淀粉酶鏈霉菌幾丁質(zhì)酶克隆表達(dá)及催化功能分析

李 芹 王立梅 齊 斌,

(1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2. 常熟理工學(xué)院蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500)

幾丁質(zhì)是一種天然堿性線性多糖，其結(jié)構(gòu)由多個(gè)N-乙酰-D葡萄糖胺通過β-1，4糖苷鍵連接組成，是來自甲殼動(dòng)物的外骨骼以及真菌和昆蟲細(xì)胞壁的第二個(gè)最豐富的天然生物聚合物[1]。其年生物合成量約為1 000億t，降解產(chǎn)物中的幾丁寡糖、殼低聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖被廣泛應(yīng)用于食品、紡織、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，具有普遍的生物活性和廣闊的市場(chǎng)開發(fā)前景[2]。幾丁寡糖是由幾丁質(zhì)或殼聚糖降解獲得的水溶性物質(zhì)，聚合度為2～20，是目前自然界中唯一帶正電的堿性氨基酸寡糖[3]，具有良好的水溶性、抗氧化和抗腫瘤活性[4]。目前，制備幾丁寡糖的方法包括化學(xué)和物理降解、酶催化水解[5]和轉(zhuǎn)糖基化介導(dǎo)的合成[6]。大多數(shù)幾丁寡糖是通過化學(xué)方法生產(chǎn)的，主要使用酸或氧化劑來降解幾丁質(zhì)[7]，該方法會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)[8]。轉(zhuǎn)糖基化介導(dǎo)的幾丁寡糖合成是幾丁寡糖酶促生產(chǎn)的新方法，該反應(yīng)取決于在供體和受體糖之間引入新的糖苷鍵[9]。據(jù)報(bào)道[10-12]，只有少數(shù)GH18幾丁質(zhì)酶具有轉(zhuǎn)糖基化(TG)活性。酶催化因具有反應(yīng)條件溫和、酶促副反應(yīng)少、產(chǎn)品安全性高、無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，將逐步取代傳統(tǒng)的酸性或氧化降解方法[13]。因此，利用幾丁質(zhì)酶降解法降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)幾丁寡糖的研究較多[14-15]。

幾丁質(zhì)酶是一類可以催化幾丁質(zhì)并將其專一性降解為幾丁寡糖、殼聚糖和N-乙酰葡萄糖胺的糖苷鍵水解酶[16]。然而，目前產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性高、用于工業(yè)化生產(chǎn)幾丁寡糖的菌株極少，只有少數(shù)黏質(zhì)沙雷氏菌和木霉菌等。張博陽(yáng)等[17]對(duì)桑氏鏈霉菌幾丁質(zhì)酶基因ChiKJ40進(jìn)行克隆表達(dá)，得到幾丁質(zhì)酶活性為0.080 U/mL。Li等[18]采用PCR方法對(duì)Streptomycessampsonii(Millard&Burr)Waksman KJ40的幾丁質(zhì)酶基因ChiKJ406136進(jìn)行克隆并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，其粗蛋白質(zhì)和純化蛋白質(zhì)溶液中的幾丁質(zhì)酶活性僅為0.045，0.033 U/mL。研究擬對(duì)淀粉酶鏈霉菌CS1801幾丁質(zhì)酶PROKKA01070基因在大腸桿菌中進(jìn)行克隆，通過原核表達(dá)系統(tǒng)獲得可溶性幾丁質(zhì)酶，對(duì)其活性進(jìn)行探究，結(jié)合同源建模、催化域氨基酸比對(duì)及其催化域關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)突變，驗(yàn)證其活性口袋內(nèi)部關(guān)鍵氨基酸的功能，揭示這些氨基酸殘基在酶催化中的作用，為該菌的后續(xù)深入研究及工業(yè)生產(chǎn)幾丁寡糖提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

淀粉酶鏈霉菌(Streptomycesdiastaticus)CS1801：由實(shí)驗(yàn)室從蝦醬中篩選得到；

大腸桿菌Top10感受態(tài)、大腸桿菌BL21(DE3)、細(xì)菌DNA抽提試劑盒、高GC含量PCR擴(kuò)增試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、定點(diǎn)突變?cè)噭┖?、氨芐青霉素鈉：生工生物工程(上海)股份有限公司；

PMD-19T載體基因克隆試劑盒以及限制性內(nèi)切酶(EcoRⅠ和XhoⅠ)：寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；

pET-32a(+)載體：南通柯侎克生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

全溫振蕩培養(yǎng)箱：ZQZY-CF型，上海知楚儀器有限公司；

微孔板分光光度計(jì)：XMARK型，美國(guó)Bio-Rad公司；

恒溫培養(yǎng)箱：GHP-9270型，上海索普儀器有限公司；

電子天平：XS105DU型，瑞士Mettler Toledo公司；

高速臺(tái)式離心機(jī)：Legend Micro 17R型，德國(guó)Thermo公司；

高速冷凍離心機(jī)：CR22GⅡ型，日本Hitachi公司；

垂直電泳系統(tǒng)：proteanⅡ型，美國(guó)Bio-Rad公司；

PCR基因擴(kuò)增儀：My Cycler型，美國(guó)Bio-Rad公司；

瓊脂糖水平電泳槽：DYCP-31BN型，美國(guó)Bio-Rad公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Gel Doc X型，美國(guó)Bio-Rad公司；

核酸濃度測(cè)定儀：NanoDrop 2000型，德國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體幾丁質(zhì)制備 稱取10 g幾丁質(zhì)粉末，加至200 mL濃鹽酸中，均勻攪拌至全部溶解，過濾，加入1 000 mL 蒸餾水，離心，用蒸餾水洗沉淀至中性，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 幾丁質(zhì)酶ChiA基因擴(kuò)增和克隆 根據(jù)細(xì)菌DNA提取試劑盒提取淀粉酶鏈霉菌CS1801(StreptomycesdiastaticusCS1801)基因組DNA。根據(jù)已獲得的淀粉酶鏈霉菌全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)信息中，幾丁質(zhì)酶PROKKA01070基因序列用Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)兩條引物，在兩條引物的5’端分別引入酶切位點(diǎn)，如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

去除幾丁質(zhì)酶PROKKA01070基因序列的信號(hào)肽，PCR擴(kuò)增目的基因片段，PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 30 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR結(jié)果，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體通過T4連接酶16 ℃連接過夜后轉(zhuǎn)化至Top10感受態(tài)細(xì)胞中并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑選白色單克隆菌落進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，將鑒定為陽(yáng)性的重組菌株送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 將測(cè)序正確的ChiA/pMD19-T質(zhì)粒與表達(dá)載體pET-32a(+)分別用EcoRⅠ酶和XhoⅠ酶雙酶切。驗(yàn)證酶切產(chǎn)物后，切膠回收質(zhì)粒和基因片段。酶切的ChiA基因片段用T4連接酶與酶切的pET-32a(+)連接。轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定后，獲得的陽(yáng)性重組菌ChiA/pET-32a(+)/Top10送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 重組幾丁質(zhì)酶SDS-PAGE分析 將測(cè)序正確的ChiA/pET-32a(+)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取陽(yáng)性克隆于50 mL含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。按2%接種量接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8，用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16 ℃誘導(dǎo)24 h。收集菌體，按1 g/5 mL加入裂解液，加入溶菌酶1 mg/mL，冰育45 min，分別于-20 ℃、室溫下進(jìn)行凍融循環(huán)。破壁后，10 000 r/min離心20 min，取菌體、上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析[19]。

1.2.5 酶活測(cè)定 采用DNS(3,5二硝基水楊酸)法[20-21]。N-乙酰-D-氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=3.310 6x-0.077 4，R2=0.995 9。

1.2.6 重組幾丁質(zhì)酶的表征

(1) 反應(yīng)溫度：采用標(biāo)準(zhǔn)幾丁質(zhì)酶活性測(cè)定法測(cè)定20～70 ℃下幾丁質(zhì)酶活性。

(2) pH值：分別在檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH 3.0～5.0)、磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉緩沖液(pH 6.0～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 9.0)和碳酸氫鈉—?dú)溲趸c緩沖液(pH 10.0～11.0)中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)酶活性測(cè)定，確定ChiA的最佳反應(yīng)pH，所有緩沖液濃度均為50 mmol/L。

(3) 金屬離子及化學(xué)試劑：分別用1，5，10 mmol/L的MgCl2、FeCl3、ZnCl2、CaCl2、KCl、NaCl、C2H3O2Li、EDTA、巰基乙醇、SDS，在標(biāo)準(zhǔn)幾丁質(zhì)酶測(cè)定條件下探究幾丁質(zhì)酶活性。

(4) 底物：用1%的膠體幾丁質(zhì)、粉狀幾丁質(zhì)、蝦殼粉、蟹殼粉、殼聚糖、羧甲基纖維素鈉，于磷酸氫二鈉—磷酸二氫鈉鹽緩沖液(pH 7.0)中，50 ℃反應(yīng)30 min，測(cè)定ChiA的底物特異性。

1.2.7 同源建模 在NCBI的PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中，將幾丁質(zhì)酶ChiA的氨基酸序列進(jìn)行BLAST，將檢索出的同源性高的蛋白作為模板，利用同源模建的方法構(gòu)建幾丁質(zhì)酶ChiA的三維結(jié)構(gòu)。幾丁質(zhì)酶同源建模選用SWISS-MODEL在線軟件[22]，建模后用PROCHECK作拉氏圖評(píng)估預(yù)測(cè)三維結(jié)構(gòu)的可信度[23]。

1.2.8 氨基酸多序列比對(duì) 根據(jù)幾丁質(zhì)酶ChiA同源建模模型，利用Clustal Omega在線軟件，比對(duì)分析幾丁質(zhì)酶ChiA編碼的催化域氨基酸序列與其他同源性高并且晶體結(jié)構(gòu)確定的幾丁質(zhì)酶催化域的氨基酸序列，推測(cè)幾丁質(zhì)酶ChiA的催化反應(yīng)機(jī)制。

1.2.9 催化域關(guān)鍵氨基酸的突變 以ChiA/pET32a(+)/Top10作為出發(fā)菌株，采用定點(diǎn)突變?cè)噭┖衃24]，根據(jù)18家族幾丁質(zhì)酶ChiA催化域氨基酸比對(duì)結(jié)果，選擇催化結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，探究其催化活性。為了確保所需的突變是序列中唯一的突變，在生工生物工程(上海)股份有限公司中對(duì)插入的DNA的整個(gè)區(qū)域進(jìn)行測(cè)序。

1.2.10 突變體在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá) 將序列突變正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取單菌落至50 mL含有Amp(100 μg/mL)的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)過夜。按2%接種量接種至新鮮的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600 nm為0.6～0.8，用終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，16 ℃ 誘導(dǎo)24 h。收集菌體，按1 g/5 mL加入裂解液，加入溶菌酶1 mg/mL，冰育45 min，于-20 ℃、室溫下進(jìn)行凍融循環(huán)。破壁后，10 000 r/min離心20 min，去沉淀留上清酶液。

1.2.11 突變體酶活力和動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定 用DNS法測(cè)定突變體酶活。動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定：在反應(yīng)管中加入不同質(zhì)量濃度(1.25，2.50，5.00，7.50，10.00，12.50 mg/mL)的底物膠體幾丁質(zhì)，加入相同量的適量酶液，50 ℃、200 r/min 搖床反應(yīng)30 min。加入1.5 mL DNS，煮沸5 min 顯色，冰水中冷卻至室溫，10 000 r/min離心5 min，取上清液于540 nm處測(cè)定吸光值。通過制作Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定Km、Vmax和kcat值。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及鑒定

由圖1可知，幾丁質(zhì)酶PROKKA01070基因擴(kuò)增結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室前期全基因組測(cè)序結(jié)果一致，大小為1 065 bp；菌液PCR驗(yàn)證結(jié)果在約1 065 bp處有目的條帶，與測(cè)序結(jié)果一致，說明陽(yáng)性克隆ChiA/pMD19-T/Top10構(gòu)建成功。

表2 用于定點(diǎn)突變的引物序列Table 2 The primer sequences used in site-directed mutation

M.10 kb DNA Marker 1～3.ChiA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 4.ChiA/pMD19-T PCR產(chǎn)物圖1 ChiA基因PCR擴(kuò)增及克隆鑒定Figure 1 PCR amplification and clone identification of ChiA gene

2.2 ChiA/pET32a(+)表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定

由圖2可知，菌落PCR電泳顯示在約1 065 bp處有一目的條帶。雙酶切驗(yàn)證結(jié)果表明，約在1 065，6 000 bp有目的條帶，大小與預(yù)期結(jié)果相符，表明目的基因和表達(dá)載體連接方向正確，證明原核表達(dá)載體ChiA/pET32a(+)構(gòu)建成功。

2.3 表達(dá)產(chǎn)物的鑒定及酶活檢測(cè)

由圖3可知，45 kDa附近有目的條帶，與預(yù)測(cè)蛋白大小相差無幾，說明該重組菌成功表達(dá)蛋白。將構(gòu)建好的重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)后，在pH 7.0，50 ℃下，誘導(dǎo)后的酶活為132 U/L，而未誘導(dǎo)的檢測(cè)不到酶活性，說明重組幾丁質(zhì)酶ChiA在大腸桿菌中成功表達(dá)且重組幾丁質(zhì)酶活性比原始酶活性(100 U/L)提高了32%。

2.4 重組幾丁質(zhì)酶的表征

2.4.1 pH和反應(yīng)溫度 由圖4可知，重組酶在pH 7.0下顯示出最高的活性，最佳反應(yīng)溫度為50 ℃。

圖4 pH和反應(yīng)溫度對(duì)ChiA活性的影響Figure 4 Effects of pH and temperature on ChiA activity

2.4.2 金屬離子和化學(xué)試劑 由表3可知，10 mmol/L濃度下，Zn2+和Fe3+對(duì)該重組酶有較強(qiáng)烈的抑制作用，相對(duì)酶活力只有37.7%和35.3%；Mg2+、Ca2+、SDS、巰基乙醇、EDTA對(duì)該酶也有不同程度的抑制，但K+、Na+、Li+對(duì)該酶分別有6.3%，10.6%，8.6%的促進(jìn)作用。1，5 mmol/L 濃度下，Zn2+和SDS對(duì)重組酶有較強(qiáng)的抑制作用，其他離子和試劑對(duì)該酶無明顯影響。1 mmol/L濃度下，Ca2+、Fe3+和Mg2+對(duì)該酶有一定的促進(jìn)作用。試驗(yàn)濃度下，Na+和Li+對(duì)該酶均有促進(jìn)作用。

表3 離子和化學(xué)試劑對(duì)重組酶ChiA酶活力的影響Table 3 Effects of different metal ions and chemicals on ChiA activity %

M.5 000 bp DNA marker 1～2.ChiA/pET32a(+) PCR產(chǎn)物 3～4.ChiA/pET32a(+) 雙酶切條帶圖2 重組質(zhì)粒ChiA/pET32a(+)鑒定Figure 2 Identification of recombinant plasmid ChiA/pET32a(+)

1.蛋白Marker 2.誘導(dǎo)前全菌體 3.誘導(dǎo)后全菌體 4～5.試劑盒提取酶蛋白 6～7.誘導(dǎo)后破壁上清圖3 重組蛋白SDS-PAGE分析Figure 3 SDS-PAGE analysis of recombinant protein

2.4.3 底物 由表4可知，當(dāng)以膠體幾丁質(zhì)為底物時(shí)，重組酶的相對(duì)酶活性最高；當(dāng)以粉末為底物時(shí)，重組酶的相對(duì)酶活性為9.8%。當(dāng)以1%蝦殼粉和蟹殼粉為底物時(shí)，只檢測(cè)到微弱酶活；當(dāng)以殼聚糖和羧甲基纖維素鈉為底物時(shí)，檢測(cè)不到酶活。綜上，重組酶可以有效地降解膠體幾丁質(zhì)，對(duì)幾丁質(zhì)具有底物特異性，而殼聚糖、羧甲基纖維素鈉等幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)類似物不能與重組酶特異性結(jié)合。

表4 ChiA的底物特異性測(cè)定結(jié)果Table 4 Determination of substrate specificity of ChiA

2.5 同源建模

經(jīng)比對(duì)分析，選擇與幾丁質(zhì)酶ChiA催化結(jié)構(gòu)域中的結(jié)構(gòu)基序(PDBID：4w5u)在相應(yīng)的密碼子區(qū)域具有69.03% 的氨基酸序列相似性的嗜熱鏈霉菌(StChi40)的幾丁質(zhì)酶作為ChiA同源建模的模板。由圖5可知，ChiA屬于18家族糖苷水解酶，其結(jié)構(gòu)由8個(gè)α-螺旋內(nèi)桶和8個(gè)β-折疊外桶組成，它們緊密地?cái)D在一起，并由一個(gè)不規(guī)則的卷曲段連接。18家族中對(duì)應(yīng)β-3和β-4鏈的兩個(gè)高度保守的氨基酸片段具有相似的結(jié)構(gòu)，底物結(jié)合位點(diǎn)位于β-3和β-4鏈的保守序列形成的環(huán)縫中。

圖5 幾丁質(zhì)酶ChiA的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型Figure 5 Three-dimensional structure model of chitinase ChiA

由圖6可知，90.4%，8.6%，1.0%和0%的氨基酸分別落入核心區(qū)、偏好允許區(qū)、一般允許區(qū)和不允許區(qū)?？偟膩碚f，90%以上的氨基酸在其偏好區(qū)，說明預(yù)測(cè)的幾丁質(zhì)酶三維結(jié)構(gòu)可信。

圖6 幾丁質(zhì)酶三維結(jié)構(gòu)拉氏圖Figure 6 Ramachandran plot of the modeled 3D structure of chitinase

2.6 ChiA催化氨基酸序列分析

序列比對(duì)分析所選序列，包括環(huán)狀芽孢桿菌(BacilluscirculansWl-12)菌株Chitinase A1的A鏈(PDB:1ITX_A)、嗜熱鏈霉菌(StreptomycesthermoviolaceusStChi40)菌株幾丁質(zhì)酶的A鏈(PDB:4W5U)、關(guān)節(jié)桿菌(Arthrobactersp.TAD20)菌株Chitinase B的A鏈(PDB:1KFW)、黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)菌株Chitinase A的A鏈(PDB:1X6L)、黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)菌株Chitinase A的A鏈(PDB:2WK2)、黏質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)菌株Chitinase A的A鏈(PDB:1RD6)和哈氏弧菌(VibrioHarveyi)菌株幾丁質(zhì)酶的A鏈(PDB:3B8S_A)。由圖7可知，8種菌的氨基酸序列和功能有差異性，但都具有高度保守的催化域的關(guān)鍵氨基酸。ChiA具有兩個(gè)典型的18家族糖苷水解酶的保守域，分別為87～90位的“SxGG”結(jié)構(gòu)和125～132位的“DxxDxDxE”結(jié)構(gòu)，在催化域的環(huán)縫部位。有研究[25-27]表明，幾丁質(zhì)酶“SxGG”保守模塊的活性中心負(fù)責(zé)酶與底物結(jié)合，“DxxDxDxE”保守域的催化活性中心具有催化降解底物功能。125DxxDxDxE132形成即(βα)8桶的β-4鏈，構(gòu)成催化域的核心部位。

圖7 幾丁質(zhì)酶ChiA催化域與其他生物體的催化域多重序列比對(duì)Figure 7 Multiple sequence alignment of the catalytic domain of chitinase ChiA with that of other organisms

2.7 重組菌株中活性位點(diǎn)氨基酸的定點(diǎn)突變

為了證實(shí)ChiA中保守氨基酸的功能，將D128、D130和E132殘基用Asn、Ala或Gln取代，產(chǎn)生6個(gè)突變體：D128N、D128A、D130N、D130A、E132Q和E132A。

由圖8可知，突變體的比活性大大降低，特別是E132A、E132Q幾乎完全失活(12.7，13.2 U/L)，證實(shí)了Glu-132在酶催化中起重要作用；在突變體中，D128N、D128A、D130N和D130A也表現(xiàn)出較低的比活性，證實(shí)了D128、D130、E132氨基酸在18家族的保守區(qū)域中起重要作用。有研究[28]報(bào)道，Glu-132在催化反應(yīng)中作為質(zhì)子供體起著關(guān)鍵作用。突變體D130N的比活性在陰性突變體中最高，因?yàn)樘於０诽峁┑臍滏I可以取代天冬氨酸提供的氫鍵，而丙氨酸不能產(chǎn)生氫鍵[25]。天冬氨酸在130位的催化作用主要由氫鍵支持，因此氫鍵的存在極大地穩(wěn)定了ChiA的催化活性[29]。第128位的天冬氨酸被認(rèn)為是D130的輔助因子，增加了D130的pKa[30]。此外，DXXDXDXE保守結(jié)構(gòu)域中的中間Asp可以增加幾丁質(zhì)酶的轉(zhuǎn)糖基活性[31]。

2.8 重組幾丁質(zhì)酶突變體的動(dòng)力學(xué)常數(shù)

由表5可知，6個(gè)突變體的催化效率與重組酶相比顯著降低，其Km值明顯升高，可能是突變體與底物膠體幾丁質(zhì)之間的親和力減小，證明了D128、D130、E132是催化幾丁質(zhì)酶降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)幾丁寡糖的關(guān)鍵氨基酸活性位點(diǎn)。

1～7分別為ChiA、D128A、D128N、D130A、D130N、E132Q和E132A菌株圖8 各個(gè)突變體酶活Figure 8 The specific activities of the mutants

表5 ChiA及其突變體的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Table 5 Kinetic parameters of ChiA and its mutants

3 結(jié)論

以淀粉酶鏈霉菌CS1801幾丁質(zhì)酶基因序列為研究對(duì)象，以大腸桿菌BL21(DE3)為表達(dá)宿主，成功表達(dá)了幾丁質(zhì)酶ChiA。結(jié)果表明，幾丁質(zhì)酶重組工程菌培養(yǎng)周期縮短至24 h，酶活為132 U/L，較原始酶提高了32%。重組幾丁質(zhì)酶的最適反應(yīng)溫度為50 ℃，pH為7.0，且該酶具有膠體幾丁質(zhì)底物特異性。第128，130位的天冬氨酸和132位的谷氨酸是幾丁質(zhì)酶ChiA催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)的催化活性氨基酸。為進(jìn)一步提高幾丁質(zhì)酶的活性及酶法生產(chǎn)幾丁寡糖的效率，可通過分離純化、酶固定化等技術(shù)對(duì)幾丁質(zhì)酶進(jìn)行研究，獲得催化生產(chǎn)幾丁寡糖效率得到提高的幾丁質(zhì)酶。