HPD 600型大孔樹脂純化麥麩多酚及其抗氧化活性和定性分析

田富林 黃文晶,2 張 馳 沈汪洋,2 吳 凡

(1. 武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北 武漢 430000；2. 大宗糧油精深加工省部共建教育部重點實驗室，湖北 武漢 430000)

多酚廣泛存在于植物體中，是一種天然的抗氧化劑。研究[1-3]表明，多酚對人體健康有許多積極作用，如抗炎、抗菌、抗癌等。多酚在小麥籽粒中主要以結(jié)合態(tài)存在于小麥麩皮中，通過與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、果膠和蛋白質(zhì)等成分共價結(jié)合存在于小麥麩皮的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中[4-5]。小麥麩皮中結(jié)合態(tài)多酚的種類和含量豐富，但常規(guī)的溶劑萃取手段無法對結(jié)合態(tài)多酚進(jìn)行有效的提取，這也使得麥麩多酚的利用受到了限制。堿水解法是一種促進(jìn)植物細(xì)胞壁中結(jié)合態(tài)多酚游離化的有效方法：在強(qiáng)堿性條件下，連接多酚與細(xì)胞壁的糖苷鍵和酯鍵被破壞[6-7]，有機(jī)試劑能夠大量溶解脫離共價鍵束縛的多酚化合物，實現(xiàn)對麥麩中結(jié)合多酚的提取。但是由于麥麩復(fù)雜的成分，堿水解提取物中除了多酚外還含有很多其他化合物，不利于研究其生物活性，需要對提取物進(jìn)行純化。

大孔樹脂吸附法是目前常用的多酚類物質(zhì)純化方法之一，樹脂可再生重復(fù)利用，具有選擇性好，吸附量大，吸附、解吸速度快，生產(chǎn)效率高，操作簡便易行等優(yōu)點[8-9]。HPD 600型大孔樹脂是一種中極性大孔樹脂，常用于黃酮、多酚等植物天然成分的提取和富集。研究擬建立一種HPD 600型大孔樹脂純化麥麩多酚粗提物的工藝，并評價純化結(jié)果，以期提高麥麩多酚的純度，為大量制備高純度的麥麩多酚的生物活性提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

小麥純麩皮：湖北三杰糧油食品集團(tuán)有限公司；

乙醚、乙酸乙酯、NaOH：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

鹽酸：優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Folin-Phenol試劑：飛揚(yáng)生物工程有限公司；

2,2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、2,2-二苯基-1-三硝基苯肼(DPPH)：>98%(HPLC)，美國Sigma公司；

HPD 600型大孔樹脂：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

振蕩培養(yǎng)箱：ZHTY-70N型，上海知楚儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：XD-2000A型，上海賢得實驗儀器有限公司；

冷凍干燥機(jī)：LGJ-20G型，四環(huán)福瑞科儀科技發(fā)展(北京)有限公司；

超高液相色譜儀：Ultimate 3000型，賽默飛世爾科技有限公司；

質(zhì)譜儀：Thermo Scientific Q Exactive型，賽默飛世爾科技有限公司；

多功能酶標(biāo)儀：EnSpire型，美國PerkinElmer公司。

1.3 方法

1.3.1 大孔樹脂預(yù)處理 大孔樹脂在無水乙醇中浸泡12 h，溶脹后抽濾去除乙醇。用蒸餾水反復(fù)清洗樹脂，直至洗出液加適量水后無白色渾濁現(xiàn)象時為止。大孔樹脂在1 mol/L NaOH中浸泡4 h，浸泡后抽濾去除NaOH。用蒸餾水反復(fù)洗滌大孔樹脂，直至溶液pH值降至7.0。加入1 mol/L鹽酸浸泡4 h，浸泡后抽濾去除HCl。用蒸餾水反復(fù)洗滌大孔樹脂，直至溶液pH值降至7.0。

1.3.2 麥麩多酚堿水解粗提物制備 參考Verma等[10]的報道，以堿水解法從麥麩中提取多酚，制備粗提物。提取方法稍作修改：將2 g麥麩與75 mL NaOH (2 mol/L)混合，在振蕩培養(yǎng)箱中(40 ℃，300 r/min)反應(yīng)4 h。充分水解后，用6 mol/L的鹽酸將pH調(diào)至2。分別用100 mL乙醚和75 mL乙酸乙酯萃取水解液中的多酚，重復(fù)萃取3次。將所有有機(jī)相混合，加入適量的超純水，通過旋蒸去除有機(jī)試劑后冷凍干燥(0 Pa，-80 ℃，2 d)，所得粉末即為麥麩多酚粗提物。粗提物-20 ℃避光保存。

1.3.3 總多酚含量(TPC)測定 采用福林酚法(FC)，根據(jù)文獻(xiàn)[11]修改如下：0.2 mL樣品溶液和0.2 mL Folin-Phenol試劑混合均勻，1～2 min后加入0.4 mL Na2CO3溶液(0.12 g/mL)，水浴(50 ℃，1 h)反應(yīng)后定容至5 mL并冷卻至室溫，測定745 nm處的吸光度，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TPC，結(jié)果表示為毫克沒食子酸當(dāng)量每毫升(mg GA/mL)。

1.3.4 樹脂用量對動態(tài)吸附效果的影響 以超純水將粗提物配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg GA/mL的樣品溶液，根據(jù)HPD 600型大孔樹脂對多酚化合物的最大吸附量，考察不同用量樹脂(2，3，4，5 g)對300 mL樣品溶液的動態(tài)吸附效果。樹脂濕法裝柱，樣品溶液以1.5 mL/min的流速注入吸附系統(tǒng)，每10 mL收集一份流出液并測定其TPC。以流出液體積為橫坐標(biāo)、流出液TPC為縱坐標(biāo)繪制泄露曲線[12]，以此評價不同用量樹脂的吸附效果。

1.3.5 樣品溶液流速對動態(tài)吸附效果的影響 在陶莎等[8]的研究基礎(chǔ)上考察樣品溶液流速(1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mL/min)對動態(tài)吸附效果的影響，0.5 mg GA/mL的樣品溶液以上述流速注入吸附系統(tǒng)，每10 mL收集一份流出液并測定其TPC。繪制泄露曲線以此評價樣品溶液流速對樹脂吸附效果的影響。

1.3.6 動態(tài)解吸試驗

QS=(C0-CV)V，

(1)

式中：

QS——總吸附量，mg GA；

C0——樣品溶液初始濃度，0.5 mg GA/mL；

CV——上清液TPC，mg GA/mL；

V——樣品溶液體積，mL。

(2) 洗脫液流速對洗脫效果的影響：準(zhǔn)確稱取4 g預(yù)處理后的濕樹脂，按1.3.6(1)中的方法靜態(tài)吸附。將達(dá)吸附平衡的大孔樹脂裝柱，使用150 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇水溶液以不同流速(1.0，2.0，3.0，4.0 mL/min)進(jìn)行洗脫，洗脫液每3 mL收集一份并測定其TPC。以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，TPC為縱坐標(biāo)繪制動態(tài)洗脫曲線。

我校重視青年教師培養(yǎng)和中青年骨干教師選拔培養(yǎng)工作，組織實施“青年教師培養(yǎng)計劃”和“中青年骨干教師培養(yǎng)計劃”。對青年教師的培養(yǎng)實行“青年教師培養(yǎng)導(dǎo)師制”，配備一名具有高級技術(shù)職務(wù)的教師作為導(dǎo)師，對青年教師進(jìn)行為期一學(xué)年的跟蹤指導(dǎo)，具體設(shè)計教學(xué)、科研、進(jìn)修、學(xué)術(shù)交流等相關(guān)計劃，對授課質(zhì)量進(jìn)行達(dá)標(biāo)評估，形成一套完整的“傳幫帶”機(jī)制。對中青年骨干教師的培養(yǎng)，則著重采取吸納參與重要學(xué)術(shù)活動、重大項目研究，資助脫產(chǎn)國內(nèi)外訪學(xué)和科研項目資金等方式予以重點培養(yǎng)和扶持。此外，鼓勵和支持中青年入選“廣西高等學(xué)校中青年骨干教師培養(yǎng)工程”和參加“廣西高校青年教師教學(xué)能力提升計劃”，為中青年教師搭建成長平臺。

1.3.7 多酚純度及抗氧化活性測定 按上述條件對粗提物進(jìn)行純化，旋蒸除去洗脫液中乙醇后對剩余水溶液冷凍干燥，得到純化后的麥麩多酚。按下述方法分別測定兩種樣品的純度和抗氧化能力。

(1) 多酚純度：樣品以二甲基亞砜(DMSO)溶解，參照文獻(xiàn)[14]測定并根據(jù)式(2)計算樣品中的多酚純度。

(2)

式中：

P——多酚純度，%；

C0——樣品的總多酚質(zhì)量濃度，mg GA/mL；

C——樣品溶液的質(zhì)量濃度，mg/mL。

(2) ABTS自由基(ABTS+·)清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[15]修改如下：ABTS+·儲備溶液由176 μL濃度為140 mmol/L 的K2S2O8溶液和10 mL濃度為7 mmol/L的ABTS溶液組成的混合物在黑暗中放置12～16 h制成。使用前，ABTS+·溶液用無水乙醇稀釋至吸光度為0.70±0.02(734 nm)。

0.1 mL樣品溶液與3.9 mL ABTS+·儲備液在室溫下避光反應(yīng)6 min。然后用分光光度計測定其在734 nm處的吸光度。按式(3)計算ABTS+·清除率。

(3)

式中：

S——自由基清除率，%；

AS——樣品與ABTS+·/ DPPH·混合溶液的吸光度；

Ar——DMSO與ABTS+·/ DPPH·混合液的吸光度；

A0——樣品與無水乙醇混合溶液的吸光度。

(3) DPPH自由基(DPPH·)清除能力：根據(jù)文獻(xiàn)[16—17]修改如下：無水乙醇將DPPH試劑粉末配制成0.5 mmol/L的溶液，測定時以0.5 mL樣品溶液與3.5 mL DPPH·溶液室溫條件下避光反應(yīng)1 h后測定其在517 nm處的吸光度。DPPH·的清除能力以清除率表示，并按式(3)計算DPPH·清除率。

1.3.8 麩皮多酚定性分析 采用UPLC-MS/MS法。液相部分使用Ultimate 3000型超高液相色譜儀，并配備有DAD檢測器，色譜柱：Hypersil GOLD 100 mm×2.1 mm，3 μm。柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流動相流速0.25 mL/min。采用梯度洗脫，流動相A為含0.1%甲酸的乙腈溶液，流動相B為0.1%的甲酸水溶液，流動相A的梯度為：0.0～6.0 min，5%～10%；6.0～16.0 min，10%～80%；16.0～20.0 min，80%；20.0～20.1 min，80%～5%；20.1～30.0 min，5%。DAD檢測條件：190～800 nm范圍全掃。MS采用Q Exactive靜電場軌道肼質(zhì)譜。離子源為HESI源，霧化氣40 Pa，輔助氣8 Pa，噴霧電壓3 200 V，離子傳輸毛細(xì)管溫度300 ℃，輔助氣溫度300 ℃。掃描模式：負(fù)離子Full MS/dd-MS2，掃描范圍：50～750(m/z)。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理 質(zhì)譜相關(guān)數(shù)據(jù)以Xcalibur 4.1(Thermo Fisher Scientific)軟件進(jìn)行分析，以SPSS 25和ORGIN Pro 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂用量和上樣體積的確定

圖1為不同用量HPD 600型大孔樹脂的泄露曲線，反映了經(jīng)樹脂吸附后的流出液中的TPC變化情況。當(dāng)流出液TPC為上樣液濃度的1/10時，達(dá)到泄露點，此時的樣品溶液體積被認(rèn)定為最佳上柱體積[12]。圖1結(jié)果顯示：2，3，4，5 g大孔樹脂所對應(yīng)的最佳上柱體積分別為60，150，250，300 mL，據(jù)此，選擇以4 g HPD 600型大孔樹脂對250 mL質(zhì)量濃度為0.5 mg GA/mL的麥麩多酚粗提液進(jìn)行純化，可達(dá)到理想的吸附效果。

圖1 不同用量HPD 600型大孔樹脂的吸附泄露曲線Figure 1 The adsorption leak curves for different dosages of HPD 600 macroporous resins

2.2 樣品溶液流速的確定

由圖2可知，樣品溶液的流速越大，流出液的TPC越高，這是因為高流速減小了溶液中多酚與大孔樹脂的接觸時間，不利于大孔樹脂的吸附作用[18]。當(dāng)上樣體積達(dá)到250 mL時，流速為1.2，1.4 mL/min的流出液的TPC分別為(48.85±1.45)，(50.90±1.62) μg GA/mL，接近樣品溶液濃度的1/10。據(jù)此認(rèn)為這兩種流速條件能達(dá)到更好的吸附效果，但高流速能夠提高生產(chǎn)效率，因此選擇樣品溶液流速為1.4 mL/min。

圖2 不同流速樣品溶液的吸附泄露曲線Figure 2 The adsorption leak curves for different flow rates of sample solutions

2.3 動態(tài)洗脫條件的確定

2.3.1 洗脫液濃度的確定 乙醇溶液的濃度會顯著影響動態(tài)洗脫效果[19]。由圖3(a)可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，流出液的最大TPC升高，說明大體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液對樣品溶液中的多酚具有更好的洗脫效果。這是因為樣品溶液中的多酚是以乙醚、乙酸乙酯萃取得到的，這兩種有機(jī)試劑的極性較弱。因此，萃取物中的多酚也為弱極性，在純水中的溶解度較低，但易溶于乙醇溶液。圖3(b) 中的峰面積是對圖3(a)中洗脫曲線的積分，可以反映總的洗脫量，顯著性分析結(jié)果顯示，20%，40%的乙醇溶液的洗脫量顯著低于大孔樹脂的吸附總量，說明被樹脂吸附的多酚未被完全洗脫，洗脫效果不佳；60%，80%的乙醇溶液的洗脫量與大孔樹脂的吸附總量之間無顯著性差異，說明洗脫效果較好?？紤]到成本問題，選擇60%的乙醇溶液作為洗脫液。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對洗脫效果的影響Figure 3 Effects of ethanol volume fraction on elution

2.3.2 洗脫液流速的確定 圖4(a) 顯示，隨著洗脫液流速升高，流出液的最大TPC呈降低趨勢。對比洗脫量與大孔樹脂吸附總量[圖4(b)]，發(fā)現(xiàn)洗脫量與洗脫液流速呈負(fù)相關(guān)，流速為2，3，4 mL/min的洗脫體系的洗脫量顯著小于大孔樹脂的吸附總量，說明被大孔樹脂吸附的多酚未被完全洗脫；而流速為1 mL/min的洗脫體系中，洗脫量與大孔樹脂的吸附總量無顯著性差異，說明其洗脫效果較好，因此選擇洗脫液流速為1 mL/min。結(jié)果表明低流速有助于洗脫，是因為在低流速情況下，洗脫液可以進(jìn)入樹脂的孔縫，其中的多酚更為徹底地溶解在洗脫液中并被帶出[20-21]。

圖4 洗脫液流速對洗脫效果的影響Figure 4 Effects of eluent flow rate on the elution effect

2.4 純化前后麥麩多酚純度和抗氧化活性比較

2.4.1 多酚純度 純化前后樣品中多酚純度分別為(7.09±0.20)%和(38.91±1.41)%，純化后樣品中多酚純度比純化前的高約5.49倍，說明該純化工藝有效地純化了麥麩多酚。

2.4.2 抗氧化活性 根據(jù)自由基清除測試結(jié)果，清除率與濃度相關(guān)，所有純化后樣品的自由基清除能力顯著高于未純化的。這是因為純化的樣品中多酚含量較高，從而提高了自由基清除能力。在ABTS+·清除試驗中[圖5(a)]，質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的純化后樣品對自由基的清除率接近100%。在DPPH·清除試驗中[圖5(b)]，清除率隨樣品濃度的增大而提高，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的純化后樣品對DPPH·的清除率最高，為(87.79±1.96)%。此外，相同濃度的樣品對兩種自由基的清除效果存在差異，樣品對ABTS+·表現(xiàn)出更好的清除效果，可能與兩個體系中自由基的濃度及樣品對兩種自由基的不同清除機(jī)制有關(guān)。

2.5 純化后麥麩多酚提取物的定性分析

由表1可知，經(jīng)HPD 600型大孔樹脂純化后的提取物中主要含有6種多酚化合物，按保留時間從小到大依次為：p-羥基苯甲酸、咖啡酸、香草醛、p-香豆酸、反式阿魏酸和水楊酸，除香草醛外，其余均為酚酸。在這6種多酚化合物中，存在一對同分異構(gòu)體——p-羥基苯甲酸與水楊酸(結(jié)構(gòu)式見圖6)，其MS1、MS2高度相似，但保留時間明顯不同，這是因為結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致了二者極性的不同，從而影響到固定相對它們的保留時間。在p-羥基苯甲酸[圖6(A)]和水楊酸[圖6(B)]中，羥基與羧基的位置關(guān)系分別為對位和鄰位，對位的偶極矩大于鄰位，且鄰位的羥基與羧基之間會形成分子內(nèi)氫鍵，導(dǎo)致p-羥基苯甲酸的極性遠(yuǎn)大于水楊酸[22]。試驗以C18為固定相的反相色譜柱，極性較弱的水楊酸與色譜柱中固定相間的作用力強(qiáng)于p-羥基苯甲酸[23]。在梯度洗脫過程中，甲酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)從高到低，在此過程中，極性較強(qiáng)的p-羥基苯甲酸先被洗脫，極性較弱的水楊酸后被洗脫，造成p-羥基苯甲酸先出峰，保留時間小于水楊酸。Onofrejová等[24]使用以C18為固定相的反相色譜體系對藻類提取物中的多酚進(jìn)行定性時也鑒定出了p-羥基苯甲酸和水楊酸，且前者的保留時間也小于后者。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 純化前后抗氧化能力的比較Table 5 Comparison of antioxidant capacity before and after purification

表1 純化后麥麩多酚提取物的定性結(jié)果Table 1 Qualitative results of purified wheat bran polyphenol extracts

圖6 p-羥基苯甲酸和水楊酸的結(jié)構(gòu)式Figure 6 Structural formulas for p-hydroxybenzoic acid and salicylic acid

3 結(jié)論

以HPD 600型大孔樹脂對麥麩多酚提取物進(jìn)行純化，研究了樹脂用量、樣品溶液的體積和流速、洗脫劑的濃度和流速對純化效果的影響，并以此確定樣品溶液質(zhì)量濃度為0.5 mg GA/mL時的最佳純化工藝條件，在最佳條件下，純化后的提取物中多酚純度為純化前的5.49倍，抗氧化活性也顯著提高，說明該純化工藝能有效富集提取物中的多酚。此外，經(jīng)HPD 600型大孔樹脂純化后的提取物中主要含有p-羥基苯甲酸、咖啡酸、香草醛、p-香豆酸、反式阿魏酸和水楊酸6種多酚化合物。但純化物中仍含有一定量的雜質(zhì)，如何進(jìn)一步除雜仍有待研究，這個問題僅依靠大孔樹脂無法解決，需要借助更精密的儀器(如制備型液相色譜儀、高效逆流色譜等)來完成。