Fonsecaea monophora色素株促進巨噬細胞凋亡的研究

李敏英， 黃歡， 劉紅芳， 曾維英， 席麗艷,2

1.南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091；2.中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院，廣東 廣州 510120

著色芽生菌病(chromoblastomycosis, CBM)是一種誘因復雜的、多因素作用引起的疾病，不僅與致病菌本身的毒力因子(如硬殼小體、細胞壁黑素、胞外蛋白酶等)有關，還與宿主的免疫密切相關[1-2]。黑素作為一種重要的真菌毒力因子，在多種病原真菌的致病性中發(fā)揮著重要作用，比如白念珠菌、隱球菌和曲霉等[3-4]。黑素不僅使病原真菌具有較強的抵御外界壓力的能力(比如離子輻射、氧化條件、pH 值改變、溫度變化)，還與真菌耐藥有關，在與宿主的免疫應答中也發(fā)揮著重要作用[5]，但具體機制尚不明確。

在我國南方，F(xiàn).monophora是主要的病原菌[6]，黑素是其重要的毒力因子。F.monophora著色霉主要合成DHN-黑素，分布在細胞壁的外層。研究表明，真菌黑素不僅能抑制巨噬細胞凋亡，也能促進其凋亡。在煙曲霉中，色素株(DHN-黑素)通過激活PI3K/Akt通路，上調(diào)Mcl-1抗凋亡基因的表達，抑制FoxO1、IκB促凋亡基因的磷酸化，抑制巨噬細胞凋亡[7]。而在馬爾尼菲藍狀菌當中，黑素(L-DOPA黑素)促進巨噬細胞的裂解，促進其凋亡，并且抑制巨噬細胞的吞噬[8]。但目前尚未見F.monophora著色霉黑素是否對巨噬細胞凋亡有影響的相關報道。細胞凋亡受多個基因表達調(diào)控影響,其中BCL-2、Bax及聚二磷酸腺苷核糖聚合酶PARP-1基因的表達與凋亡密切相關。本研究通過觀察F.monophora色素株對巨噬細胞凋亡相關基因BCL-2、Bax及PARP-1表達的影響，從而探討F.monophora色素株對巨噬細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和菌株

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7細胞購自中國典型培養(yǎng)物保存中心China Center TypeCulture Collection (CCTCC)。F.monophora色素株(CBS122845，SUMS0505)分離自一位 81 歲CBM 患者的皮損[9]，是一種分生孢子突變株，經(jīng)形態(tài)學和內(nèi)轉錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列測序分析鑒定為F.monophora，具有黑素，無菌絲結構；F.monophora白化株(CBS125149，SUMS0510)是由色素株多次傳代后得到的天然白化菌株，不含黑素，也無菌絲結構。

1.2 主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(BD，美國)；DMEM 培養(yǎng)基(Gibco，美國)；青霉素/鏈霉素混合液(雙抗)(Gibco，美國)；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)(Gibco，美國)；PBS緩沖液(廣州鼎國生物技術有限公司)；RIPA裂解液(廣州鼎國生物技術有限公司)；24孔細胞培養(yǎng)板(廣州永津生物科技有限公司)；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific，美國)；抗PARP-1 抗體(Abcam，英國)；凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；Trizol RNA提取試劑(Invitrogen，美國)；Thermo Scientific DreamTaq Green PCR Master Mix (2×)(Thermo Scientific，美國)；RevertAid Master Mix(Thermo Scientific，美國)。

1.3 方法

1.3.1 細胞復蘇、傳代及培養(yǎng) 在無菌超凈臺內(nèi)，無菌操作復蘇 RAW264.7細胞株，用提前配制好的含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d。經(jīng)傳代狀態(tài)穩(wěn)定后，用血細胞計數(shù)板計算細胞密度，接種1×105個細胞至24孔板。

1.3.2 制備F.monophora孢子懸液 將F.monophora色素株和白化株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，26 ℃培養(yǎng)2周后，用接種針刮取菌體到PBS緩沖液中，制備菌懸液，血球計數(shù)板調(diào)整菌懸液的分生孢子濃度為 1×107CFU/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 細胞和F.monophora共培養(yǎng)和觀察 實驗分為3組：PBS對照組、色素株組和白化株組。待接種到細胞培養(yǎng)板的細胞完全貼壁后，按細胞∶孢子為1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20的比例，每孔加入提前配制好的菌懸液 100 μL，在含 5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞和F.monophora的變化并拍照記錄。

1.3.4 蛋白提取和Western blot 吸除24孔板中的培養(yǎng)液，加入100 μL的RIPA裂解液，裂解細胞后，取10 μL樣品進行BCA的檢測，按照BCA蛋白定量說明書操作，加入loading buffer后，每個樣品取20 μg蛋白上樣至配制好的1% SDS-PAGE膠中，然后進行電泳，先用80 v，30 min，使各樣本處于同一水平，待marker開始分離后，將電壓調(diào)至120 v，1 h。然后進行常規(guī)轉膜，200 mA，1 h，再封閉和孵育一抗(PARP-1和GADPH)，一抗4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗1 h后顯影。

1.3.5 總RNA 提取、逆轉錄及定量PCR 采用常規(guī)trizol提取法進行總RNA提取。逆轉錄及定量 PCR 反應操作均依據(jù)試劑的說明書進行。反應條件為：95 ℃預變性 1 min；95 ℃變性 30 s，60 ℃擴增30 s 并采集熒光信號，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)，72 ℃最后延伸5 min。引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成(表1)。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time PCR primer sequences

1.3.6 細胞免疫熒光 按照凋亡檢測試劑盒說明書操作，吸除24孔板中的培養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞1次；加入250 μL的檢測工作液，孵育5 min后，在熒光顯微鏡下觀察熒光染色效果，并且拍照記錄，注意整個過程均需注意避光操作。

1.4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，組間實時定量PCR結果比較使用t檢驗，對巨噬細胞的影響采用單因素方差分析進行統(tǒng)計，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 F.monophora不同菌株對巨噬細胞形態(tài)的影響

色素株和白化株與巨噬細胞共培養(yǎng)24 h后，可發(fā)現(xiàn)孢子附著在巨噬細胞上；色素株和白化株的孢子由于粘連在一起，成團狀，體積較大，均不能被有效吞噬；孢子量加入越多，色素株組存活的貼壁巨噬細胞越少，而白化株組巨噬細胞無明顯變化(圖1)。

圖1 F.monophora不同菌株與巨噬細胞共培養(yǎng)圖(400×)Figure 1 Co-culture of different strains of F.monophora and macrophages (400×).

2.2 F.monophora色素株對巨噬細胞PARP-1、BCL-2、BAX表達的影響

在不同的細胞與孢子的比例下，F(xiàn).monophora不同菌株與巨噬細胞共培養(yǎng)24 h后，如圖2所示，隨著色素株的孢子濃度增多，PARP-1被剪切得更多，濃度1 ∶20與1 ∶5的相比，1 ∶20的PARP-1被完全剪切，無完整條帶，而1 ∶5組與PBS組對比，雖然具有分子量更小的被剪切的條帶，但明顯還有尚未被剪切的PARP-1條帶，說明色素株的孢子濃度越大，PARP-1越容易被剪切，凋亡的細胞越多。而白化株與PBS處理組一樣，不同孢子濃度下，PARP-1均無明顯被剪切。巨噬細胞與F.monophora不同菌株在細胞與孢子比例為1 ∶10時共培養(yǎng)24 h，實時定量PCR檢測BCL-2、BAX的表達，結果發(fā)現(xiàn)，與白化株相比，色素株能明顯降低BCL-2/BAX的比值(t=3.20,P=0.033)，而白化株與PBS處理組相比無明顯差異(t=0.66,P=0.540)，說明色素株能明顯引起巨噬細胞的凋亡，與Western blot檢測結果一致。

圖2 F.monophora不同菌株對巨噬細胞PARP-1、BCL-2、BAX基因表達的影響Figure 2 The effects of different strains of F.monophora on the gene expression of PARP-1, BCL-2 and BAX in macrophages.

2.3 F.monophora色素株對巨噬細胞凋亡的影響

各菌與巨噬細胞共培養(yǎng)24 h后，免疫熒光檢測Annexin V FITC的陽性細胞，每組統(tǒng)計300個細胞，計算陽性率，陽性即為凋亡細胞。如圖3所示，隨著時間的延長，色素株組凋亡細胞明顯增多，4 h組與8 h組相比，F(xiàn)=82.01。4 h色素株組與8 h組相比，MOI為1 ∶5時，P=0.001；MOI為1 ∶10時，P=0.003；MOI為1 ∶20時，P<0.01。不同劑量組比較，4 h組，F(xiàn)=62.58，色素株MOI 1 ∶5組與MOI 1 ∶10組相比,P=0.006；MOI 1 ∶10與MOI 1 ∶20組相比,P=0.003。在8 h組，F(xiàn)=254.6，色素株MOI 1 ∶5組與MOI 1 ∶10組相比,P=0.004，MOI 1 ∶10組與MOI 1 ∶20組相比,P<0.01，可見其呈劑量依賴。而白化株無論劑量多少均與PBS處理組一樣，組間無統(tǒng)計學差異(4 h組，F(xiàn)=2.93；8 h組，F(xiàn)=0.89，均P>0.05)。

圖3 F.monophora不同菌株對巨噬細胞凋亡的影響Figure 3 Effects of different strains of F.monophora on apoptosis of macrophages.

3 討論

CBM大多是病原體經(jīng)傷口感染進入皮下定植，并轉化成寄生態(tài)的硬殼小體形成，引起肉芽腫和化膿性感染。本研究使用的是一株F.monophora突變株 CBS122845，菌落形態(tài)為煤渣樣，產(chǎn)生大量的黑素，顯微觀察為酵母狀的磚格樣細胞，沒有菌絲形態(tài)[9]。該菌株經(jīng)過多次傳代，獲得了白化突變株 CBS125149，細胞壁無黑素。小鼠感染模型已證實，色素株較白化株引起的感染性肉芽腫更嚴重，并且持續(xù)時間更長[10]。表明黑素為F.monophora抵抗宿主免疫細胞的重要毒力因子。目前，F(xiàn).monophora與宿主之間的發(fā)病機制和早期與宿主的相互作用機制知之甚少。已有研究證實F.monophora促進促炎細胞因子的表達并抑制抗炎細胞因子的表達，促進 THP-1向經(jīng)典活化型(M1型)巨噬細胞極化[11]。F.monophora感染巨噬細胞的轉錄譜分析研究表明黑素影響巨噬細胞基因的表達，差異表達基因的生物學功能與免疫反應密切相關，黑素可能通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的MAPK信號通路影響相互作用[12]。但其如何影響宿主的免疫細胞，如何影響先天免疫調(diào)節(jié)的機制尚不明確。

眾所周知，細胞程序性死亡(apoptosis)是一種參與先天免疫調(diào)節(jié)的機制[13]。細胞凋亡發(fā)生過程受多基因的調(diào)控，由多種促凋亡和抗凋亡的蛋白相互作用，兩者比例失衡，導致細胞凋亡的發(fā)生。BCL-2在急性淋巴細胞白血病中被發(fā)現(xiàn)[14]，后來被證實可以保護細胞免于程序性細胞死亡[15]，是一種重要的抗凋亡蛋白。BCL-2相關的X蛋白(BAX)被鑒定為BCL-2的同源結合伴侶，作用與BCL-2相反，是促進細胞凋亡的蛋白[16]。兩者比值是凋亡走向的標志，比值升高抑制凋亡，比值降低促進凋亡。本實驗結果表明，在不被吞噬的情況下，F(xiàn).monophora色素株下調(diào)巨噬細胞BCL-2與BAX的比值，最終增加巨噬細胞的凋亡比例。PARP-1是定位在細胞核內(nèi),與應激條件下 DNA修復密切相關的一種酶。 PARP-1對于細胞的穩(wěn)定和存活非常重要，PARP-1失去酶活力會加速細胞的不穩(wěn)定。Caspase介導的細胞凋亡通過裂解細胞功能和存活所需的幾種關鍵蛋白來實現(xiàn)[17]。PARP-1是幾種已知的半胱天冬酶底物之一。半胱天冬酶對PARP-1的裂解被認為是細胞凋亡的標志[18]。本實驗結果表明,F.monophora色素株在刺激巨噬細胞時，隨著劑量的增加，能明顯剪切PARP-1，使巨噬細胞的凋亡比例增多。

綜上所述，F(xiàn).monophora色素株可在胞外通過下調(diào)BCL-2/BAX的比值,剪切PARP-1，進而促進巨噬細胞的凋亡發(fā)生。推測F.monophora色素株可能通過促進巨噬細胞凋亡，來抵抗巨噬細胞的免疫殺傷作用，創(chuàng)造有利于免疫逃逸的條件，從而導致疾病的發(fā)生發(fā)展。