卵白蛋白肽復(fù)合酶法制備工藝優(yōu)化及解酒效果

齊興宇 閆小娟 張海悅

(1. 長春工業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130000；2. 吉林省富生特醫(yī)食品有限公司，吉林 長春 130607)

小分子肽可被用作解酒產(chǎn)品[1-2]。其解酒護肝的作用機理包括：提高人體內(nèi)乙醇脫氫酶(ADH)的活性以加快酒精的代謝速度；清除在酒精代謝的過程中產(chǎn)生的大量自由基從而降低酒精對肝臟的損傷[3-4]。另外，有研究[5]發(fā)現(xiàn)肽類物質(zhì)中含有的谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸有利于合成乙醇代謝酶并減輕醉酒癥狀。目前已有的小分子肽類解酒產(chǎn)品主要以植物或海產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)為原料，但其蛋白組分常為難以純化的復(fù)雜蛋白，影響酶解效果[6-7]。卵白蛋白是雞蛋清中含量最豐富的一種蛋白質(zhì)，含有人體所需的所有必須氨基酸，是制備活性肽的理想原料[8]。目前，卵白蛋白的純化方法已經(jīng)相當成熟，蛋白酶解時的利用率更高[9]。研究擬用堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶解得到卵白蛋白肽，以瓦勒—霍赫法來評價卵白蛋白肽的體外促乙醇代謝能力[10]，以ADH激活率為響應(yīng)因素[11]，采用響應(yīng)面法優(yōu)化酶解工藝，并測定卵白蛋白肽的總抗氧化能力、水解度、氨基酸組成及相對分子質(zhì)量的分布情況，旨在驗證卵白蛋白肽的解酒活性，為提高雞蛋產(chǎn)品的附加值提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卵白蛋白：實驗室自制；

牛胰蛋白酶(250 U/mg)、堿性蛋白酶(200 U/mg)、乙醇脫氫酶(2 500 U/mL)、茚三酮：上海源葉生物科技有限公司；

總抗氧化能力試劑盒、ADH激活率試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：FA2104A型，上海精天電子儀器有限公司；

臺式高速離心機：TG16G型，湖南凱達科學(xué)儀器有限公司；

冷凍干燥機：FD-IA-50型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

pH計：3C型，上海雷磁儀器廠；

紫外可見光分光光度計：UV5500PC型，上海元析儀器有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，常州天瑞儀器有限公司；

集熱式攪拌器：DF-101S型，金壇市科析儀器有限公司；

旋渦混合器：XH-B型，江蘇天翎儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 卵白蛋白肽制備 取1 g卵白蛋白于25 mL離心管中，用15 mL蒸餾水溶解，加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶復(fù)合酶各4 000 U/g，用0.5 mol/L的NaOH溶液將體系pH值調(diào)為9.0[12]，放入50 ℃恒溫搖床中酶解5 h，酶解過程中每30 min調(diào)一次pH值。酶解結(jié)束后立即在90 ℃水浴下加熱10 min使酶滅活，然后迅速冷卻到4 ℃以4 000 r/min 離心5 min，取上清液冷凍干燥得到卵白蛋白肽粉末[13-14]。

1.3.2 乙醇脫氫酶(ADH)激活率的測定 按瓦勒—霍赫法[15]及ADH試劑盒方法執(zhí)行。在試管中加入1.5 mL的焦磷酸鈉緩沖液(pH 8.8)，1.0 mL 0.027 mol/L的氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)，0.1 mL卵白蛋白肽凍干前的上清液和0.5 mL 體積分數(shù)11.5%的乙醇溶液，混勻，25 ℃保溫5 min，立即加入0.1 mL 0.25 U/mL的乙醇脫氫酶(ADH)，混勻，測定340 nm處的吸光度，雙蒸水調(diào)零。5 min后觀察340 nm處吸光度的變化以確定生成的還原型輔酶Ⅰ(NADH)量。以蒸餾水代替卵白蛋白肽溶液進行空白對照。按式(1)計算ADH激活率。

(1)

式中：

WADH——ADH激活率，%；

A1,420 nm——樣品在450 nm處的吸光度；

A0,420 nm——對照溶液在450 nm處的吸光度。

1.3.3 總抗氧化能力的測定 將總抗氧化能力試劑盒中的試劑1、試劑2、試劑3按體積比7∶1∶1混合，37 ℃下水浴15 min，取900 μL混合液置于1.5 mL離心管中，加入30 μL卵白蛋白肽上清液和70 μL蒸餾水，同時以相同體積蒸餾水設(shè)置空白對照，將樣品充分混勻，在37 ℃下反應(yīng)10 min，測定520 nm處的吸光度值。按式(2)計算卵白蛋白肽總抗氧化能力。

(2)

式中：

M——卵白蛋白肽總抗氧化能力；

A1,520 nm——樣品在520 nm處的吸光度；

A0,520 nm——對照溶液在520 nm處的吸光度。

1.3.4 水解度的測定 參照茚三酮顯色法并根據(jù)文獻[16]稍作修改。分別取0.1 g卵白蛋白與卵白蛋白肽粉末用蒸餾水定容到10 mL，取0.2 mL樣品，加入0.8 mL蒸餾水，1 mL顯色劑?；靹蚝蠓兴〖訜?5 min。待溶液冷卻后加入5.0 mL體積分數(shù)40%的乙醇溶液混勻，靜置15 min后測定570 nm波長處的吸光度。以甘氨酸標準曲線計算酶解前后樣品溶液中游離氨基酸的含量，并采用微量凱氏定氮法測定卵白蛋白中氨基酸的總量。按式(3)計算卵白蛋白水解度。

(3)

式中：

H——水解度，%；

w1——酶解后卵白蛋白的游離氨基酸含量，g；

w2——酶解前卵白蛋白的游離氨基酸含量，g;

w3——卵白蛋白中含有的氨基酸，g。

甘氨酸標準曲線如圖1，回歸方程為Y=0.024 85X+0.114 52，R2=0.999 2。

圖1 甘氨酸標準曲線Figure 1 Glycine standard curve

1.3.5 卵白蛋白肽的相對分子質(zhì)量測定 按GB 31645—2018執(zhí)行。

1.3.6 游離氨基酸組成測定 按GB 5009.124—2016執(zhí)行。

1.3.7 單因素試驗

(1) 酶解時間：設(shè)定酶解溫度50 ℃，復(fù)合酶用量3 000 U/g，料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3∶25 (g/mL)，測定不同酶解時間(2，3，4，5，6 h)下卵白蛋白肽ADH激活率。

(2) 復(fù)合酶用量：設(shè)定酶解溫度50 ℃，酶解時間4 h，料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3∶25 (g/mL)，測定不同復(fù)合蛋白酶(雙酶配比為1∶1)用量(2 000，2 500，3 000，3 500，4 000 U/g)下卵白蛋白肽ADH激活率。

(3) 酶解溫度：設(shè)定酶解時間4 h，復(fù)合酶用量3 000 U/g，料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3∶25 (g/mL)，測定不同酶解溫度(40，45，50，55，60 ℃)下卵白蛋白肽ADH激活率。

(4) 料液比：設(shè)定酶解溫度50 ℃，復(fù)合酶用量3 000 U/g，酶解時間4 h，測定不同料液比[m卵白蛋白∶V蒸餾水分別為1∶25，2∶25，3∶25，4∶25，5∶25 (g/mL)]下卵白蛋白肽ADH激活率。

1.3.8 響應(yīng)曲面法優(yōu)化試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶解時間、復(fù)合酶用量、酶解溫度、料液比作為響應(yīng)面試驗因素，以ADH激活率為響應(yīng)值，設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0軟件繪圖并進行數(shù)據(jù)處理，運用Design Expert 13.0軟件進行響應(yīng)面設(shè)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

由圖2(a)可知，隨著酶解時間的增長，卵白蛋白肽的ADH激活率也逐漸升高，當酶解時間達5 h左右時，ADH激活率達到峰值，此時蛋白質(zhì)中的作用位點基本水解完畢。隨著產(chǎn)物濃度的增加以及底物濃度的降低，酶促反應(yīng)的速率逐漸下降[17]。繼續(xù)延長酶解時間也會對肽的活性造成負面影響。將酶解時間控制在5 h左右時，卵白蛋白肽的ADH激活率為18.9%。

由圖2(b)可知，當復(fù)合酶用量達3 000 U/g時，卵白蛋白肽的ADH激活率最高，底物基本已經(jīng)被水解完畢，繼續(xù)增加酶量對ADH激活率無影響[18]。兼顧到成本，選擇酶用量在3 000 U/g左右，此時卵白蛋白肽的ADH激活率為21.1%。

由圖2(c)可知，當酶解溫度為50 ℃時，卵白蛋白肽ADH激活率達到峰值，酶解溫度大于50 ℃時，ADH活性下降，這是由于高溫破壞了蛋白酶的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其變性失活[19]。因此，把酶解溫度設(shè)置在50 ℃附近較為合適，此時卵白蛋白肽的ADH激活率為19.9%。

由圖2(d)可知，在料液比達到3∶25 (g/mL)之前，ADH激活率隨著料液比的增加而上升，當料液比大于3∶25 (g/mL)時，ADH激活率下降，可能原因是酶的濃度不足且溶液中的蛋白質(zhì)分子未完全展開，導(dǎo)致酶活性位點未與蛋白質(zhì)分子充分接觸。繼續(xù)增大料液比會造成原料的浪費[20]。因此，選取料液比為3∶25 (g/mL)，此時卵白蛋白肽的ADH激活率為20.6%。

圖2 各因素對卵白蛋白肽ADH激活率的影響Figure 2 Effects of various factors on the activation rate of ovalbumin peptide ADH

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，在料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3∶25 (g/mL)，復(fù)合酶用量3 000 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解時間5 h的條件下得到的ADH激活率最高。因此，以酶解時間(A)、復(fù)合酶用量(B)、酶解溫度(C)、料液比(D)為變量因素，以ADH激活率(Y)為響應(yīng)值，進行四因素三水平的響應(yīng)面設(shè)計試驗，確定卵白蛋白的復(fù)最佳酶解工藝條件，響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計見表1，試驗結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化實驗因素水平表Table 1 Levels of the response surface optimization test factors

將表2數(shù)據(jù)用Design Expert 13.0軟件經(jīng)過回歸擬合后，得到二次多項回歸方程：

表2 響應(yīng)面設(shè)計方案及結(jié)果Table 2 Design scheme and results of the response surface

Y=22.51+0.866 7A+0.525B+0.918 3C+1.21D-0.577 5AB-0.227 5AC+0.520 0AD+1.37BC+0.425BD+0.245CD-2.2A2-2.52B2-3.41C2-3.93D2。

(4)

由表3可知，回歸方程模型極顯著(P<0.01)，方程失擬項不顯著(P>0.05)，回歸模型與實測值能較好擬合。決定系數(shù)R2=0.956 2>0.9，說明模型擬合程度較高，準確可靠，因此，該模型的擬合值可以用來分析卵白蛋白的最佳酶解條件。通過顯著性分析可知，酶解時間、酶用量對卵白蛋白肽的ADH激活率影響顯著。酶解溫度、底物濃度對卵白蛋白肽的ADH激活率影響極顯著，由回歸系數(shù)F值可知，各因素對卵白蛋白酶解制備活性肽的影響程度為D>C>A>B。

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析?Table 3 Analysis of variance of response surface regression equation

2.2.2 響應(yīng)面交互分析 由圖3可知，CD的響應(yīng)面陡峭，說明底物濃度和酶解溫度相互作用顯著，酶解時間和酶用量交互作用相對較弱。

圖3 各因素交互作用的響應(yīng)面及等高線圖Figure 3 Response surface and contour plots of interactive effects

2.2.3 工藝優(yōu)化及實驗驗證 根據(jù)響應(yīng)面分析，卵白蛋白肽的最佳酶解條件為酶解時間5.26 h，復(fù)合酶用量3 075 U/g，酶解溫度50.7 ℃，料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3.35∶25 (g/mL)。為方便操作，將最佳條件調(diào)整為酶解時間5 h，復(fù)合酶用量3 100 U/g，酶解溫度50 ℃，料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3.5∶25 (g/mL)。在此條件進行3組平行實驗，實際測得的卵白蛋白肽ADH激活率為(22.71±0.15)%，與模型預(yù)測值22.72%相差不大，表明在該模型下得到的最佳工藝條件具有較高的可靠性，可以用于預(yù)測卵白蛋白肽的ADH激活率。

2.3 卵白蛋白肽的總抗氧化能力與水解度

按1.3.3方法測定工藝優(yōu)化后的卵白蛋白肽總抗氧化能力，結(jié)果為(9.51±0.13) U/mL?？偪寡趸芰υ谝欢ǔ潭壬峡梢源順悠返淖杂苫宄芰21]。卵白蛋白肽在底物質(zhì)量濃度為120 mg/mL[即料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3∶25 (g/mL)]時的總抗氧化能力比同樣底物質(zhì)量濃度下骨膠原抗氧化多肽的總抗氧化能力[(8.34±0.23) U/mL][22]高，因此卵白蛋白肽具備一定的抗氧化能力，能夠清除人體內(nèi)的自由基，減輕由乙醇引起的自由基大量累積，減少飲酒對身體的損害[23]。

按1.3.4方法測定工藝優(yōu)化后卵白蛋白肽的水解度，結(jié)果為(29.28±0.16)%，與黑豆醒酒多肽的水解度(27.31±0.45)%相近[24]，說明酶解工藝較為理想。

2.4 卵白蛋白肽粉的分子量與氨基酸分布情況

由表4可知，在最佳酶解工藝條件下制備的卵白蛋白肽粉末中，總游離氨基酸含量達到了62.483%，丙氨酸(3.863 3%)，亮氨酸(5.764 7%)含量較為豐富，有助于人體穩(wěn)定生成輔酶NAD+，降低體內(nèi)乙醇的濃度。谷氨酸含量最高(9.554 3%)，有助于減輕醉酒癥狀。由表5可知，卵白蛋白肽88.77%的成分相對分子質(zhì)量在1 000 Da以下，具有吸收快，耗能低，利用率高的特點。綜上，酶解制備得到的卵白蛋白肽其相對分子質(zhì)量小，便于吸收，且具有較強的生物活性。

表4 卵白蛋白肽粉的氨基酸組成情況Table 4 Amino acid composition of ovalbumin peptide g/100 g

表5 卵白蛋白肽相對分子質(zhì)量的分布情況Table 5 Distribution of relative molecular weight of ovalbumin peptide

3 結(jié)論

卵白蛋白的最佳酶解條件為酶解時間5 h，復(fù)合酶用量3 100 U/g，酶解溫度50 ℃，料液比(m卵白蛋白∶V蒸餾水)3.5∶25 (g/mL)，在此條件下得到的卵白蛋白肽ADH激活率為(22.71±0.15)%，水解度高，相對分子質(zhì)量小，富含利于促乙醇代謝的氨基酸。卵白蛋白肽具備一定的抗氧化能力，能夠清除人體內(nèi)的自由基，后續(xù)可對卵白蛋白肽進行分離純化，確定其肽段組成，并對促乙醇代謝能力與肽段間的聯(lián)系進行研究。