QuEChERs-同位素內(nèi)標(biāo)—氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定茶葉中4種糠醛類物質(zhì)

劉粲迪 陳 波 尹芳平 曾 輝

(1. 化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點實驗室，湖南 長沙 410081；2. 植化單體開發(fā)與利用湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410081；3. 湖南師范大學(xué)，湖南 長沙 410081；4. 長沙市食品藥品檢驗所，湖南 長沙 410016；5. 國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心〔湖南〕，湖南 長沙 410016)

糠醛、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛和2-乙酰呋喃均為糠醛類化合物，屬于具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)，廣泛存在于各類食品當(dāng)中[1]?？啡╊愇镔|(zhì)的生成途徑主要有兩條：① 葡萄糖、果糖在酸性條件下脫水生成5-羥甲基糠醛，其經(jīng)過水解生成各糠醛類物質(zhì)，即糖的熱降解反應(yīng)；② 氨基化合物與羰基化合物之間發(fā)生的非酶促反應(yīng)(美拉德反應(yīng))，即還原糖的羰基和氨基酸中的自由基縮合生成席夫堿，后經(jīng)重排生成Amadori產(chǎn)物，再生成5-羥甲基糠醛，后轉(zhuǎn)化為糠醛類物質(zhì)[2-3]。5-羥甲基糠醛有一定神經(jīng)毒性，經(jīng)呼吸道或皮膚途徑可被人體吸收，對呼吸道、皮膚、黏膜等具有刺激性，對人體內(nèi)臟會產(chǎn)生損害，過量攝入甚至可能致癌變[4]。

茶葉，由茶樹的葉或芽加工而成，富含糖類、黃酮類、氨基酸等多種化學(xué)成分[5-6]，部分化學(xué)成分使得茶葉具有延緩衰老、抗氧化、降血脂等保健作用[7-9]。茶葉品種繁多，分類方法也很多，如按照發(fā)酵程度不同可以分為非發(fā)酵茶、部分發(fā)酵茶、完全發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶，分類區(qū)別在于其有著不同的加工方法，而熱處理是茶葉加工中必不可少的環(huán)節(jié)之一，因此伴隨著不同程度的美拉德反應(yīng)發(fā)生，能給茶葉帶來獨特的香氣和滋味，生成糠醛類物質(zhì)；茶葉中含有的糖類成分較多[10]，在生產(chǎn)與貯藏環(huán)節(jié)中發(fā)生糖的熱降解反應(yīng)也可能產(chǎn)生糠醛類物質(zhì)。目前僅有GH/T 18796—2012《蜂蜜》規(guī)定蜂蜜中5-羥甲基糠醛的限量為40 mg/kg，其他產(chǎn)品包括茶葉對糠醛類物質(zhì)均無限量要求[11]，對茶葉中糠醛類物質(zhì)的已有研究也較少，鑒于糠醛類物質(zhì)對人體的毒性作用及其在茶葉中的存在情況，研究建立一種能快速準(zhǔn)確地測定茶葉中糠醛類物質(zhì)的分析方法十分必要。

糠醛類物質(zhì)的檢測方法主要有高效液相色譜法[12]、氣相色譜法[13]、氣相色譜—質(zhì)譜法[3]和高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[14]。由于糠醛類物質(zhì)檢測波長較小，茶葉基質(zhì)中有較多物質(zhì)在低波長下有吸收，采用HPLC法時基線干擾較大；GC的靈敏度較低，特異性不高，難以滿足茶葉中的糠醛類物質(zhì)檢測要求；部分糠醛物質(zhì)極性較低，在HPLC-MS/MS法常用的ESI源下較難離子化，需采用靈敏度較高、特異性強的GC-MS/MS法進行檢測。由于茶葉基質(zhì)較復(fù)雜，前處理方法選擇很關(guān)鍵。茶葉基質(zhì)常用的前處理方法有固相萃取法[15]、液液萃取法[16]、基質(zhì)分散萃取法[17]等，這些方法通常需要進行多次凈化處理，操作較為繁瑣、耗時且成本較為高昂。QuEChERs法是結(jié)合了固相萃取及基質(zhì)固相分散的一種新型前處理方法，該法通常使用乙腈或酸化乙腈作為溶劑進行提取，加入除水試劑(無水硫酸鎂等)進行除水，再用一定量的N-丙基乙二胺、石墨化炭黑和十八烷基硅烷等將提取液進一步凈化，除去提取液中的共萃基質(zhì)如糖類、色素、蛋白質(zhì)等，減少基質(zhì)效應(yīng)的作用[18]。研究擬根據(jù)糠醛類物質(zhì)的理化性質(zhì)，以乙腈提取茶葉樣品，使用十八烷基硅烷及石墨化炭黑進行QuEChERs法凈化后，采用同位素內(nèi)標(biāo)-GC-MS/MS法對茶葉中的糠醛類物質(zhì)進行分析檢測，建立一種測定茶葉中糠醛類物質(zhì)的分析方法，以期為茶葉中糠醛類物質(zhì)含量測定及質(zhì)量監(jiān)控提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

糠醛、2-乙酰呋喃：純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

糠醛-D4：純度≥99.8%，北京振翔科技有限公司；

5-甲基糠醛：純度≥98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

5-羥甲基糠醛：純度≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

石墨化炭黑(Carb)、十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)：上海迪馬科技有限公司；

無水硫酸鎂：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

乙腈、甲醇：色譜級，德國默克公司；

茶葉樣品：共52種，生產(chǎn)日期大多數(shù)在2020年9月，按茶葉品種分類有綠茶、紅茶、黃茶、白茶、烏龍茶、黑茶6種，涵蓋了不發(fā)酵茶、部分發(fā)酵茶、完全發(fā)酵茶和后發(fā)酵茶，網(wǎng)購。

1.1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-TQ8050NX型，日本島津公司；

圓周振蕩器：IKA MS3型，德國艾卡公司；

超純水儀：Milli-Q型，德國默克密理博公司；

超聲波清洗器：AS3120型，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；

十萬分之一天平：X205DU型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易有限公司；

振蕩器：EDAA-HM-01型，上海安譜實驗科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用分析天平分別準(zhǔn)確稱取5-羥甲基糠醛、糠醛、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃各20.00 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容，分別得到1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。用移液管分別移取400 μL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液至20 mL容量瓶，以乙腈定容，配制得到質(zhì)量濃度為20 μg/mL的中間混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用分析天平準(zhǔn)確稱取糠醛-D415.00 mg于20 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到質(zhì)量濃度為750 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-20 ℃冰箱保存。用移液管移取200 μL上述溶液至20 mL容量瓶，用乙腈(色譜級)定容，得到質(zhì)量濃度為7.5 μg/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

將中間混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用乙腈進行稀釋，配制成1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，每個梯度濃度含有12 μg/L的糠醛-D4溶液作為內(nèi)標(biāo)。

將中間混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用處理后的茶葉樣品溶液進行稀釋(樣品處理方法見1.2.2)，配制成1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L的基質(zhì)配標(biāo)系列溶液。

1.2.2 樣品前處理 將所有茶葉樣品用粉碎機粉碎后，過篩，稱取2 g樣品粉末于50 mL離心管內(nèi)，加入40 μL 7.5 mg/mL糠醛-D4溶液，加入25 mL乙腈，于搖床上2 500 r/min 震蕩3 min，于超聲波清洗器中500 W功率超聲30 min，靜置1 min后取上清液1 mL至10 mL 塑料離心管中(管內(nèi)裝有50 mg C18，20 mg Carb)，渦旋2 min后，10 000 r/min離心5 min，取上清液過0.22 μm有機相濾膜后，待測。

1.2.3 GC-MS/MS分析

(1) 氣相條件：色譜柱為Shimadzu SH-RTX-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱；載氣He(99.999%)，碰撞氣Ar；進樣口溫度250 ℃，不分流進樣；線速度控制，柱流量1.00 mL/min。程序升溫程序：初始柱溫箱溫度50 ℃，保持2 min，以15 ℃/min升至230 ℃，保持10 min。

(2) 質(zhì)譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，檢測器電壓1.4 kV，溶劑延遲時間3.5 min；多反應(yīng)檢測模式(MRM)。取2 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 μL注入氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析，得到目標(biāo)物質(zhì)譜圖。進行MRM參數(shù)自動優(yōu)化，得到目標(biāo)分析物選擇的母離子、子離子、碰撞能量及對應(yīng)的保留時間。

位于郝關(guān)與同口之間，口門長500m。閘基高程2～8.5m主要為第②層壤土、第②2層砂壤土。壤土具有中等壓縮性，微弱透水性，強度較高，構(gòu)成地基主要持力層；高程2m以下為第③壤土，含大量腐殖質(zhì)和貝殼、螺殼碎屑，局部呈淤泥質(zhì)，工程性質(zhì)相對較差。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗條件的優(yōu)化

2.1.1 樣品前處理條件的優(yōu)化 茶葉的基質(zhì)非常復(fù)雜，含有色素、礦物質(zhì)、糖類物質(zhì)等。QuEChERs法是最常用的凈化手段之一[19]，選用合適的吸附鹽配比能有效降低茶葉中的雜質(zhì)干擾。該法常用的吸附鹽有十八烷基硅烷(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(Carb)和無水硫酸鎂。C18屬于非極性吸附劑，可以吸附極性化合物中的非極性化合物，如一些長鏈的脂肪類化合物；PSA有一定的極性相互作用和陰離子交換作用，可以去除非極性化合物中的極性化合物，如一些脂肪酸、有機酸類；Carb主要用來除去待測樣品中的色素；無水硫酸鎂主要用來除去樣品基質(zhì)中的水分。以不同配比的C18+PSA組合萃取鹽對100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進行處理后進樣分析，對比未經(jīng)過處理的100 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以期考察各萃取鹽對目標(biāo)物是否有吸附，其回收率見表1。

由表1可知，PSA對糠醛、5-甲基糠醛和5-羥甲基糠醛有較高的吸附，導(dǎo)致回收率偏低，而C18對目標(biāo)物均無吸附，各目標(biāo)物的回收率接近100%，故選擇50 mg C18作為QuEChERs吸附鹽之一，設(shè)計C18及Carb的配比組合，按同樣方法進行試驗，結(jié)果見表2。

表1 C18與PSA配比對4種糠醛類物質(zhì)回收率的影響Table 1 Recovery results of four furfurals under different ratios of C18 and PSA %

由表2可知，隨著Carb用量增加，目標(biāo)物的回收率逐漸降低，尤其是對5-羥甲基糠醛的回收率影響較大，當(dāng)采用50 mg C18+30 mg Carb時，其回收率僅為73.29%。

表2 C18與Carb配比對4種糠醛類物質(zhì)回收率的影響Table 2 Recovery results of four furfurals under C18 and different amounts of Carb %

但是Carb萃取鹽有良好的除色素能力，綜合考慮回收率和除雜能力，選擇50 mg C18+20 mg Carb的組合萃取鹽。

此外，為考察無水硫酸鎂對目標(biāo)物回收率的影響，在實際茶葉樣品中加入50 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，后經(jīng)過QuEChERs處理后進行分析。結(jié)果表明，無水硫酸鎂添加與否并不影響目標(biāo)物的回收率。為簡化試驗步驟和節(jié)約成本，選擇50 mg C18+20 mg Carb作為QuEChERs用萃取鹽。

2.1.2 氣相色譜柱的選擇 分別選擇了SH-I-5SiL、SH-Rtx-wax、InertCap 1701MS 3種不同極性的色譜柱進行對比。結(jié)果表明，SH-I-5SiL、InertCap 1701MS色譜柱在相同的氣相條件下，5種目標(biāo)物的保留時間較短，可以在一定程度上減少分析時間，但由于5-羥甲基糠醛的極性較大，在這兩款色譜柱上拖尾較嚴(yán)重，無法準(zhǔn)確定量。而采用SH-Rtx-wax柱進行分析時，5-羥甲基糠醛色譜峰形尖銳，拖尾因子更接近于1(見表3)，其余4種目標(biāo)物色譜峰形均較好。因此，選擇SH-Rtx-wax柱來分離分析糠醛類物質(zhì)，5種物質(zhì)在SH-Rtx-wax柱上的MRM色譜圖見圖1。

圖1 5種物質(zhì)在Wax柱上的TIC圖Figure 1 TIC diagram on wax column of 5 substances

表3 3種氣相色譜柱的柱性能表(5-羥甲基糠醛)Table 3 Column performance three gas chromatographic columns (5-hydroxymethylfurfural)

2.1.3 GC-MS/MS條件的優(yōu)化 通過進單一標(biāo)準(zhǔn)品確定糠醛、糠醛-D4、5-甲基糠醛、2-乙酰呋喃、5-羥甲基糠醛的質(zhì)譜圖及出峰順序。根據(jù)質(zhì)譜圖的相對豐度大小，選取目標(biāo)化合物的母離子，取2 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 μL 注入氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析掃描，并以5 V 為間隔，在5～45 V的范圍內(nèi)優(yōu)化碰撞能量，得到最佳的離子對作為定量離子對，優(yōu)化后的MRM參數(shù)見表4。5種物質(zhì)的質(zhì)譜圖見圖2～圖6。

圖2 糠醛的質(zhì)譜圖Figure 2 Mass spectrum of furfural

圖3 糠醛-D4的質(zhì)譜圖Figure 3 Mass spectrum of furfural-D4

圖4 2-乙酰呋喃的質(zhì)譜圖Figure 4 Mass spectrum of 2-acetylfuran

圖5 5-甲基糠醛的質(zhì)譜圖Figure 5 Mass spectrum of 5-methylfurfural

圖6 5-羥甲基糠醛的質(zhì)譜圖Figure 6 Mass spectrum of 5-hydroxymethyl furfural

表4 5種目標(biāo)物的MRM參數(shù)Table 4 MRM parameters of 5 targets

2.2 基質(zhì)效應(yīng)的考察

基質(zhì)效應(yīng)普遍存在于化學(xué)分析中，忽略基質(zhì)效應(yīng)的影響可能會導(dǎo)致樣品測定得到的含量水平與真實值存在很大的偏差。常規(guī)的基質(zhì)效應(yīng)消除方法有兩種：① 通過配制基質(zhì)匹配線性標(biāo)準(zhǔn)溶液來對目標(biāo)物進行定量；② 通過加入已知量的標(biāo)準(zhǔn)品至樣品提取液中，利用待測目標(biāo)物和標(biāo)準(zhǔn)品響應(yīng)的比值進行定量[20]11-12。基質(zhì)效應(yīng)的計算公式如下：

(1)

M——基質(zhì)效應(yīng)的大?。?/p>

KM——基質(zhì)配標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率；

KS——溶劑配標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的斜率。

當(dāng)M的絕對值為0%～25%時，說明待測目標(biāo)物在樣品中有弱基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)M的絕對值為25%～50%時，說明待測目標(biāo)物具有中等基質(zhì)效應(yīng)，當(dāng)M的絕對值大于50%時，說明待測目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)比較顯著[20]9-10。通過建立基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、標(biāo)準(zhǔn)溶液線性標(biāo)準(zhǔn)方程，計算M來評估4種糠醛類物質(zhì)在茶葉基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果表明，糠醛、2-乙酰呋喃、5-羥甲基糠醛在茶葉溶液中具有弱基質(zhì)效應(yīng)，5-甲基糠醛在茶葉溶液中有較強的基質(zhì)效應(yīng)。采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液操作相對較復(fù)雜，為了得到可靠的結(jié)果，采用糠醛-D4作為內(nèi)標(biāo)物，使用內(nèi)標(biāo)法進行定量。

2.3 檢測限和定量限

將5 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，取稀釋后的溶液注入氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，以信噪比(S/N)≥3為檢出限，信噪比(S/N)≥10為定量限，得出方法的檢出限為1 μg/kg (n=3)，定量限為4.125 μg/kg (n=3)。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

配制1.25，2.50，5.00，10.00，20.00，50.00，200.00 μg/L系列質(zhì)量濃度的糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(每個質(zhì)量濃度點含有12 μg/L的糠醛-D4作為內(nèi)標(biāo))進行測定，以質(zhì)量濃度比(目標(biāo)物/內(nèi)標(biāo))為橫坐標(biāo)，以峰面積比(目標(biāo)物/內(nèi)標(biāo))為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，4種目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物的總離子流圖見圖1。4種糠醛類物質(zhì)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表5。

表5 4種糠醛類物質(zhì)的線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 5 Linear range,linear regression equation and correlation coefficient of four furfural compounds

2.5 回收率與精密度

稱取21份茶葉樣品，其中18份分別添加低、中、高3個濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，另外3份樣品不添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗方法處理后同時測定糠醛類物質(zhì)的含量，結(jié)果見表6。由表6可知，測得回收率范圍在89.10%～113.02%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在10%以內(nèi)，方法的準(zhǔn)確度與精密度符合檢測要求[21]。

表6 4種糠醛類物質(zhì)低、中、高3水平加標(biāo)回收率及RSDTable 6 Recoveries and RSD of four furfurals at low,medium and high levels (n=6)

以高水平加標(biāo)樣品溶液為考察對象，在進行加標(biāo)處理后的0，2，4，8，12，24 h分別進樣，考察方法的日內(nèi)精密度，連續(xù)3 d進樣考察日間精密度，結(jié)果見表7。結(jié)果表明，方法的日內(nèi)精密度和日間精密度均小于12%，符合檢測的要求。

表7 4種糠醛類物質(zhì)的日內(nèi)精密度和日間精密度Table 7 Diurnal and diurnal precision of four furfural comounds %

2.6 實際樣品的測定

采用試驗建立的QuEChERs-同位素內(nèi)標(biāo)—氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法對收集到的52種茶葉樣品進行分析，結(jié)果表明，大部分茶葉樣品中均檢出糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛。大部分茶葉中糠醛類物質(zhì)含量小于0.10 mg/kg，少部分茶葉的糠醛類物質(zhì)含量分布在0.10～1.25 mg/kg，5-羥甲基糠醛含量在糠醛類物質(zhì)中相對較高，部分含量超過了1.25 mg/kg，最高的檢出值達到了6.44 mg/kg，為一種烏龍茶。結(jié)果表明，糠醛類物質(zhì)在茶葉中可檢出，可能存在一定的安全隱患。

表8 茶葉樣品中4種糠醛類物質(zhì)的檢出量分布范圍Table 8 Detection amount and distribution range of four furfurals in tea samples

3 結(jié)論

通過對質(zhì)譜參數(shù)、氣相色譜條件、前處理方法的優(yōu)化，建立了一種QuEChERs-同位素內(nèi)標(biāo)-GC-MS/MS法檢測茶葉中的糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛4種糠醛類物質(zhì)的分析方法。方法在1.25～200.00 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系(R2≥0.999 0)；該方法加標(biāo)樣品的回收率為89.10%～113.02%，準(zhǔn)確度高。采用該方法對收集的茶葉樣品進行測定，大部分茶葉樣品中均檢出糠醛、2-乙酰呋喃、5-甲基糠醛、5-羥甲基糠醛4種糠醛類物質(zhì)，其中5-羥甲基糠醛的含量相對較高，最高的檢出值達到了6.44 mg/kg，可能存在一定的安全風(fēng)險，應(yīng)引起人們的關(guān)注。