紅汁乳菇多糖的結(jié)構(gòu)特征及對腸道菌群的影響

張馨方 程孟雅 楊 橋 常松林 任佳麗

(1. 林產(chǎn)可食資源安全與加工利用湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

腸道菌群的組成與健康、發(fā)育和疾病等諸多方面關(guān)聯(lián)緊密[1]，肥胖[2-3]、免疫[4]、炎癥[5]、慢性腎病[6]等疾病受腸道菌群的影響尤為顯著。研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，飲食干預(yù)可以直接降低風(fēng)險并維持腸道穩(wěn)態(tài)。目前發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)腸道菌群能力的益生元包括菊粉、低聚糖、半乳糖和葡聚糖[10-11]，但這些物質(zhì)也存在腹瀉、脹氣、便秘等不足，因此需要探索多樣化的天然多糖作為替代物[12]。

紅汁乳菇(Lactariushatsudake)是一種美味的食藥用真菌，分布廣泛[13]，其中多糖是紅汁乳菇中重要的生物活性成分[14-15]。由于人體消化酶不能直接分解多糖，多糖的消化吸收需要腸道微生物分泌的碳水化合物活性酶的幫助[16]。研究[17]證實，大多數(shù)多糖可調(diào)節(jié)腸道微生物群的豐度，如靈芝多糖可通過增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生來對抗氧化偶氮甲烷誘導(dǎo)的炎癥、腫瘤的發(fā)生。研究擬提取紅汁乳菇多糖LHP，并獲得純化的級分，分析其基本結(jié)構(gòu)并探索其對腸道菌群的影響，旨在為腸道微生物群失調(diào)相關(guān)的病理治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅汁乳菇：經(jīng)ITS測序鑒定為紅汁乳菇(Lactariushatsudake)，市售；

無水乙醇、正丁醇、氯仿：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)、鼠李糖(Rha)、甘露糖(Man)、DEAE-纖維素、Sephadex G-100：上海源葉生物科技有限公司；

大孔吸附樹脂D941：陜西樂博生化科技有限公司；

C57BL/6雄性小鼠：(20±2) g，10周齡，湖南斯萊克精達(dá)實驗動物有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

真空冷凍干燥機(jī)：LJG-10型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；

可見光分光光度計：721G型，上海儀電分析儀器有限公司；

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津公司；

掃描電子顯微鏡：Quanta FEG250型，美國FEI公司；

傅里葉紅外光譜儀：IR Tracer-100型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 LHP的提取和純化 將干燥的紅汁乳菇子實體粉末(100 g)與蒸餾水(2 L)混合，85 ℃提取3 h并不斷攪拌，55 ℃超聲處理1 h，4 000 r/min離心15 min，重復(fù)提取兩次并合并上清液，60 ℃旋蒸濃縮。濃縮物用乙醇緩慢沉淀至終濃度80%，8 000 r/min離心20 min，得粗多糖。Sevage試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)用于除蛋白，微孔吸附樹脂D941用于除色素，將冷凍干燥后獲得的多糖命名為LHP。將LHP溶解于水中(5 mg/mL)，依次通過DEAE-纖維素柱(16 mm×500 mm)和Sephadex G-100柱(16 mm×500 mm)進(jìn)行純化，分別用蒸餾水和不同濃度的氯化鈉洗脫。透析(截留分子量7 000 Da)，凍干后獲得進(jìn)一步純化的級分LHP-1和LHP-2。

1.3.2 化學(xué)成分分析

(1) 多糖含量：采用苯酚—硫酸法[18]。

(2) 蛋白質(zhì)含量：采用考馬斯亮藍(lán)法[19]。

(3) 單糖組成：參照文獻(xiàn)[20]。LHP-1和LHP-2在4 mol/L三氟乙酸中100 ℃酸解6 h，所有酸解產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)品均由0.5 mol/L PMP-甲醇溶液衍生化，然后通過高效液相色譜法分析純度，色譜條件為ODS-C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色譜柱，流速1 mL/min，流動相為乙腈和pH 6.8的磷酸鹽緩沖溶液(V乙腈∶V磷酸鹽緩沖溶液為13∶87)，進(jìn)樣量20 μL，檢測波長250 nm。

1.3.3 掃描電子顯微鏡觀察 取少量的多糖樣品粘附于載物臺上，減壓至真空環(huán)境下噴上一薄層金粉，用場發(fā)射掃描電鏡對樣品不同方位的表面特征進(jìn)行觀察。

1.3.4 傅里葉變換紅外光譜掃描 采用KBr壓片法，掃描范圍4 000～400 cm-1。

1.3.5 動物試驗 飼養(yǎng)小鼠保持在(25±2) ℃環(huán)境中，12 h明暗循環(huán)，自由采水。將30只小鼠隨機(jī)分為3組，一組為正常對照組(記為Cont組)，其余兩組小鼠給予頭孢曲松鈉灌胃，每天一次，灌胃劑量為8 g/kg體重，持續(xù)灌胃5 d，觀察小鼠糞便狀態(tài)，當(dāng)小鼠出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象視為造模成功[21]。對于造模成功的兩組小鼠，一組用紅汁乳菇粗多糖進(jìn)行干預(yù)(記為AntP組)；一組作為自然恢復(fù)組(記為Ant組)。AntP組自成功建模以來每天灌胃300 mg/kg LHP，Cont組和Ant組灌胃等體積的生理鹽水。喂食期間，觀察并記錄小鼠體重、行動能力和糞便狀態(tài)，收集干預(yù)第0，3，7，14天的糞便貯藏至液氮中。

1.3.6 小鼠腸道菌群16S rRNA測序 對動物試驗中收集的樣本進(jìn)行微生物測序，從糞便中提取DNA后，使用帶有barcode的特異引物341F CCTACGGGNGGCWGCAG和805R GACTACHVGGGTATCTAATCC擴(kuò)增16S rDNA的高變區(qū)V3和V4區(qū)，目標(biāo)片段采用AMPure XT beads回收試劑盒進(jìn)行回收。對純化后的PCR產(chǎn)物使用Qubit對文庫進(jìn)行定量，將合格的各上機(jī)測序文庫(Index序列不可重復(fù))梯度稀釋后，根據(jù)所需測序量按相應(yīng)比例混合，并經(jīng)NaOH變性為單鏈進(jìn)行上機(jī)測序，使用NovaSeq測序儀進(jìn)行2×250 bp的雙端測序。

1.3.7 統(tǒng)計分析 通過SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，P<0.05代表具有顯著性差異。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與討論

2.1 LHP-1和LHP-2的組成

由圖1可知，水洗多糖和鹽洗多糖通過葡聚糖凝膠柱洗脫后均得到一個單一的洗脫峰，說明得到了純度較高的均質(zhì)多糖，分別將其命名為LHP-1和LHP-2。

圖1 LHP的DEAE-纖維素柱和Sephadex G-100凝膠柱洗脫曲線Figure 1 Elution profiles of DEAE-cellulose column and Sephadex G-100 gel column for LHP

由表1可知，從紅汁乳菇子實體中提取LHP的得率為6.34%，與LHP相比，LHP-1和LHP-2的得率較低，但中性糖含量較高，分別達(dá)到98.20%和97.32%，而且?guī)缀鯚o蛋白質(zhì)。LHP-1主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其摩爾質(zhì)量比為3.44∶61.10∶1.22。LHP-2主要由甘露糖和葡萄糖組成，其摩爾質(zhì)量比為3.84∶153.00，LHP-2中主要含有葡萄糖，而不含半乳糖，這兩種多糖都可能屬于葡聚糖[22]，該試驗結(jié)果符合食用菌多糖的規(guī)律[23]。

表1 LHP、LHP-1和LHP-2的得率、化學(xué)成分與單糖組成Table 1 Yields,chemical and monosaccharide composition of LHP,LHP-1 and LHP-2

2.2 紅外光譜分析

由圖2可知，3 311，3 346 cm-1附近的強吸收帶歸因于O—H的伸縮振動，2 926，2 927 cm-1附近存在另一個弱峰，表示存在甲基或亞甲基，進(jìn)一步證實這些樣品為多糖。酰胺I帶在1 679，1 631 cm-1附近的強吸收帶有N—H偏差振動，但是強度很弱，證明蛋白質(zhì)較少。此外，1 079，1 078 cm-1處檢測到的峰是由C—O伸縮引起的，1 028，1 031 cm-1處檢測到的峰是由糖苷鍵引起的，843，856 cm-1處的光譜特征表明LHP-1和LHP-2存在β構(gòu)型。

圖2 LHP-1與LHP-2的紅外圖譜Figure 2 Infrared spectra of LHP-1 and LHP-2

2.3 掃描電鏡分析

由圖3可知，LHP-1呈非常均勻的狀態(tài)，且由兩種結(jié)構(gòu)組成：一種類似于神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)，中間是一個平面多邊形的“細(xì)胞體”，細(xì)胞邊緣延伸出幾個“軸突”到4個側(cè)面，稱為“神經(jīng)元”區(qū)域；另一個結(jié)構(gòu)是鏈，符合多糖結(jié)構(gòu)。LHP-2整體看起來比較雜亂，“神經(jīng)元”結(jié)構(gòu)區(qū)和鏈狀結(jié)構(gòu)區(qū)幾乎重疊，層次不清晰，可能與多糖狀態(tài)有關(guān)。LHP-1和LHP-2除了結(jié)構(gòu)均勻性不同外，均有一條粗壯的主鏈，有很多分支，這些分支的末端呈球形，LHP-2的末端小球明顯多于LHP-1。LHP-1的骨架形態(tài)更直，而LHP-2則多呈弧形彎曲。

圖3 LHP-1和LHP-2的掃描電鏡圖Figure 3 SEM images of LHP-1 and LHP-2 (1 000×)

2.4 動物試驗分析

2.4.1 LHP對小鼠體重的影響 由圖4可知，Cont、Ant和Antp組的小鼠體重?zé)o顯著性差異，且最終達(dá)到了相同的水平，說明LHP對小鼠體重?zé)o明顯影響。

圖4 小鼠平均體重變化Figure 4 Average body weight changed of mice

2.4.2 LHP對腸道微生物群落水平的影響 對各試驗組中豐度前20的門進(jìn)行物種注釋，并在菌門水平上分析各試驗組的細(xì)菌群落組成，結(jié)果見圖5。小鼠腸道中豐度高的細(xì)菌包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacteria)。與Cont組相比，干預(yù)第0天，Ant組的擬桿菌門豐度極低，變形菌門豐度較高；干預(yù)第7天，疣微菌門和擬桿菌門豐度顯著增加，而變形菌門豐度急劇下降至與Cont相同的水平，厚壁菌門豐度也減少，藍(lán)細(xì)菌無影響，表明小鼠腸道菌群具有一定的恢復(fù)能力。對于Antp組，疣微菌門豐度隨LHP干預(yù)時間的延長而增加，且顯著高于Cont組；變形菌豐度顯著下降，但仍顯著高于Cont組；擬桿菌豐度隨多糖干預(yù)時間的延長而增加，但干預(yù)第14天仍顯著低于Cont組。

圖5 門水平上的腸道微生物組成Figure 5 Gut microbial composition at the phylum level

由圖6、圖7可知，Cont組的菌群組成基本一致，以腸球菌屬和阿克曼菌屬為主，擬桿菌屬次之。Ant組的菌群組成差異較大，干預(yù)第0～3天，腸球菌屬、短桿菌屬和擬桿菌屬是優(yōu)勢種，干預(yù)第4～14天，腸球菌和短單胞菌豐度減少，而卟啉單胞菌科、阿克曼菌屬和擬桿菌屬是優(yōu)勢種，且干預(yù)第14天，擬桿菌豐度急劇下降，阿克曼菌豐度減少，而變形桿菌數(shù)量顯著增加。Antp組干預(yù)第0天的結(jié)果與Ant組相似，腸球菌在干預(yù)第3天迅速增加并成為優(yōu)勢種，隨后逐漸減少退出優(yōu)勢種群之列，阿克曼菌的豐度隨干預(yù)時間的推移而增加，并顯著高于Cont組。從第14天菌屬組成情況上來看，Ant組細(xì)菌組成與Cont組相似，Antp組細(xì)菌組成及比例與Cont組有顯著差異。

圖6 屬水平上的腸道微生物組成Figure 6 Gut microbial composition at the genus level

圖7 屬相對豐度條形圖Figure 7 Genus relative abundance bar chart

綜上，LHP干預(yù)后使一些有益菌屬增加。阿克曼菌作為一種優(yōu)勢菌，隨干預(yù)時間的推移逐漸增加，最終高于其他組。阿克曼菌具有促進(jìn)免疫、減輕肥胖和抗癌的作用[24]，是主要的丁酸生產(chǎn)者，可預(yù)防多種疾病[25]。擬桿菌屬是另一個優(yōu)勢屬，試驗結(jié)果中超過了Cont組，擬桿菌可以分泌大量的碳水化合物活性酶，碳水化合物的利用能迅速調(diào)整以適應(yīng)各種飲食，此外，擬桿菌屬通過消化多糖為其他細(xì)菌提供合適的多糖，有利于復(fù)雜腸道菌群之間的互利共生[26]。另一方面，腸球菌等有害菌[27]明顯減少，說明LHP具有調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性，維持其穩(wěn)態(tài)的作用，并且具有治療與腸道微生物群失調(diào)相關(guān)的疾病的潛力。

3 結(jié)論

從紅汁乳菇中提取了紅汁乳菇多糖(LHP)，并確定了其純化級分LHP-1和LHP-2的單糖組成、官能團(tuán)和直觀的表面結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，LHP-1主要由甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，其摩爾質(zhì)量比為3.44∶61.10∶1.22，LHP-2主要由甘露糖和葡萄糖組成，其摩爾質(zhì)量比為3.84∶153.00，具有“神經(jīng)元”結(jié)構(gòu)和鏈狀結(jié)構(gòu)區(qū)域。動物試驗表明，小鼠體重在喂食期間無影響，有益菌阿克曼菌和擬桿菌屬數(shù)量增加明顯并超過對照組，說明紅汁乳菇多糖具有調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂以維持體內(nèi)平衡的能力，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。