基于HS-SPME-GC-MS和電子鼻技術對干棗及其不同提取物揮發(fā)性成分分析

黃貴元，趙海娟，高 陽，許利平，許高燕，吳兆明，李瑞麗，梁 淼,，張峻松,

（1.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，河南 鄭州 450002；2.河南中煙工業(yè)有限責任公司安陽卷煙廠，河南 安陽 455006；3.浙江中煙工業(yè)有限責任公司，浙江 杭州 310008）

新鄭大棗，又名雞心大棗、雞心棗，是棗科雞心棗屬植物的成熟果實。新鄭大棗具有較高的VC含量和良好的抗氧化活性，可用作功能性水果，但鮮棗的貨架期極短，在非受控條件下，通常不超過10 d，因此鮮棗多被干制并加工成相關產(chǎn)品。干制后的大棗具有豐富而獨特的香氣，濃郁的棗甜香略帶酸味。通常利用提取技術獲取干棗提取物，并將其添加于食品中以賦予干制大棗的香氣特征，因此干棗提取物已被列入“食品添加劑清單”，可作為食品添加劑和調(diào)味劑，廣泛應用于食品、天然香精香料等行業(yè)。例如，添加了干棗水提物的白面包顏色、風味、味道和總體口感都得到較好的提升。研究表明干棗提取方法、提取溶劑等條件對提取物的香味成分及作用影響較大，并且提取物與干棗自身的香味也存在一定差異。然而，目前關于干棗及其不同提取物之間的香氣差異性研究較少，系統(tǒng)對比干棗及其不同提取物的香氣品質(zhì)差異，可以為干棗及其提取物的定向精準使用提供數(shù)據(jù)支撐。

氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-masss pectrometry，GC-MS）可以分離、鑒定和量化干棗及其提取物的揮發(fā)性成分，然而GC-MS結果不能直接體現(xiàn)其感官品質(zhì)，而電子鼻可以通過模仿人類的嗅覺功能來識別風味。將2 種技術相結合對風味進行分析，可以起到良好的驗證和相互補充的作用，能更好地區(qū)分棗及其不同提取物的風味化合物的特征差異。近年來頂空固相微萃取-GC-MS（headspace solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS）聯(lián)用結合電子鼻對揮發(fā)性成分的分析日臻成熟，已成功應用于桃、脫脂奶、松子等的香氣分析，對于不同品種、成熟期、貯藏期、干制方法棗的香氣品質(zhì)有較好識別，也為干棗提取物揮發(fā)性成分分析提供了技術手段。

因此，本實驗利用HS-SPME-GC-MS結合電子鼻技術分別對干棗、不同提取方法獲得的棗浸膏及凈油的揮發(fā)性成分進行分析，研究不同加工方法對其香氣品質(zhì)的影響行為，以明確干棗及其提取物揮發(fā)性成分之間的差異，為干棗提取物的應用提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

新鄭大棗，于2020年10月購自新鄭棗健康食品有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977B GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司；手動SPME進樣器、65 μm PDMS/DVB萃取頭 美國Supelco公司；PEN3.5便攜式電子鼻 德國Airsence公司；B13-3智能恒溫定時磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；XH-200A電腦微波固液相合成/萃取儀 北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；N-1300V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 東京理化器械株式會社；EL204分析天平 美國Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

將干棗去核、粉碎（3 mm×3 mm×3 mm），自封袋保存于－20 ℃?zhèn)溆?，得到干棗樣品?/p>

浸膏分別采用加熱回流和微波輔助熱回流的方法制備，操作如下：稱取一定量的干棗樣品，加入體積分數(shù)80%乙醇溶液，85 ℃加熱3 h，提取2 次，合并提取液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得加熱回流棗浸膏（heat reflux jujube extract，HJE）；稱取一定量的干棗樣品，加入體積分數(shù)90%的乙醇溶液，400 W微波提取15 min，提取2 次，合并提取液后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，得加微波輔助熱回流棗浸膏（microwave-assisted heat reflux jujube extract，MJE）。

將制得的2 種棗浸膏分別加入體積分數(shù)95%乙醇溶液，60 ℃水浴攪拌1 h，抽濾后將提取液于－20 ℃冷凍24 h后，及時抽濾，旋蒸去除溶劑，分別得到加熱回流棗凈油（heat reflux jujube absolute oil，HJO）和微波輔助熱回流棗凈油（microwave-assisted heat reflux jujube absolute oil，MJO）。棗浸膏和棗凈油于4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 HS-SPME條件

精確稱取2 g樣品，置于20 mL頂空瓶中，密封，樣品在50 ℃條件下平衡40 min，然后在持續(xù)加熱和攪拌（250 r/min）條件下，插入萃取頭，萃取30 min后插入GC-MS進樣口，于250 ℃解吸3 min。

1.3.3 GC-MS分析條件

GC條件：HP-5MS石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃，然后以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min；載氣為氦氣，流量為1.0 mL/min；采用不分流模式進樣。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；傳輸線溫度250 ℃；采集為全掃描模式，質(zhì)量采集范圍/35～550。

采用NIST14質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索，選擇匹配度不小于85的峰確定各香味物質(zhì)。每個樣品測定重復3 次。

1.3.4 電子鼻分析條件

精確稱量0.1 g樣品，加入40 mL吹掃捕集瓶中，擰緊瓶蓋，于室溫放置20 min后開始用電子鼻檢測。傳感器清洗時間120 s；歸零時間10 s；樣品準備時間5 s；樣品采集時間60 s，載氣為潔凈空氣，載氣和樣品氣體流量均為30 mL/min，每個樣品測定重復3 次。10 種傳感器的敏感物質(zhì)見表1。

表1 PEN3.5電子鼻傳感器敏感物質(zhì)Table 1 Performance description of PEN3.5 electronic nose sensors

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 21軟件進行，用Duncan多重比較驗證干棗及其不同提取物的揮發(fā)性成分在＜0.05水平上的差異顯著性；揮發(fā)性成分的熱圖和層次聚類分析采用Morpheus在線軟件進行；電子鼻數(shù)據(jù)采用Winmuster軟件進行主成分分析（principal component analysis，PCA）。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS分析干棗及其不同提取物的揮發(fā)性成分

如圖1所示，利用HS-SPME-GC-MS方法從干棗及其提取物中共檢測出96 種揮發(fā)性物質(zhì)，干棗、HJE、MJE、HJO和MJO樣品中分別檢測出59、49、43、53 種和58 種揮發(fā)性成分，結果如表2所示。

圖1 干棗及其不同提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of dried jujube and its different extracts

酯類化合物是水果香氣成分中最主要的一類物質(zhì)，成熟水果的香氣主要取決于酯類物質(zhì)。由表2可以看出，干棗及其不同提取物中酯類香味成分的種類最多，但在另一項研究中，雜環(huán)類化合物為棗提取物中的主要揮發(fā)性成分，這可能與棗的提取方法不同有關。一些低級脂肪酸甲酯（己酸甲酯、庚酸甲酯、辛酸甲酯）僅在干棗中檢測出。酯類來源于脂肪氧合酶的代謝途徑，這些小分子酯類可能是一些脂肪酸甲酯化的次級代謝產(chǎn)物。它們大多具有水果香氣，對于干棗香氣的形成具有重要作用。此外，干棗中檢測出了5 種內(nèi)酯類物質(zhì)，內(nèi)酯類物質(zhì)是果香的重要貢獻化合物，但其相對含量較低（4.375%），并且在幾種提取物中，內(nèi)酯類化合物的相對含量均顯著降低（0.714%～1.107%）。

表2 干棗及其不同提取物揮發(fā)性物質(zhì)含量變化Table 2 Composition and content of volatile constituents in dried jujube and its different extracts

續(xù)表2

續(xù)表2

干棗及其不同提取物中酸類物質(zhì)的相對含量均較高（31.273%～44.433%），己酸、庚酸、正辛酸和正癸酸在干棗及其不同提取物中均有檢出，它們呈現(xiàn)出奶酪和脂肪香氣。干棗及MJE中己酸為相對含量最高的酸類物質(zhì)（分別為17.349%和21.480%），而其余3 種提取物中含量最高的酸類物質(zhì)為正癸酸（9.542%～15.474%）。此外，在幾種棗提取物中發(fā)現(xiàn)了較高含量的苯甲酸，這可能與苯甲醛的氧化有關。

干棗及其不同提取物中醇類物質(zhì)的相對含量和種類數(shù)均較低。其中，苯乙醇僅在MJE和MJO中檢測到，相對含量分別為0.190%和0.210%。干棗中僅檢測到蘑菇醇，其相對含量為3.046%。醛類物質(zhì)中，苯甲醛在干棗中相對含量最高，為22.704%。另外，HJO和MJO

中均檢測到了香草醛，它不僅具有甜香和奶油香氣，還有一定的藥理作用。環(huán)戊烯酮和2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4()-吡喃-4-酮僅在HJE和HJO中發(fā)現(xiàn)，它們被認為具有焦糖和甜香。楊鵬元等對棗乙醇提取物進行分離分析發(fā)現(xiàn)，2,3-二氫-3,5-二羥基-6-甲基-4()-吡喃-4-酮、麥芽酚和4-環(huán)戊烯-1,3-二酮等7 種揮發(fā)性成分為棗的烤甜香特征成分，但在本研究中僅檢測到其中的2 種。值得指出的是，在干棗及其不同提取物中首次發(fā)現(xiàn)巨豆三烯酮，它是葉黃素的降解產(chǎn)物，具有干草樣甜香。所檢測出的其余種類物質(zhì)對干棗及其不同提取物的香氣形成貢獻不大。

由上述分析可得，干棗及其不同提取物中的主要香氣物質(zhì)為酸類、酯類、醛類和酮類。由圖2可知，干棗經(jīng)過不同處理后，幾類主要化合物的相對含量呈現(xiàn)出不同的變化規(guī)律。醛類物質(zhì)相對含量最高的為干棗（25.128%），其次為2 種浸膏（7.258%～8.496%），而2 種凈油最低（1.801%～2.012%），這種醛類含量隨樣品熱處理強度的增加而降低的趨勢與醛類物質(zhì)自身穩(wěn)定性有關，熱處理會加速醛的氧化，導致其相對含量下降。與醛類不同的是，酮類物質(zhì)在HJE和HJO中的相對含量明顯高于其余3 種樣品（＜0.05），表明加熱回流提取利于酮類物質(zhì)的生成及富集。這些酮類香氣物質(zhì)的產(chǎn)生與美拉德反應有關，而微波輔助熱回流提取的時間較短，反應程度不夠，因此未形成這些酮類香氣物質(zhì)。

圖2 干棗及其不同提取物中主要化合物相對含量Fig.2 Contents of acids,aldehydes,ketones and esters in dried jujube and its different extracts

此外，由圖2可以看出，2 種提取方法對于獲得酸類和酯類物質(zhì)效果有差異，加熱回流提取對于酸類物質(zhì)的提取效率更高，而微波輔助熱回流提取則對酯類的提取效率更高。另外，同種提取方式下，浸膏和凈油中的酸類和酯類物質(zhì)分布整體規(guī)律：酸類物質(zhì)相對含量為HJE＞HJO、MJO＞MJE，酯類物質(zhì)相對含量為HJO＞HJE、MJE＞MJO，浸膏和凈油中的酸類和酯類物質(zhì)的相對含量互為補充，這可能與浸膏制備凈油過程中酸類和酯類的相互轉(zhuǎn)換有關。

2.2 干棗及其不同提取物揮發(fā)性成分的熱圖和層次聚類分析

為了直觀清晰地了解干棗及其不同提取物揮發(fā)性成分含量的異同，對5 個樣品檢測出的96 種揮發(fā)性成分的相對含量進行熱圖和層次聚類分析，結果如圖3所示。熱圖中方塊顏色由藍到紅代表揮發(fā)性成分含量由低到高。

由圖3可以看出，干棗及其不同提取物分為3 組：干棗為1 組，MJE為1 組，HJE、HJO和MIO為1 組。其中，HJE和HJO被分在同一分支上，表示其揮發(fā)性成分分布沒有顯著差異，這與兩者具有較接近的酮類物質(zhì)有關。干棗沒有與任何提取物分組在相同的分支上，說明干棗的揮發(fā)性成分分布不同于幾種提取物，這主要與干棗中醛類、內(nèi)酯類和烴類含量較高有關。MJE未和其余幾種提取物中的一種分為一組，這是因為它在部分揮發(fā)性成分上的分布和干棗接近（己酸、月桂酸甲酯等）。此外，從圖3還可以明顯看出，庚酸、正辛酸、己酸、月桂酸甲酯、肉豆蔻酸甲酯和肉豆蔻腦酸甲酯在干棗及其不同提取物中的分布相近，其中月桂酸甲酯呈現(xiàn)典型的棗香味，肉豆蔻腦酸甲酯呈焦香風味，它們曾被鑒定為大棗中的典型香氣成分。

圖3 干棗及其不同提取物香氣成分的熱圖和層次聚類分析Fig.3 Heat map and hierarchical cluster analysis of the aroma components of dried jujube and its different extracts

2.3 干棗及其不同提取物揮發(fā)性成分的電子鼻響應分析

圖4以干棗和HJO為例，展示了電子鼻傳感器對它們的響應，每條曲線顯示了相應傳感器響應值隨時間延長的變化。由圖4和圖5可以看出，不同樣品的響應值高低為凈油＞干棗＞浸膏，這與GC-MS的結果一致（圖1）。浸膏中含有較大量的糖，呈半固態(tài)，異常黏稠，在室溫條件下，香味成分較難突破屏障，是整體響應值較低的主要原因。凈油經(jīng)過2 次提取，除去了大量的糖類、蛋白質(zhì)等的大分子物質(zhì)，呈流體狀，揮發(fā)性成分含量明顯提升，整體響應值相應提高。

圖4 電子鼻傳感器對干棗（a）和HJO（b）的響應圖Fig.4 Responses of electronic nose sensors to dried jujube (a) and heat reflux jujube absolute oil (b)

圖5 干棗及其不同提取物的電子鼻數(shù)據(jù)雷達圖Fig.5 Radar chart of electronic nose data for dried jujube and its different extracts

干棗中S7（對萜類和含硫化合物敏感）的響應值最高，其次是S9（對芳香族化合物和有機硫化物敏感）、S6（對烷烴敏感）、S8（對醇類、部分芳香族化合物敏感）和S2（對氮氧化合物非常敏感），這與Chen Qinqin等對鮮棗的電子鼻分析結果略有不同，說明干制會對棗的風味造成影響。干棗中萜烯類物質(zhì)相對含量僅為0.400%，而其S7的響應值為最高，原因是壬醛、己酸及低級脂肪酸甲酯等具有類似萜烯結構的物質(zhì)可以顯著增加S7的響應值。與干棗不同的是，HJE、HJO、MJE和MJO中響應值最高的均為S6，這可能是因為這4 種提取物中高級脂肪酸單酯相對含量較高，高級脂肪酸單酯的碳鏈較長，其結構與烷烴較為接近，會使S6的響應值明顯增加。此外，HJE和HJO中具有較高相對含量（16.292%和17.194%）和種類（8 種和10 種）的酮類物質(zhì)，但這在電子鼻傳感器的響應中沒有體現(xiàn)出來，這意味著電子鼻對于這些酮類物質(zhì)不敏感。HJE、HJO、MJE和MJO中S9、S7、S8和S2這4 種傳感器的響應值也相對較高，趨勢與干棗基本一致。

2.4 干棗及其不同提取物揮發(fā)性成分的電子鼻PCA和載荷分析

對5 個樣品的10 種電子鼻傳感器響應值進行PCA和載荷分析，如圖6a所示，PC1的貢獻率為91.45%，PC2的貢獻率為7.79%，前2 個PC的總貢獻率為99.24%，超過了90%，說明前2 個PC足以解釋總方差。

PCA結果表明，干棗及其不同提取物可以分為4 組：干棗為1 組，MJE為1 組，HJE為1 組，HJO和MJO為1 組。除HJE外，結果與聚類分析結果較一致。HJE未與HJO和MJO分為一組，這主要與HJE中香氣成分含量相對較低有關（圖1）。HJO和MJO相互接近，說明它們具有相似的香氣，而HJE和MJE之間有較遠距離，這表示它們具有顯著不同的風味，這和GC-MS的結果一致。HJE和MJE中分別具有較高含量的酸類和酯類物質(zhì)，而經(jīng)過進一步提取的HJO和MJO中這2 類物質(zhì)的含量趨于平衡，使它們的香氣更加協(xié)調(diào)一致。

由圖6b可以看出，對PC1貢獻率最大的是S6傳感器，其次為S8傳感器；對PC2貢獻率最大的是S7傳感器，而S9傳感器對PC1和PC2貢獻率都較大。選擇這4 個傳感器進行實驗，結果見圖6c，這4 個傳感器的貢獻率高達99.24%。因此，S6（W1S）、S7（W1W）、S8（W2S）和S9（W2W）為識別干棗及其不同提取物香氣的特征傳感器。

圖6 干棗及其不同提取物電子鼻PCA圖和載荷圖Fig.6 PCA and loading analysis of electronic nose sensor data for dried jujube and its different extracts

3 結論

利用HS-SPME-GC-MS結合電子鼻技術對干棗及其不同提取物的揮發(fā)性成分進行分析。結果表明：干棗及其不同提取物中的主要香氣成分為酸類、酯類、醛類和酮類物質(zhì)；不同提取方式得到的提取物中揮發(fā)性成分存在較大差異，加熱回流提取對于酸類物質(zhì)的提取效率較高，微波輔助熱回流提取則對酯類的提取效率較高；聚類分析和PCA分別將干棗及其不同提取物劃分為3 組和4 組，兩者的區(qū)別在于HJE，這與HJE中香氣成分含量相對較低有關；電子鼻的載荷分析顯示，W1S、W1W、W2S和W2W為識別干棗及其不同提取物香氣的特征傳感器?？偠灾?，GC-MS香味成分分析與電子鼻的分析結果是較為一致的，兩者的結合可以對干棗及其不同提取物的揮發(fā)性成分進行綜合分析。