枸杞低聚糖體外抗氧化活性及增殖益生菌能力研究

劉 昊 崔 波 于 濱

(1. 齊魯工業(yè)大學〔山東省科學院〕生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南 250353;2. 齊魯工業(yè)大學〔山東省科學院〕食品科學與工程學院，山東 濟南 250353)

作為中國傳統(tǒng)的“藥食同源”植物，枸杞中含有豐富的活性物質[1]，其中枸杞多糖具有增強免疫力[2]、抗氧化[3]、平衡腸道菌群[4-5]等生物功能，可有效預防糖尿病等慢性代謝疾病的發(fā)生[6-7]。有學者[8-10]指出，植物多糖所表現(xiàn)出的生理活性與其結構和空間構象密切相關。枸杞多糖分子結構復雜、水溶性差，從而導致其在食品、農業(yè)和醫(yī)藥等領域的應用受到限制。但枸杞多糖降解后得到的低聚糖不僅分子量小、水溶性強，還具有刺激腸道中某些有益菌生長的生理功能[11]。Zhang等[12]研究了枸杞多糖—蛋白質復合物的聚糖部分的體外免疫性能，發(fā)現(xiàn)該部分對脾細胞、T細胞、B細胞和巨噬細胞有免疫刺激作用。Jiang等[13]使用H2O2水解制備了枸杞低聚糖，在100 mg/mL的質量濃度下枸杞低聚糖對羥基自由基清除活性達86.46%。

黃河三角洲區(qū)域內有大面積中低產鹽堿地，生長在此區(qū)域鹽堿地的枸杞整體表現(xiàn)出較強的抗鹽性，如寧夏枸杞和黑果枸杞均為高抗品種[14]。耐鹽堿枸杞不僅在鹽堿地治理方面表現(xiàn)良好[15]，還具有獨特的藥理活性[16]，因此具有很大的研究價值。目前，利用多糖降解的方法制備耐鹽堿枸杞低聚糖，研究其生理活性尚未見諸于報道。

研究擬以黃河三角洲鹽堿地的枸杞作為研究對象，通過酸和酶聯(lián)合降解法制備枸杞低聚糖，分別測定其DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基的清除能力和對腸道益生菌的增殖能力，從而評估低聚糖的體外抗氧化活性和維持腸道菌群平衡的能力，旨在實現(xiàn)黃河三角洲鹽堿地枸杞的高效利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：采摘于黃河三角洲鹽堿地；

枸杞低聚糖(LBO)、枸杞多糖(LBP)：齊魯工業(yè)大學生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室；

抗壞血酸(VC)：上海源葉生物科技有限公司；

2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-二氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)銨鹽(ABTS+)、三氟乙酸(TFA)、石油醚：上海麥克林生化科技有限公司；

氯仿、正丁醇、碳酸鈉(Na2CO3)、水楊酸、過硫酸鉀(K2S2O8)、硫酸亞鐵(FeSO4)、過氧化氫(H2O2)、鐵氰化鉀(K3[Fe(CN)6])、無水乙醇、95%乙醇、磷酸鹽緩沖液(PBS)、三氯乙酸(TCA)、三氯化鐵(FeCl3)、生理鹽水：國藥集團化學試劑有限公司；

Tris-鹽酸緩沖液：Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司；

硫酸(H2SO4)：煙臺遠東精細化工有限公司；

鏈霉蛋白酶(Pronase E)：北京索萊寶科技有限公司；

青春雙歧桿菌(BifidobacteriumadolescentisCGMCC.1.2190)、培養(yǎng)基CM0233：中國共同微生物收集與管理中心；

所有溶劑均為分析純。

1.2 主要儀器設備

分析天平：FA2004型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

小型粉碎機：FSJ-A05N6型，廣東小熊電器有限公司；

離心機：TDL-40B型，上海安亭科學儀器廠；

旋轉蒸發(fā)器：RE2000A型，上海賢德實驗儀器有限公司；

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：DF-101S型，鄭州科泰實驗設備有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HH-21-8型，常州諾基儀器有限公司；

真空冷凍干燥機：JXDG-10型，上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；

渦旋振蕩器：MixTable型，合肥艾本森科學儀器有限公司；

厭氧培養(yǎng)箱：LAI-3T型，上海龍躍儀器設備有限公司；

pH計：FE28型，梅特勒—托力多儀器(上海)有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-6100型，上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的制備 參照Ding等[17]的方法并稍作修改。枸杞洗凈后烘干，用粉碎機粉碎，過篩備用。定量稱取枸杞粉，經石油醚加熱回流重復脫脂3次，烘干，按料液比(m枸杞粉∶V蒸餾水)為1∶3的比例混勻后置于90 ℃水浴提取2 h，過濾，取上清液，以3 000 r/min離心2次，合并上清液。采用旋轉蒸發(fā)器真空濃縮至1/4體積，冷卻至室溫。加入1/5體積Sevag試劑(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，劇烈振搖，使其充分混勻，3 000 r/min離心，傾出上清液，除去中間變性蛋白和下層氯仿，重復以上操作直至中間層無變性蛋白，收集上清液加入4倍體積的95%乙醇沉淀，靜置24 h，濾布過濾，冷凍干燥后得到枸杞多糖(LBP)。

1.3.2 枸杞低聚糖的制備 參照Zhang等[12]的方法并稍作修改。定量稱取LBP、Pronase E (mLBP∶mPronase E=1∶2)，加入0.1 mol/L的Tris-鹽酸緩沖液混合均勻，將混合液置于60 ℃水浴體系中以滅活可能存在的酶。根據原始LBO樣品的重量，依次向樣品體系液中加入1.0% 和0.5%(質量分數(shù))的Pronase E，體系pH調至8.0左右，室溫下消化24～48 h。消化結束后對所得樣品體系依次進行Sephadex G-100純化和Sephadex G-25除鹽，取部分樣品加入40 mmol/L H2SO4，80 ℃攪拌反應，10 h后取樣，滴加0.25 mol/L Na2CO3溶液對反應進行中和，然后用蒸餾水透析72 h，收集袋內濃縮液，加入0.5 mol/L TFA，80 ℃反應4 h，蒸餾水濃縮數(shù)次，直至濃縮液pH為中性，冷凍干燥后得到枸杞低聚糖(LBO)。

1.3.3 DPPH自由基清除能力測定 參照文獻[18]并稍作修改，定量稱取LBO，分別配制成質量濃度為0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的待測溶液，每次測定均取LBO溶液2 mL，加入同等體積的0.08 mmol/L DPPH溶液，充分振蕩，避光于室溫下反應30 min，反應結束后測定517 nm處的吸光度。用無水乙醇設置空白對照。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

P——自由基清除率，%；

A0——空白溶液的吸光度；

A1——樣品溶液的吸光度。

1.3.4 ABTS自由基清除能力測定 參照文獻[19]并稍作修改。按照1.3.2中的方法配制LBO樣品待測液。ABTS+工作液配制方法：等體積混合現(xiàn)配制的7.4 mmol/L ABTS+溶液及2.6 mmol/L K2S2O8溶液，置于2～6 ℃下避光12 h后備用。每次試驗開始前，用0.2 mol/L，pH=7.4的PBS溶液對ABTS+工作液進行稀釋處理，將734 nm吸光度控制在(0.70±0.02)方可使用。取LBO溶液1 mL，加入2倍體積的ABTS+工作液，充分振蕩，避光于室溫下反應6 min，反應結束后測定734 nm處的吸光度。用蒸餾水設置空白對照。按式(1)計算ABTS自由基清除率。

1.3.5 羥基自由基清除能力測定 參照文獻[20]并稍作修改。按照1.3.2中的方法配制LBO樣品待測液，分別取LBO待測溶液1 mL，先后加入同等體積的9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L的水楊酸—乙醇溶液和8.8 mmol/L 的H2O2溶液，充分振蕩，避光于室溫下水浴30 min，反應結束后測定510 nm處的吸光度。用蒸餾水設置空白對照。按式(1)計算羥基自由基清除率。

1.3.6 總還原能力測定 參照文獻[21]并稍作修改。按照1.3.2中的方法配制LBO樣品待測液，分別取不同濃度的LBO溶液1 mL，先后加入1 mL 0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 6.6)和0.125 mL 體積分數(shù)為1%的K3[Fe(CN)6] 溶液，充分震蕩，避光于50 ℃下水浴20 min后，先后加入體積分數(shù)為10%的TCA和0.1%的FeCl3溶液以終止反應，充分振蕩，測定700 nm處的吸光度。用蒸餾水設置空白對照。

1.3.7 對益生菌的增殖效應

(1) 菌種的活化：試驗在無菌環(huán)境下進行，定量稱取少量青春雙歧桿菌制劑膠囊中的凍干菌粉，加入無菌生理鹽水，重懸菌體。以0.1%的接菌量接種于10 mL活化培養(yǎng)基中，振蕩均勻，37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，進行2次傳代，重懸菌體并進行接種，18 h后得菌種母液。

(2) 生長曲線的測定：參照文獻[22]并稍作修改。以相同質量濃度的LBO代替基礎培養(yǎng)基中的葡萄糖作為試驗培養(yǎng)基，113 ℃濕熱滅菌20 min，取菌種母液以0.1% 的接菌量接種于試驗培養(yǎng)基中。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，分別在第0，2，4，6，8，10，12，16，18，20，24，48 h時取樣，測定600 nm處的菌體濃度和pH值。同時以LBP代替相同體積的葡萄糖作為對照組以培養(yǎng)時間和對應的OD600 nm吸光度繪得生長曲線。

1.4 數(shù)據統(tǒng)計分析

所有試驗均重復3次，數(shù)據以平均值±標準誤差表示。數(shù)據采用Excel 2010進行統(tǒng)計分析，SPSS 20.0軟件進行處理，并用Origin Pro 8.5進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種含有單一電子的含氮有機自由基，它會使乙醇溶液呈現(xiàn)較深的暗紫色，在517 nm波長處表現(xiàn)出明顯的吸收峰[23]?？寡趸瘎┑募尤肽軌蚺cDPPH自由基相結合，溶液的顏色則會由最初的紫色向黃色發(fā)生明顯的變化，抗氧化劑的DPPH自由基清除能力可以通過紫外光吸收的弱化程度來判定，通常DPPH自由基清除率與氧化劑的抗氧化能力呈正比。由圖1可知，LBO有一定的DPPH自由基清除能力，LBO的抗氧化能力隨LBO濃度先升高后下降。就平均抗氧化能力而言，LBO抗氧化水平不及LBP和VC。綜上，過高濃度的LBO不易向DPPH自由基提供電子或者質子，與DPPH自由基的結合率降低。

圖1 不同質量濃度LBO的DPPH自由基清除能力Figure 1 DPPH radical scavenging ability of LBO with different mass concentrations

2.2 ABTS自由基清除能力

ABTS+溶劑本身呈現(xiàn)藍綠色，在734 nm處有明顯的吸收峰?？寡趸瘎┑募尤霑笰BTS+在此波長處的吸光度降低，同時，溶劑的藍綠色會明顯褪去，褪色程度越高，則表示氧化劑的抗氧化性越強[24]。由圖2可知，在0.1～1.0 mg/mL質量濃度范圍內，ABTS自由基清除率隨著LBO質量濃度增加而升高，當LBO的質量濃度為2.0 mg/mL時，ABTS自由基清除率最高，達(99.93±0.05)%，此后ABTS自由基清除率維持在最高值左右。LBP的ABTS自由基清除率達到最高值后隨著LBP質量濃度的增加而略微下降，這一現(xiàn)象可能與多糖分子量大小和聚合度相關，LBO表現(xiàn)出比LBP更穩(wěn)定的抗氧化性。

圖2 不同質量濃度LBO的ABTS自由基清除能力Figure 2 ABTS+ scavenging capacity of LBO with different mass concentrations

2.3 清除羥基自由基的能力

羥基自由基是人體中自由基的主要來源，由多態(tài)性反應產生。過量的羥基自由基會對體內的生物大分子造成損害[25]。清除羥基自由基是抗氧化防護過程中極其重要的一環(huán)。由圖3可知，LBO有顯著的羥基自由基清除能力，隨著LBO質量濃度的升高其清除羥基自由基的能力增強，當質量濃度為2 mg/mL時，LBO和LBP的羥基自由基清除率均達到最高值，但低于VC對羥基自由基的清除率。這3種物質抗氧化性的大小順序為：VC>LBO>LBP。

圖3 不同質量濃度LBO的羥基自由基清除能力Figure 3 Hydroxyl radical scavenging ability of LBO with different mass concentrations

2.4 總還原能力

抗氧化劑的總還原能力是衡量機體抗氧化性能的一項重要指標。K3Fe(CN)6能夠被抗氧化劑還原成K4Fe(CN)6，使之與Fe3+發(fā)生反應得到普魯士藍，并在700 nm處出現(xiàn)了強吸收峰，通過吸光度可以測定出Fe3+被還原成Fe2+的程度，從而根據最終產物生成量來判斷抗氧化劑的抗氧化能力[26]。由圖4可知，VC的總還原能力與其質量濃度呈正相關，與VC還原力相比，LBO與LBP整體的總還原力較低，最大總還原力基本達到VC的25%。當LBO的質量濃度為0.1～0.5 mg/mL時，總還原力隨其濃度的增加而上升，繼續(xù)增加質量濃度還原力不再升高。當樣品質量濃度為3.0 mg/mL時，LBO與LBP的總還原力相當，吸光度為(0.191±0.010)。

圖4 LBO的總還原力評價Figure 4 Evaluation of total reducing activity of LBO

2.5 LBO對益生菌的增殖效應

由圖5可知，在相同的質量濃度下，LBO比LBP更有利于青春雙歧桿菌的增殖。雙歧桿菌經LBO培養(yǎng)6 h后進入對數(shù)生長期，在此期間雙歧桿菌迅速繁殖。而葡萄糖培養(yǎng)基中雙歧桿菌停滯期較長，培養(yǎng)10 h后才進入對數(shù)生長期。培養(yǎng)18 h后，葡萄糖培養(yǎng)基的雙歧桿菌生長達到穩(wěn)定期，6 h后LBO培養(yǎng)基的菌體也進入穩(wěn)定期。此后菌體進入衰亡期，菌體濃度不再變化。結果表明，LBO培養(yǎng)基的雙歧桿菌進入對數(shù)期速率比LBP和葡萄糖培養(yǎng)基中的雙歧桿菌快，并且最終LBO培養(yǎng)基的菌體濃度比LBP培養(yǎng)基的高。LBP與空白的培養(yǎng)基相比，雙歧桿菌的生長速率更高，傳代時間更短。此外，由圖6可知，除空白組外，其他3組菌液pH值均呈顯著下降趨勢，且隨著雙歧桿菌菌體濃度的提高，pH值不斷降低，在培養(yǎng)16 h后pH值趨于穩(wěn)定。培養(yǎng)2 h后，LBO與葡萄糖培養(yǎng)基菌液的pH值下降速度最快，可能是由于雙歧桿菌在LBO培養(yǎng)基中進行增殖代謝，產生了短鏈脂肪酸，在這一時期內產酸量要高于以LBP和無碳源的基礎培養(yǎng)基，這與OD值相對應，表明LBO可促進雙歧桿菌較快進入對數(shù)生長期，表現(xiàn)出較好的增殖效應。

圖5 青春雙歧桿菌生長曲線Figure 5 Growth curve of Bifidobacterium adolescentis

圖6 青春雙歧桿菌生長過程中pH的變化Figure 6 Changes of pH during the growth of Bifidobacterium adolescentis

3 結論

研究表明枸杞低聚糖有較強的DPPH自由基、ABTS自由基、羥基自由基清除能力和總還原力，由此可知枸杞低聚糖具有良好的體外抗氧化活性。同時，以青春雙歧桿菌益生菌作為考察對象，發(fā)現(xiàn)枸杞低聚糖能促進青春雙歧桿菌益生菌增殖。基于上述研究結果，從飲食營養(yǎng)干預的角度考慮，枸杞低聚糖有助于提高機體的抗氧化和抗炎能力，這為其發(fā)展成為功能性食品提供了重要的理論依據，有助于研究者更好地發(fā)掘黃河三角洲鹽堿地枸杞的利用價值和經濟效益。后續(xù)可進一步通過動物試驗探究枸杞低聚糖對機體內部的作用機理及干預路徑。