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    低鈉鹽對不同成熟條件下自然發(fā)酵牦牛肉灌腸脂質(zhì)氧化及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

    2022-06-02 08:43:02唐善虎李思寧李瓊帥李錦錦夏佳軍蔡寅川
    食品科學(xué) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:牦牛肉鈉鹽恒溫

    莫 然,唐善虎,*,李思寧,李瓊帥,李錦錦,夏佳軍,蔡寅川

    (1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,四川 成都 610041;2.阿壩藏族羌族自治州工業(yè)經(jīng)濟(jì)研究所,四川 阿壩 624000)

    自然發(fā)酵牦牛肉灌腸是四川西部及藏族聚居地區(qū)常見的民族特色肉制品,因其獨(dú)特的口感和較長的貯藏期備受消費(fèi)者青睞。隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展以及加工過程中參數(shù)的嚴(yán)格控制,自然發(fā)酵香腸成為發(fā)酵肉制品中產(chǎn)量最大的產(chǎn)品之一。

    傳統(tǒng)的自然發(fā)酵牦牛肉灌腸為冬季將絞碎的牦牛肉、鹽、糖或其他香辛料等混合灌入天然腸衣中,懸掛于通風(fēng)處,采用自然成熟的方式制得。傳統(tǒng)自然發(fā)酵工藝通常成熟時(shí)間較長,而現(xiàn)代加工技術(shù)的運(yùn)用以及采用恒溫成熟方式,大大縮短了成熟時(shí)間。然而,發(fā)酵灌腸一般添加了較多的鹽促進(jìn)脫水,以達(dá)到控制微生物穩(wěn)定性的目的,但是過度攝入食鹽會導(dǎo)致一些健康問題,如高血壓和心血管疾病等。世界衛(wèi)生組織建議每日最多攝入2 g鈉,相當(dāng)于5 g NaCl。因此,在肉制品中直接降低NaCl添加量,是一種有效降低產(chǎn)品中鈉含量的策略。

    脂質(zhì)的水解和氧化是灌腸加工過程中常見的反應(yīng),肌肉組織內(nèi)磷脂是主要的風(fēng)味前體物質(zhì),可以通過脂肪酶和微生物作用水解生成以亞麻酸、亞油酸和花生四烯酸為主要成分的多不飽和脂肪酸,不穩(wěn)定的雙鍵容易氧化,產(chǎn)生一系列的氧化產(chǎn)物,包括醛、酮、醇。脂質(zhì)氧化是自然發(fā)酵牦牛肉灌腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要來源之一,在生產(chǎn)加工中適度的脂質(zhì)氧化有利于產(chǎn)品風(fēng)味形成,而過度的脂質(zhì)氧化則會引起肉制品酸敗,產(chǎn)生令人不愉快的氣味,甚至影響消費(fèi)者的健康。灌腸的脂質(zhì)氧化受加工時(shí)間、溫度、NaCl濃度等因素影響。Sharedeh等探討不同水平NaCl對鹵制牛肉脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)增加NaCl水平對脂質(zhì)有顯著保護(hù)作用。Zhao Shilin等研究不同含量鹽對肌肉組織中甘油三酯水解酶活性以及脂質(zhì)水解的影響,發(fā)現(xiàn)隨著鹽含量增加,甘油三酯水解酶活性先升高后降低,鹽添加量3%為拐點(diǎn)。Sidira等報(bào)道不同腌制鹽濃度對干發(fā)酵香腸中揮發(fā)性化合物的影響,發(fā)現(xiàn)降低腌制鹽含量會導(dǎo)致成熟過程中酯類和有機(jī)酸含量顯著增加。

    目前有關(guān)現(xiàn)代和傳統(tǒng)兩種成熟方式對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸成熟過程中脂質(zhì)氧化的研究鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)?zāi)M傳統(tǒng)自然成熟和現(xiàn)代恒溫成熟兩種方式,研究降低NaCl添加量對灌腸脂質(zhì)氧化以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響,以期闡明NaCl對脂質(zhì)氧化調(diào)控機(jī)制,為開發(fā)低鹽自然發(fā)酵牦牛肉灌腸提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    牦牛肉購于四川省阿壩州紅原縣永源牦牛肉業(yè)有限責(zé)任公司,牦牛在紅原縣進(jìn)行集中屠宰,取背長肌,經(jīng)冷卻排酸、急凍處理后,-4 ℃運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室貯藏于-20 ℃環(huán)境中;新鮮豬肥膘、天然豬腸衣購于武侯區(qū)洗面橋橫街菜市場;食鹽、曲酒、味精、白砂糖、花椒粉、辣椒粉均為食品級購于武侯區(qū)洗面橋街步步高超市。

    氫氧化鉀、碘化鉀、硫代硫酸鈉、沒食子酸、水楊酸、硫酸亞鐵、甲醇、環(huán)己烷、三氯甲烷均為分析純成都市科隆化工試劑廠;亞油酸(純度>97.0%,色譜純) 上海麥克林生化科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦味酰肼(純度>98.0%,色譜純) 上海阿拉丁試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;PHS-3C酸度計(jì)、UV1810S紫外分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司;Centrifuge 5804R高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司;T-25高速勻漿機(jī) 德國IKA公司;TRACE DSQ II型氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀 美國Thermo公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

    1.3 方法

    1.3.1 牦牛肉灌腸制備

    牦牛肉4 ℃解凍后剔除筋膜、筋腱,豬肥膘去皮,洗凈曬干水分,將牦牛肉與豬肥膘按質(zhì)量比8∶2切成均勻條狀,按表1加入輔料,腌制2 h后,使用6 mm孔板絞肉機(jī)將肉絞碎,進(jìn)行灌腸。用溫?zé)崴疀_洗表面,瀝干水分,用注射器均勻戳洞排氣,放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵,溫度25 ℃,時(shí)間2 d,之后自然成熟組掛于通風(fēng)處成熟干燥,在第1、5、9、13、17天測定pH值、水分含量、酸價(jià)、過氧化值(peroxide value,POV)、共軛二烯值、硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substances,TBARS)值、脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)活力,在第1、17天測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);恒溫成熟組繼續(xù)置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中成熟干燥,在第1、3、5、7、9天測定pH值、水分含量、酸價(jià)、POV、共軛二烯值、TBARS值、LOX活力,在第1、9天測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

    表1 實(shí)驗(yàn)灌腸配方設(shè)計(jì)Table 1 Seasoning formulations used in sausages

    1.3.2 pH值的測定

    參考Vidal等的方法,使用pH計(jì)進(jìn)行測定。取5.0 g絞碎樣品與45 mL蒸餾水混合,振搖0.5 min后浸提30 min,取濾液用pH計(jì)測定樣品pH值。

    1.3.3 水分含量的測定

    按GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法測定。

    1.3.4 酸價(jià)的測定

    參考Safa等的方法,并作適當(dāng)修改。稱取10 g混勻試樣,置于錐形瓶中,加入20 mL中性乙醚-乙醇(2∶1,/)),振搖,溫?zé)崾蛊淙芙?。冷卻至室溫,加入酚酞指示液2~3 滴,以氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液(0.050 mol/L)滴定,至出現(xiàn)微紅色且0.5 min內(nèi)不褪色為終點(diǎn),以消耗氫氧化鉀標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液體積為當(dāng)量計(jì)算酸價(jià)。

    1.3.5 POV的測定

    參考GB 5009.227—2016《食品中過氧化值的測定》中的滴定法測定。

    1.3.6 共軛二烯值的測定

    參考Folch等的方法進(jìn)行提取,將灌腸絞碎,混合均勻,稱取20 g樣品,加入100 mL氯仿-甲醇(2∶1,/),4 000 r/min勻漿60 s,靜置,真空抽濾后再用雙層濾紙過濾,濾液移至分液漏斗中,加入20 mL 0.9% NaCl溶液,搖晃5 min,靜置3 h,下層液體移入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀燒瓶,50 r/min、45 ℃真空干燥,得到油脂純品。

    參考張凱歌的方法,取250 μg抽提脂肪,用2 mL環(huán)已烷溶解,分別測定232、215 nm波長處吸光度,以/表示共軛二烯值。

    1.3.7 TBARS值的測定

    參考Jongberg等的方法,并稍作修改。準(zhǔn)確稱取10 g樣品,加入7.5%三氯乙酸溶液(含0.1%沒食子酸、0.1%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)-二鈉)30 mL,于70 ℃水浴30 min,濾紙過濾。吸取7 mL濾液,加入0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液5 mL,沸水浴反應(yīng)40 min,迅速冷卻后,在532、600 nm波長處測定吸光度。按式(1)計(jì)算TBARS值:

    式中:為樣品溶液體積/mL;為丙二醛摩爾質(zhì)量(72.06 g/mol);為稱量樣品質(zhì)量/g;為光程/cm;為摩爾消光系數(shù)(152 000 L/(mol·cm))。

    1.3.8 抗氧化能力的測定

    1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除能力測定:參考Najafian等的方法稍作修改。稱取0.1 g(精確至0.001 g)絞碎肉樣放于50 mL離心管中,加入10 mL DPPH自由基工作液,在高速勻漿機(jī)中以7 000 r/min勻漿1 min。勻漿結(jié)束后將離心管放于振蕩器上,室溫條件下避光反應(yīng)30 min,使反應(yīng)充分。然后4 ℃離心(10 000×,10 min),取離心管中間澄清層,在517 nm波長下測定其吸光度。以體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液作為空白對照,并在相同條件下測定未加樣品提取液的DPPH溶液吸光度。按式(2)計(jì)算DPPH自由基清除率:

    羥自由基清除能力測定:參考周常義等的方法稍作修改,稱取0.1 g(精確至0.001 g)絞碎肉樣放于50 mL離心管中,加入10 mL 6 mmol/L FeSO溶液、10 mL 6 mmol/L HO溶液,在高速勻漿機(jī)中7 000 r/min勻漿1 min。勻漿結(jié)束后將離心管放于振蕩器上,室溫條件下避光反應(yīng)1 h,使反應(yīng)充分。再加入10 mL 6 mmol/L水楊酸溶液,混勻后靜置30 min,在510 nm波長處測定吸光度,去離子水代替水楊酸溶液測得吸光度,空白對照組以去離子水代替肉樣測定吸光度。按式(3)計(jì)算羥自由基清除率:

    1.3.9 LOX活力的測定

    參考Bian Huan和Yang Yang等的方法。將2 g切碎樣品稱質(zhì)量后放入試管中,在30 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(含1 mmol/L的二硫蘇糖醇和1 mmol/L EDTA溶液,pH 7.0)中冰浴均質(zhì),勻漿4 次,每次10 s,勻漿于4 ℃離心(18 000×,30 min),收集上清液,將得到的上清液分別用4 層紗布和濾紙混合過濾,收集粗LOX。

    取0.2 mL亞油酸鈉底物與2.9 mL 50 mmol/L檸檬酸緩沖溶液(pH 5.5)混合,于20 ℃水浴中保溫并使其快速恒溫,待其在234 nm處吸光度穩(wěn)定后,加入0.1 mL粗酶液,迅速混合均勻于20 ℃、234 nm波長處測其1 min內(nèi)吸光度的增加量。

    1.3.10 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

    參考吳倩蓉等的方法并作適當(dāng)修改。取2.5 g絞碎樣品放入頂空瓶并壓蓋。50 ℃平衡30 min,固相微萃取針頭插入頂空瓶中萃取10 min,再插入GC-MS進(jìn)樣器,進(jìn)樣口溫度220 ℃,解吸時(shí)間10 min。

    GC條件:TG-WaxMS B色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣He,色譜柱起始溫度50 ℃,保持2 min,先以15 ℃/min升至100 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至220 ℃,恒定流速1.0 mL/min。

    MS條件:GC-MS接口溫度220 ℃,掃描范圍45~450 u。

    定性、定量分析:所有化合物經(jīng)NIST 11譜庫檢索,選擇正反向匹配值均大于800的化合物進(jìn)行定性分析;根據(jù)相對峰面積對化合物進(jìn)行定量分析。

    1.4 數(shù)據(jù)處理

    用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與計(jì)算;運(yùn)用SPSS 25軟件中的描述統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差,并進(jìn)行方差分析,用Duncan多重比較進(jìn)行差異顯著性分析,對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行主成分分析(principal component analysis,PCA),用Origin 2018軟件作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 低鈉鹽對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸水分含量的影響

    由圖1可知,隨著成熟時(shí)間延長,牦牛肉灌腸的水分含量均顯著下降(<0.05)。在兩種成熟方式中,低鈉鹽灌腸的水分含量均低于對照組(<0.05),這可能與NaCl對鹽溶性蛋白的溶出作用有關(guān),較高的NaCl添加比例有利于肉糜形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),因此水分含量束縛能力較強(qiáng),不易外散??傮w來說,自然成熟組較恒溫成熟組的水分含量低,可能是由環(huán)境溫差以及氣流變化程度引起,自然成熟組所處環(huán)境的溫度及氣流不穩(wěn)定,提高了灌腸表面與空氣之間傳熱傳質(zhì)的動(dòng)力,表面?zhèn)髻|(zhì)加快,從而加快了其水分含量下降速率。

    圖1 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸成熟過程中水分含量的變化Fig.1 Changes in moisture content in naturally fermented yak meat sausage during maturation

    2.2 低鈉鹽對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸pH值的影響

    由圖2可知,4 組自然發(fā)酵牦牛肉灌腸的pH值均呈先下降后上升的趨勢。這是由于在前期,原料以及環(huán)境中的微生物在適宜的溫度、濕度下生長繁殖,大量產(chǎn)酸,導(dǎo)致灌腸pH值降低;后期隨著成熟的進(jìn)行,灌腸中水分含量降低,不利于微生物的生長繁殖;且伴隨著肌肉蛋白質(zhì)氧化,堿性胺類化合物的生成以及脂質(zhì)氧化,一些堿性或者中性分解物產(chǎn)生,導(dǎo)致pH值上升。除第0天,其余時(shí)間點(diǎn)兩種成熟方式灌腸的pH值均為低鈉鹽組顯著高于對照組(<0.05),這可能與灌腸的脂質(zhì)氧化情況相關(guān),隨著成熟的進(jìn)行低鈉鹽組的脂質(zhì)氧化程度高于對照組,一些堿性分解物的產(chǎn)生導(dǎo)致灌腸pH值上升。

    圖2 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸成熟過程中pH值的變化Fig.2 Changes in pH of naturally fermented yak meat sausage during maturation

    2.3 低鈉鹽對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸抗氧化活性的影響

    如表2所示,恒溫成熟方式中兩組灌腸的DPPH自由基清除率整體隨時(shí)間延長呈上升趨勢,這是由于成熟后期蛋白質(zhì)水解程度增大,具有疏水活性的小分子多肽含量增多,因而對DPPH自由基親和能力增強(qiáng)。自然成熟方式中兩組灌腸的DPPH自由基清除率在前期無顯著變化,而在9 d后顯著下降(<0.05),可能是由于隨成熟時(shí)間的延長,具有抗氧化活性的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物進(jìn)一步氧化。兩種成熟方式下,前期低鈉鹽組DPPH自由基清除率低于對照組,這可能與鹽含量有關(guān),發(fā)酵成熟過程中抗氧化活性成分與含食鹽的食品基質(zhì)間的相互作用有利于生物活性的維持。在后期,低鈉鹽組與對照組DPPH自由基清除率無顯著差異(>0.05)。欒曉旭等研究發(fā)現(xiàn),NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~10%時(shí),NaCl對發(fā)酵香腸DPPH自由基清除率無顯著影響。因此,成熟后期牦牛肉灌腸水分含量降低,鹽含量相對增大,超過一定濃度后,影響程度降低。

    如表2所示,恒溫成熟方式中兩組灌腸的羥自由基清除率隨時(shí)間延長呈先下降后上升的趨勢,而自然成熟方式中兩組灌腸的羥自由基清除率隨時(shí)間延長呈先上升后下降的趨勢。第1天羥自由基清除率較高,主要由于發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生的抗氧化活性物質(zhì),而成熟過程中,水分散失、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的抗氧化活性小分子多肽、氨基酸等物質(zhì)富集,這些活性物質(zhì)的濃度變化促使羥自由基清除率呈先降低后升高變化。自然發(fā)酵灌腸由于成熟時(shí)間較長,第9天后羥自由基清除率顯著下降,這與DPPH自由基清除率的變化情況一致??偟膩碚f,兩組成熟方式中,低鈉鹽組灌腸的羥自由基清除率顯著低于對照組(<0.05)。

    表2 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸成熟過程中抗氧化能力的變化Table 2 Changes in antioxidant capacity of naturally fermented yak meat sausage during maturation

    2.4 低鈉鹽對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸酸價(jià)的影響

    酸價(jià)表示樣品中游離脂肪酸總量,是衡量肉制品酸敗的常用指標(biāo)之一。由圖3可知,4 組灌腸的酸價(jià)均隨時(shí)間延長呈顯著上升趨勢(<0.05),主要是由于脂肪水解生成游離脂肪酸。成熟前期,兩種成熟方式中的低鈉鹽組和對照組的酸價(jià)均無顯著差異(>0.05);而成熟后期,兩種成熟方式低鈉鹽組的酸價(jià)均顯著高于對照組(<0.05)。這說明鹽含量對自然發(fā)酵灌腸脂質(zhì)水解有一定影響,這與Safa等的研究結(jié)果一致。脂質(zhì)水解主要由胴體內(nèi)脂水解酶作用,而NaCl添加使脂水解酶活性受到抑制。楊紅菊研究發(fā)現(xiàn),NaCl對干腌火腿中磷脂水解酶有顯著抑制作用,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%可將酶活性降至76%。因此,對照組酸價(jià)較低鈉鹽組低。

    圖3 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸成熟過程中酸價(jià)的變化Fig.3 Changes in acid value in naturally fermented yak meat sausage during maturation

    2.5 低鈉鹽對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸脂肪氧化的影響

    脂質(zhì)氧化屬于自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),初始氧化產(chǎn)物氫過氧化物非常不穩(wěn)定,易氧化產(chǎn)生一些有害小分析化合物,如醛、酮等。由圖4A可知,隨時(shí)間延長,恒溫成熟方式中兩組灌腸POV均呈先上升后下降趨勢,而自然成熟方式中兩組灌腸POV均呈上升趨勢。若氫過氧化物的生成速率小于其分解速率,則氫過氧化物含量減少,POV下降。兩種成熟方式中低鈉鹽組灌腸POV整體高于對照組(<0.05),說明兩種成熟方式中低鈉鹽灌腸的脂質(zhì)初級氧化情況較對照組更為嚴(yán)重。

    共軛二烯值表示不飽和脂肪酸中共軛雙鍵數(shù)目,反映了氫過氧化物的進(jìn)一步分解。由圖4B可知,共軛二烯值隨時(shí)間的變化趨勢與POV相似。恒溫成熟方式中兩組灌腸共軛二烯值除第3天存在顯著差異(<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)低鈉鹽組與對照組均無顯著差異(>0.05);而自然成熟方式中兩組灌腸的共軛二烯值除第13天差異顯著(<0.05),其余時(shí)間點(diǎn)均無顯著差異(>0.05)。這說明2%和4%的食鹽添加量對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸不飽和脂肪酸的氧化情況影響不顯著。

    TBARS值是評價(jià)肉制品脂質(zhì)氧化程度最合適的指標(biāo)。由圖4C可知,4 組灌腸TBARS值均隨時(shí)間延長呈顯著上升趨勢(<0.05),在發(fā)酵前期1~5 d,兩種成熟方式低鈉鹽組和對照組TBARS值無顯著差異(>0.05);而成熟后期,兩種成熟方式低鈉鹽組TBARS值均顯著高于對照組(<0.05),這與柴子惠等的結(jié)果一致。表明成熟后期食鹽添加量降低至2%的灌腸脂質(zhì)氧化情況加劇。

    圖4 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸成熟過程中脂質(zhì)氧化的變化Fig.4 Changes of lipid oxidation in naturally fermented yak meat sausage during maturation

    分析POV、共軛二烯值以及TBARS值結(jié)果可知,成熟結(jié)束時(shí),自然成熟灌腸脂質(zhì)氧化情況為恒溫成熟灌腸的2 倍以上,成熟時(shí)間的延長,以及光、熱等環(huán)境條件的變化,共同促使脂質(zhì)氧化情況加劇。研究表明肉制品中加入食鹽可以增強(qiáng)脂質(zhì)氧化,其能夠從血紅素結(jié)合蛋白中釋放鐵,并抑制抗氧化酶活性,如過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶。但本實(shí)驗(yàn)兩種成熟方式中,低鈉鹽組和對照組共軛二烯值整體無顯著差異(>0.05),低鈉鹽組的POV、TBARS值均顯著高于對照組(<0.05),這可能是由于對照組鈉鹽含量較高,對脂肪水解酶和脂肪氧化酶的活性產(chǎn)生了抑制作用,從而能抑制灌腸中的脂質(zhì)氧化分解,因此低鈉鹽組的脂質(zhì)氧化情況優(yōu)于對照組。由此推測,在一定濃度范圍內(nèi)食鹽對肉制品脂質(zhì)具有促氧化作用,這與Sharedeh等的結(jié)論一致。

    2.6 低鈉鹽對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸LOX活力的影響

    LOX是一種非血紅素含鐵脂肪酸雙加氧酶,廣泛分布于植物、動(dòng)物和微生物中。由圖5可知,兩種成熟方式的灌腸的LOX活性呈相同的變化趨勢,前期LOX活性顯著上升(<0.05),后期顯著下降(<0.05)。這與Huang Yechuan等的研究結(jié)果相似。這可能與NaCl濃度有關(guān),前期水分含量高,Cl在低濃度下能夠保持LOX的親水抑制位點(diǎn),減少底物與抑制位點(diǎn)的結(jié)合,使可用底物相對活性位點(diǎn)增加,從而導(dǎo)致反應(yīng)速率增加;后期水分含量降低,離子濃度增大,高濃度NaCl會破壞LOX的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),從而顯著降低LOX活性。自然成熟組灌腸的低鈉鹽組和對照組LOX活性整體無顯著差異(>0.05),恒溫成熟方式1~5 d低鈉鹽組和對照組之間LOX活性無顯著差異(>0.05),而7~9 d低鈉鹽組顯著高于對照組(<0.05),這說明NaCl含量對LOX活性有一定的影響。事實(shí)上,實(shí)驗(yàn)為在酶最適條件下進(jìn)行活力測定,因此所測酶活力為其潛在活力,而不是生產(chǎn)過程中所表現(xiàn)的實(shí)際活力。

    圖5 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸成熟過程中LOX活力的變化Fig.5 Changes in lipoxygenase activity in naturally fermented yak meat sausage during maturation

    2.7 低鈉鹽對自然發(fā)酵牦牛肉灌腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

    2.7.1 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸揮發(fā)性風(fēng)味成分檢測結(jié)果

    自然發(fā)酵牦牛肉灌腸的特有風(fēng)味主要來源于成熟過程中在原料中微生物和內(nèi)源性酶作用下碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)水解、脂類水解和氧化產(chǎn)生的揮發(fā)性和非揮發(fā)性化合物。由表3可知,從發(fā)酵牦牛肉灌腸中共檢測出69 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),其中醇類18 種、醛類4 種、酮類7 種、烯類13 種、酯類18 種、酸類3 種、其他物質(zhì)6 種。

    表3 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸揮發(fā)性風(fēng)味成分及相對含量Table 3 Relative contents of volatile flavor components in naturally fermented yak meat sausage

    續(xù)表3

    醇類物質(zhì)檢出種類較多。第1天時(shí)低鈉鹽組香芹醇含量顯著高于對照組(<0.05),其余醇類物質(zhì)含量無顯著差異(>0.05)。在發(fā)酵牦牛肉灌腸中,醇類物質(zhì)主要來源于配料中的曲酒以及微生物代謝作用。第9天時(shí),恒溫成熟對照組中2,3-丁二醇含量為(3.88±0.98)%,為曲酒中主要成分,并且-松油醇含量顯著高于低鈉鹽組,對照組醇類物質(zhì)總含量為15.87%,高于低鈉鹽組的11.15%。第17天時(shí),自然成熟低鈉鹽組醇類物質(zhì)含量為22.75%,遠(yuǎn)高于對照組的12.77%。Shahidi等指出除乙醇外的大部分醇類物質(zhì)均來源于脂質(zhì)氧化。

    醛類物質(zhì)檢出種類較少,共4 種。低鈉鹽組醛類物質(zhì)含量均高于對照組。第9天成熟結(jié)束時(shí),恒溫成熟的兩組灌腸中醛類物質(zhì)的種類及含量無顯著差異(>0.05)。醛類物質(zhì)是脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的特征風(fēng)味產(chǎn)物之一,由于其閾值較低,即使少量情況下也會顯著影響肉制品香氣。第17天時(shí),自然成熟低鈉鹽組灌腸的4-異丙基苯甲醛和正己醛含量均顯著高于對照組(<0.05),且檢出苯甲醛。正己醛主要由不飽和脂肪酸過氧化反應(yīng)產(chǎn)生,而苯甲醛由苯丙氨酸經(jīng)Strecker降解產(chǎn)生,低鈉鹽處理顯著增加了醛類物質(zhì)含量,這說明2%食鹽添加量的自然成熟牦牛肉灌腸較4%食鹽添加量灌腸的脂質(zhì)氧化程度更高,這與POV、TBARS值結(jié)果一致。

    在第1天時(shí)灌腸中檢出5 種酯類,但在第9天恒溫成熟結(jié)束時(shí),庚酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸龍腦酯、1-萜品-4-基乙酸酯這些初期檢出的酯類未檢出,而一些新的短鏈脂肪酸乙酯(如乙酸乙酯、異丁酸乙酯、丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯)被檢出。酯類物質(zhì)由醇和酸經(jīng)酯化反應(yīng)生成,多呈芳香味,其中短鏈脂肪酸形成的酯類多呈水果香,長鏈脂肪酸形成的酯類多呈較淡的油脂味,因此酯類對灌腸的風(fēng)味形成有一定貢獻(xiàn)作用。第17天自然成熟結(jié)束時(shí),酯類種類及含量較第1天明顯增加,低鈉鹽組酯類含量為17.64%,對照組含量為10.09%。這可能是由于隨時(shí)間延長,灌腸中的脂肪發(fā)生酶水解,生成較多的游離脂肪酸,在微生物的酯化作用下形成酯類。低鈉鹽組酯類物質(zhì)含量較對照組高,表明低鈉鹽灌腸中產(chǎn)酯酶微生物活性更大。

    本實(shí)驗(yàn)中烯類物質(zhì)檢出種類也較多,1、9、17 d低鈉鹽組烯類物質(zhì)含量均高于對照組。烯類物質(zhì)是揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要組成部分,主要源自香料。有研究表明,萜烯氣味閾值較低,是最影響發(fā)酵香腸芳香氣味的主要揮發(fā)性化合物之一。如-蒎烯、-松油烯、-石竹烯等源自辣椒,(-)--蒎烯、別羅勒烯等為花椒的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

    有機(jī)酸主要來源于微生物在發(fā)酵過程中的碳水化合物代謝。本實(shí)驗(yàn)采取自然發(fā)酵方式,未接種菌種,因此,檢出的有機(jī)酸種類較少,僅在發(fā)酵第1天檢出較多。此外,酮類物質(zhì)檢出也相對較少,其感覺閾值較高,對灌腸特征風(fēng)味的形成影響較小,因此對香氣的貢獻(xiàn)可以忽略。而烷類、苯類、醚類、胺類這些物質(zhì),僅在部分樣品中檢出,且感覺閾值高,不屬于揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的主要貢獻(xiàn)者,也可忽略不計(jì)。

    2.7.2 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的PCA

    為選擇代表性成分反映自然發(fā)酵牦牛肉灌腸的整體風(fēng)味,采用降維方式將表3的7 類物質(zhì)進(jìn)行PCA,提取特征根大于1的PC,共有3 個(gè)PC,PC1、PC2、PC3的貢獻(xiàn)率分別為49.766%、24.009%、22.431%,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)96.206%,因此這3 個(gè)PC能夠較好地反映灌腸中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的變化。因子載荷分析圖中的載荷絕對值可以直觀表現(xiàn)該物質(zhì)對該P(yáng)C的貢獻(xiàn),絕對值越大,貢獻(xiàn)率越大。由圖6可知,PC1由醛類、酯類、其他物質(zhì)構(gòu)成;PC2由酸類、醇類物質(zhì)構(gòu)成;PC3由酮類、烯類物質(zhì)構(gòu)成。

    圖6 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的因子載荷分析圖Fig.6 PCA loading plot of volatile flavor compounds in naturally fermented yak meat sausage

    由圖7可知,各樣品在不同PC上的得分情況。第1天低鈉鹽組和對照組在PC2上得分最高,主要是由酸類、醇類物質(zhì)構(gòu)成。第9天恒溫成熟灌腸,低鈉鹽組在PC2上得分最高,對照組在PC3上得分最高,說明直接減少鈉鹽對灌腸的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量有一定影響。除乙醇外,大部分醇類物質(zhì)與脂質(zhì)氧化密切相關(guān),這說明恒溫成熟方式下,低鈉鹽組的主要風(fēng)味物質(zhì)來源于脂質(zhì)氧化,對照組的主要風(fēng)味物質(zhì)來源于花椒、辣椒粉等配料。第17天自然成熟灌腸,低鈉鹽組在PC1上得分最高,PC1中醛類、酯類、其他物質(zhì)貢獻(xiàn)率最大,其中醛類是脂質(zhì)氧化的主要產(chǎn)物之一;而對照組在PC3上得分最高,與恒溫成熟對照組相同。綜上所述,在后期,兩種成熟方式灌腸低鈉鹽組的主要風(fēng)味物質(zhì)由醛類、醇類等脂質(zhì)氧化產(chǎn)物構(gòu)成,進(jìn)一步說明灌腸中食鹽添加量降低到2%可能會增加灌腸的脂質(zhì)氧化情況。

    圖7 自然發(fā)酵牦牛肉灌腸各樣品PCA得分散點(diǎn)圖Fig.7 PCA score scatter plot of naturally fermented yak meat sausages at different ripening times

    3 結(jié)論

    不同鈉鹽含量對兩種成熟方式發(fā)酵牦牛肉灌腸的脂質(zhì)水解、氧化有顯著影響。當(dāng)鈉鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)由4%降低至2%時(shí),低鈉鹽灌腸水分含量均低于對照組,而pH值高于對照組;隨鈉鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)由4%降低至2%,灌腸脂質(zhì)水解、氧化程度增加,而灌腸體系抗氧化能力下降。從灌腸中共檢出69 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),得到醇、醛、酯、烯、酸、酮、其他物質(zhì)等7 大類成分,采用PCA得到3 個(gè)PC,累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)96.206%,PCA表明,第9天和第17天成熟結(jié)束,低鈉鹽組檢出的醇、醛等由脂質(zhì)氧化生成物質(zhì)的含量較對照組多。本實(shí)驗(yàn)對灌腸脂質(zhì)氧化指標(biāo)進(jìn)行較為全面的測定發(fā)現(xiàn),鈉鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)直接減少到2%對脂質(zhì)氧化有一定影響,不利于實(shí)際生產(chǎn)中灌腸品質(zhì)的保持,因此在后續(xù)研究中,應(yīng)嘗試其他方法,如加入抗氧化劑、使用替代鹽達(dá)到減鹽目的,并改善脂肪氧化情況。

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