養(yǎng)5d后，H28ξ-CAR-T和H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞的CAR表達(dá)陽(yáng)性率分別為（33.3±2.85）%和（28.30±3.2）%，顯著高于激活的T細(xì)胞（P＜0.01，圖2B）。此外，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察到，兩種HER2-CAR慢病毒感染T細(xì)胞后的第1、3天時(shí)，細(xì)胞增殖能力與T細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），至第5和第7天時(shí)，兩種HER2-CAR-T 細(xì)胞增殖明顯減緩（P＜0.01或P＜0.05，圖2C）。

2.3 SKOV3 和MDA-MB-453 細(xì)胞膜表面表達(dá)HER2抗原

細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果（圖3）顯示，SKOV3、MDA-MB-453 細(xì)胞膜可見HER2 表達(dá)，而MCF-7 細(xì)胞未見HER2表達(dá)。結(jié)果表明，SKOV3、MDA-MB-453為HER2陽(yáng)性細(xì)胞，MCF-7為HER2陰性細(xì)胞。

2.4 引入YRHQ 基序可增強(qiáng)CAR-T 細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的特異性殺傷活性

LDH 釋放法結(jié)果（圖4）顯示，隨著效靶比的增加，H28ξ-CAR-T 和H28ξ(YRHQ)-CAR-T 細(xì) 胞 對(duì)SKOV3、MDA-MB-453 細(xì)胞的殺傷作用逐漸增強(qiáng)（P＜0.05 或P＜0.01），當(dāng)20∶1 的HER2-CAR-T 細(xì)胞與癌細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可殺傷40%以上的HER2+SKOV3或MDA-MB-453 細(xì)胞，但對(duì)HER2-MCF-7 細(xì)胞的殺傷作用較弱，而T細(xì)胞未見明顯的細(xì)胞毒作用。在同一效靶比的情況下，H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞腫瘤特異性殺傷活性顯著高于H28ξ-CAR-T 細(xì)胞（均P＜0.05）。結(jié)果表明，引入YRHQ 基序可增強(qiáng)CAR-T 細(xì)胞對(duì)HER-2+細(xì)胞的特異性殺傷活性。

2.5 引入YRHQ基序可促進(jìn)CAR-T細(xì)胞IL-2、IFN-γ和顆粒酶B的釋放

ELISA 檢 測(cè) 結(jié)果（圖5）顯 示，與SKOV3 和MDA-MB-453 細(xì)胞共培養(yǎng)后，H28ξ-CAR-T與H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞均可釋放高水平的IL-2、IFN-γ和顆粒酶B，與T 細(xì)胞比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。其中，H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞釋放的IL-2、IFN-γ和顆粒酶B水平顯著高于H28ξ-CAR-T細(xì)胞（均P＜0.01）。結(jié)果表明，引入YRHQ 基序可促進(jìn)CAR-T細(xì)胞IL-2、IFN-γ和顆粒酶B的釋放。

2.6 引入YRHQ 基序提高CAR-T 細(xì)胞的STAT3 磷酸化水平

按效靶比5∶1，將H28ξ-CAR-T 和H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞共培養(yǎng)4 h后，WB法檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，與T細(xì)胞組和H28ξ-CAR-T組比較，H28ξ(YRHQ)-CAR-T 細(xì)胞p-STAT3 蛋白水平明顯升高（P＜0.01）；而該兩種HER2-CAR-T 細(xì)胞與SKOV3細(xì)胞共培養(yǎng)24 h 后，細(xì)胞中TIM-3 和PD-1 的表達(dá)與T 細(xì)胞比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)果表明，引入YRHQ 基序可提高CAR-T 細(xì)胞的STAT3磷酸化水平，且未明顯增加T細(xì)胞耗竭。

2.7 引入YRHQ基序促進(jìn)CAR-T細(xì)胞向TEM細(xì)胞分化

FCM檢測(cè)結(jié)果（圖7）顯示，培養(yǎng)到第10 天的T細(xì)胞及兩種CAR-T細(xì)胞主要為TCM(CCR7+CD45RO+)表型。經(jīng)SKOV3細(xì)胞刺激24 h 后，包含YRHQ 基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T 細(xì)胞中TEM的比例顯著增加（P＜0.05），TCM細(xì)胞的比例顯著下降（P＜0.05）。結(jié)果表明，引入YRHQ基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞不僅獲得了持久性特征，同時(shí)其抗腫瘤活性也明顯增強(qiáng)。

3 討論

磷酸化的ZAP-70與CD3ζ的ITAM結(jié)合，在抗原誘導(dǎo)T 細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[12]，因此，目前在CAR 的設(shè)計(jì)上主要選擇CD3ζ 鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)第1信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。有研究結(jié)果[13]表明，改變CD3ζ 鏈的結(jié)構(gòu)可以影響CAR-T細(xì)胞的活性，如截?cái)郈D3ζ鏈胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)域，保留1 或2 個(gè)ITAM 基序，可明顯降低CAR-T 細(xì)胞的活化，促進(jìn)免疫記憶的形成，有利于CAR-T 細(xì)胞抗腫瘤活性的持久性。減少CD3ζ 鏈的ITAM數(shù)量，勢(shì)必會(huì)抑制NF-κB、NF-AT轉(zhuǎn)錄因子的活化。但也有研究結(jié)果[14]表明，增加胞內(nèi)信號(hào)強(qiáng)度，上調(diào)CAR-T細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和NFAT的活性，有利于防止CAR-T 細(xì)胞的衰竭，提高其抗腫瘤的能力。降低或增強(qiáng)的胞內(nèi)信號(hào)，可能會(huì)通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄因子譜及活性來(lái)優(yōu)化CAR-T 細(xì)胞基因的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)平衡相關(guān)基因的表達(dá)水平影響CAR-T細(xì)胞的分化和抗腫瘤作用。因此，CAR-T 細(xì)胞功能由胞內(nèi)信號(hào)的質(zhì)量或類型而非僅僅是數(shù)量來(lái)控制。

本研究制備了含有CD28共刺激信號(hào)的第二代CAR（即H28ξ），其中，識(shí)別抗原的ScFv來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室制備的抗人HER2單抗V區(qū)的PCR產(chǎn)物[11]。CD28作為T細(xì)胞的共刺激信號(hào)，可通過(guò)其下游PI3K-Akt信號(hào)通路，為CAR-T細(xì)胞提供可克服Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的強(qiáng)大信號(hào)[15]。為了進(jìn)一步平衡CAR-T細(xì)胞的胞內(nèi)信號(hào)，將CD3ξ鏈C末端的4個(gè)氨基酸LHMQ替換為YRHQ，制備了H28ζ(YRHQ)-CAR。YRHQ氨基酸基序是胞內(nèi)STAT3的結(jié)合位點(diǎn)[16]。STAT3不僅作為JAK/STAT通路中重要的轉(zhuǎn)錄因子，活化后參與誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ等多種細(xì)胞因子及顆粒酶B的轉(zhuǎn)錄，并通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子Eomes、BCL-6和Blimp-1的表達(dá)，調(diào)節(jié)記憶性CD8+T 細(xì)胞分化，維持CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能與免疫記憶的平衡[17-19]。

利用攜帶上述CAR的慢病毒感染人外周血T細(xì)胞制備的CAR-T細(xì)胞，體外培養(yǎng)的前3 d，CAR-T細(xì)胞與未感染慢病毒的T細(xì)胞增殖水平無(wú)明顯差異，但在體外培養(yǎng)的第5和第7天時(shí)，CAR-T細(xì)胞的增殖能力明顯減緩，說(shuō)明CAR-T細(xì)胞的體外培養(yǎng)系統(tǒng)仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。通過(guò)評(píng)估CAR-T 細(xì)胞的效應(yīng)功能，可以看出H28ξ-CAR-T和H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞均可特異性識(shí)別并有效殺傷表達(dá)HER2抗原的腫瘤細(xì)胞；引入YRHQ基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷活性及IL-2、IFN-γ和顆粒酶B分泌水平均高于H28ξ-CAR-T細(xì)胞。進(jìn)一步觀察到H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞STAT3 蛋白磷酸化水平明顯高于T 細(xì)胞和H28ξ-CAR-T細(xì)胞，說(shuō)明引入YRHQ基序可以通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子STAT3的活性提高CAR-T細(xì)胞的活化水平。另外，H28ξ-CAR-T細(xì)胞也有一定水平的STAT3蛋白發(fā)生磷酸化，這可能是使用CD3抗體聯(lián)合IL-2激活T細(xì)胞后產(chǎn)生的本底信號(hào)。

PD-1、TIM-3 均為T 細(xì)胞耗竭的標(biāo)志物。表達(dá)PD-1的CAR-T細(xì)胞與表達(dá)PD-L1的腫瘤細(xì)胞相互作用后會(huì)抑制CAR-T 細(xì)胞的活化[20-22]；TIM-3 陽(yáng)性的CD8+T 細(xì)胞存在STAT5 通路受損，而阻斷TIM-3 途徑可促進(jìn)T 細(xì)胞釋放IFN-γ，增強(qiáng)抗腫瘤作用[23]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)H28ξ-CAR-T 和H28ξ(YRHQ)-CAR-T 細(xì)胞分別與SKOV3 共培養(yǎng)24 h 后，PD-1 與TIM-3蛋白表達(dá)均未見明顯改變，表明引入YRHQ基序后，雖然CAR-T細(xì)胞中STAT3活性水平升高，但腫瘤抗原的刺激未因CAR-T細(xì)胞活性增強(qiáng)而表現(xiàn)出耗竭狀態(tài)。此外，有研究結(jié)果[24]表明，CAR-T 細(xì)胞STAT3激活有利于其抵抗凋亡。當(dāng)CAR-T細(xì)胞在腫瘤抗原持續(xù)刺激的情況下，YRHQ 基序是否會(huì)影響CAR-T細(xì)胞的耗竭，有待在后續(xù)工作中深入研究。

本研究對(duì)兩種CAR-T細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞刺激前后的分化狀態(tài)也進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，整合了YRHQ基序的CAR-T細(xì)胞能顯著提高TEM（CCR7-CD45RO+）細(xì)胞亞群的比例，而TCM（CCR7+CD45RO+）細(xì)胞亞群的比例明顯下降。TCM細(xì)胞組成性表達(dá)CCR7和L-選擇素CD62L，與初始T細(xì)胞相似，可趨化到淋巴結(jié)，在抗原刺激后可穩(wěn)定增殖，產(chǎn)生大量IL-2，但無(wú)細(xì)胞毒效應(yīng)；而TEM細(xì)胞的特點(diǎn)是失去CCR7的表達(dá)，增加向炎癥部位趨化的能力，遇到抗原刺激，可快速釋放IFN-γ 和顆粒酶B 等效應(yīng)分子，具有保護(hù)性記憶功能[25-26]。TEM細(xì)胞比例的增加表明，整合了YRHQ 基序的H28ξ(YRHQ)-CAR-T細(xì)胞在識(shí)別腫瘤抗原后可快速激活發(fā)揮細(xì)胞毒作用。YRHQ 的引入是否會(huì)影響CAR-T 細(xì)胞抗腫瘤活性的持久性，本課題組將在后續(xù)的研究中繼續(xù)進(jìn)行探索。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了通過(guò)在CAR 的胞內(nèi)信號(hào)分子CD3ζ 鏈整合YRHQ 基序能以抗原依賴的方式為CAR-T 細(xì)胞傳遞激活信號(hào)，此研究為通過(guò)修飾CAR 胞內(nèi)信號(hào)來(lái)提高CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤能力提供了新思路。