乳桿菌發(fā)酵提高壇紫菜的抗氧化和抑制糖脂代謝關(guān)鍵酶活性

董玉婷，蔡宏浩，李志朋,3,4,5，鄭明靜,3,4,5，姜澤東,3,4,5,*，倪 輝,3,4,5，鄧尚貴，李清彪,3,4,5

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.集美大學(xué)理學(xué)院，福建 廈門 361021；3.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；4.大連工業(yè)大學(xué) 海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034；5.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；6.浙江興業(yè)集團，浙江 舟山 316014）

壇紫菜（）是福建省特色優(yōu)勢海洋藻類。福建省壇紫菜的產(chǎn)量約占全國總產(chǎn)量的50%。壇紫菜富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、氨基酸和礦物質(zhì)等營養(yǎng)元素，長期食用具有抗氧化、降血脂、降血壓、免疫調(diào)節(jié)等功效。目前，壇紫菜的精深加工產(chǎn)品較為缺乏，市場上主要以烘干制品（紫菜盤）、烘焙食品（烤海苔、夾心海苔）、速食湯品（紫菜湯）等形式流通，產(chǎn)品附加值低；同時，上述制品在加工過程中往往需要高溫烘烤干制，會造成壇紫菜中一些熱敏性營養(yǎng)成分的破壞。因此，研發(fā)壇紫菜精深加工技術(shù)，充分發(fā)揮和利用壇紫菜的營養(yǎng)活性價值是目前需要迫切解決的重要產(chǎn)業(yè)問題。

乳桿菌是食品加工中最常見的益生菌。乳桿菌菌株如嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌等因其具有優(yōu)良的發(fā)酵特性已被廣泛應(yīng)用于食品加工。研究表明乳桿菌發(fā)酵能夠促進植物基生物活性物質(zhì)的釋放，從而提高其生物活性，增強營養(yǎng)特性。劉金龍等利用植物乳桿菌發(fā)酵貝母-雪梨汁發(fā)現(xiàn)發(fā)酵有利于貝母細胞壁降解，促進總酚和總黃酮的釋放，增加了貝母-雪梨汁的抗氧化能力。另一方面，乳桿菌發(fā)酵可將食物中的初級底物轉(zhuǎn)化為具有功能性的物質(zhì)，增強其生物活性。茍擁軍等研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（）發(fā)酵產(chǎn)生的某些特殊酶類如淀粉酶、蛋白酶等可將蘋果漿中結(jié)合態(tài)多酚水解成游離態(tài)，提高游離多酚含量，進而提高蘋果漿的抗氧化性能。Li Songlin等利用干酪乳桿菌（）發(fā)酵大豆，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵可將大豆釋放的大豆異黃酮轉(zhuǎn)化成更易吸收的苷元形式，從而提升營養(yǎng)價值和生物活性。因此，乳桿菌發(fā)酵是改善食品的營養(yǎng)品質(zhì)和生物活性的重要加工技術(shù)手段，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。德氏乳桿菌和植物乳桿菌是食品科學(xué)研究領(lǐng)域常見的發(fā)酵菌株，目前已有許多研究報道了德氏乳桿菌和植物乳桿菌的益生活性及其在發(fā)酵食品中的應(yīng)用?；诖耍狙芯坎捎玫率先闂U菌和植物乳桿菌作為發(fā)酵劑對壇紫菜進行發(fā)酵，分析不同菌種發(fā)酵對發(fā)酵產(chǎn)物中主要活性成分的變化和生物活性（包括抗氧化活性、抑制胰脂肪酶和-葡萄糖苷酶活性）的影響，旨在為研發(fā)壇紫菜精深加工技術(shù)和高值健康食品提供前提基礎(chǔ)，促進壇紫菜養(yǎng)殖和加工產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

壇紫菜采集于福建省霞浦縣壇紫菜養(yǎng)殖海域，曬干后儲于陰涼處備用。德氏乳桿菌保加利亞亞種（subsp.CICC 6045）、植物乳桿菌植物亞種（subsp.CICC 6076）購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

MRS（de Man,Rogosa and Sharpe）肉湯培養(yǎng)基北京陸橋科技有限公司；胰脂肪酶（來源于豬胰腺，EC：3.1.1.3）、奧利司他 默克生命科學(xué)（上海）有限公司；-葡萄糖苷酶（來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌）、對硝基苯酚、4-硝基苯基---吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl---glucopyranoside，pNPG）、蘆丁美國Sigma-Aldrich公司；阿卡波糖 拜耳醫(yī)藥保?。ū本┯邢薰荆浑?上海麥克林生化科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J26XP高速冷凍離心機 德國貝克曼公司；Cytation-5酶標(biāo)儀 美國伯騰儀器有限公司；LA120S電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器廠；ZWYR-2102生化培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司；Free Zone 6 plus真空冷凍干燥機 美國Labconco公司；Avance III HD 600 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）波譜儀 美國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液的制備

將壇紫菜洗凈后，在60 ℃條件下干燥至質(zhì)量恒定。準(zhǔn)確稱取1 g干燥的壇紫菜，加入100 mL蒸餾水配制成懸濁溶液。向懸濁溶液中加入2%葡萄糖，攪拌均勻后65 ℃巴氏滅菌30 min。冷卻至室溫后，向懸濁溶液中分別添加5%（/）的德氏乳桿菌菌液或植物乳桿菌菌液（活菌數(shù)為10CFU/mL）作為發(fā)酵劑，37 ℃靜置發(fā)酵0、12、24、36、48 h和72 h，獲得兩種乳桿菌（德氏乳桿菌、植物乳桿菌）發(fā)酵壇紫菜產(chǎn)物。發(fā)酵結(jié)束后，壇紫菜發(fā)酵產(chǎn)物6 000×離心20 min，除去沉淀，經(jīng)過2.0 μm膜過濾，得到德氏乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液（fermented supernatant of，LDFP）和植物乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液（fermented supernatant of，LPFP）。未接種乳桿菌的壇紫菜懸濁溶液在相同條件下處理，得到未發(fā)酵的壇紫菜上清液（unfermented supernatant of，UNF），作為對照組。

1.3.2 總酚和總黃酮含量測定

采用福林-酚法測定各組樣品（UNF、LDFP和LPFP）中的總酚含量。取500 μL上述發(fā)酵上清液樣品于試管中，加入500 μL福林-酚顯色劑及1.5 mL 7.5% NaCO溶液后，用蒸餾水定至5 mL，混勻避光反應(yīng)2 h，用酶標(biāo)儀在波長765 nm處測定吸光度。以不同質(zhì)量濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01～0.10 mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線=0.010 4＋0.058 9，=0.999 8，其中為吸光度，為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）。每個樣品平行測定3 次，總酚含量表示為每毫升發(fā)酵上清液中含有沒食子酸當(dāng)量。

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定各組樣品（UNF、LDFP和LPFP）中的總黃酮含量。取2 mL樣品于試管中，加入200 mL的5%亞硝酸鈉溶液搖勻后靜置6 min，再加入200 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻后靜置6 min，再加入1 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，用無水乙醇定容至5 mL，振蕩搖勻后用酶標(biāo)儀在510 nm波長處測定吸光度。以不同質(zhì)量濃度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01～0.05 mg/mL）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線=0.005 6＋0.048 3，=0.999 2，其中為吸光度，為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（μg/mL）。所有樣品都平行測定3 次，總黃酮含量表示為每毫升乳桿菌發(fā)酵上清液中蘆丁當(dāng)量。

根據(jù)總酚和總黃酮的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵48 h后發(fā)酵液中的活性成分變化趨于穩(wěn)定，所以后續(xù)研究取發(fā)酵48 h的發(fā)酵上清液進行代謝組學(xué)分析和生物活性分析。

1.3.3 NMR分析

取發(fā)酵48 h的上清液樣品UNF、LDFP和LPFP（各50 mL）在－80 ℃、0 Pa真空度條件下冷凍干燥72 h。凍干的樣品分別用600 mL的氘代水溶解后，取500 mL轉(zhuǎn)移5 mm NMR管中，以0.2 mmol/L的重水內(nèi)標(biāo)DSS（sodium 2,2-dimethyl-2-silylpentane-5-sulfonate）作為內(nèi)參，在共振頻率為600.1 MHz NMR波譜儀中進行測定，每個樣品重復(fù)測定3 次，保證數(shù)據(jù)可靠性。

1.3.4 抗氧化活性測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipheny l-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的測定參照Yu Liangli等方法。各取1 mL樣品（UNF、LDFP和LPFP），分別加入1 mL 的DPPH 無水乙醇溶液（0.1 mmol/L），混合均勻后避光反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在517 nm波長處測定吸光度。對照組為蒸餾水代替樣品測得吸光度，計算各樣品的DPPH自由基清除率，VC作陽性對照，如式（1）所示：

2,2’-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基清除能力的測定參照Baqueiro-Pe?a等方法。將7 mmol/L的ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀（KSO）溶液等比例混合靜置過夜，用磷酸鹽緩沖液對其進行稀釋至在734 nm波長下吸光度為0.7±0.02，即獲得ABTS陽離子自由基工作液。分別取0.1 mL樣品（UNF、LDFP和LPFP）與1 mL ABTS陽離子自由基工作液混合處理后，在734 nm波長處測定吸光度。對照組為蒸餾水代替樣品測得吸光度，按照式（2）計算各樣品的ABTS陽離子自由基清除率：

羥自由基清除能力的測定參照蔣邊等方法。分別在離心管中依次加入0.5 mL樣品（UNF、LDFP和LPFP）溶液、0.5 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL 9 mmol/L FeSO溶液和0.5 mL 8.8 mol/L HO溶液，用去離子水定容至5 mL混合均勻后于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，在波長為510 nm條件下測定反應(yīng)溶液的吸光度。對照組為蒸餾水代替樣品測得吸光度，按式（3）計算各樣品的羥自由基清除率：

1.3.5 酶活力分析

1.3.5.1-葡萄糖苷酶活力抑制能力分析

參照Daub等方法測定各組樣品（UNF、LDFP和LPFP）對-葡萄糖苷酶活力的影響。分別將100 mL樣品（UNF、LDFP和LPFP）與250 mL-葡萄糖苷酶溶液（2 IU/mL）混合均勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中溫育10 min后，加入250 mL 5.0 mmol/L pNPG溶液起始反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)15 min后立即加入250 mL 1 mol/L NaCO溶液終止反應(yīng)，于405 nm波長下檢測溶液吸光度。以阿卡波糖作為陽性對照，利用在相同發(fā)酵條件下未添加壇紫菜的徳氏乳桿菌發(fā)酵上清液（fermented supernatant，LDF）和植物乳桿菌發(fā)酵上清液（fermented supernatant，LPF）作為樣品空白對照組，排除因乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)酸使酶失活的影響。每個實驗做3 個平行，按式（4）計算抑制率：

式中：、和分別表示反應(yīng)體系-葡萄糖苷酶＋樣品＋pNPG、樣品＋pNPG和-葡萄糖苷酶＋pNPG的吸光度。

1.3.5.2 胰脂肪酶活力抑制能力分析

參照詹慧等方法測定各組樣品（UNF、LDFP和LPFP）對胰脂肪酶活力的影響。分別將100 mL樣品和100 mL胰脂肪酶溶液（1 000 IU/mL）混合均勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中溫育15 min后立即加入200 mL對硝基苯磷酸鹽（-nitrophenyl phosphate，pNPP）溶液（2.0 mmol/L），再次放入37 ℃恒溫水浴鍋中溫育15 min。反應(yīng)結(jié)束后，立即放置于100 ℃水浴5 min以終止反應(yīng)。終止后的反應(yīng)液5 000×離心5 min取上清液，于405 nm波長下檢測溶液吸光度。以奧利司他作為陽性對照，每個實驗做3 個平行，抑制率計算同式（4），其中，、和分別表示反應(yīng)體系中胰脂肪酶＋樣品＋pNPP、樣品＋pNPP和胰脂肪酶＋pNPP的吸光度。

1.3.5.3 酶促反應(yīng)動力學(xué)分析

酶促反應(yīng)動力學(xué)分析參照文獻[23-25]方法。取200 mL不同濃度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 IU/mL）的-葡萄糖苷酶溶液或200 mL不同濃度（0、200、400、600、800 IU/mL）的胰脂肪酶溶液，在各組溶液中分別加入200 mL的各乳桿菌發(fā)酵上清液（抑制劑組）混勻，置于37 ℃反應(yīng)10 min（在相同條件下加入200 mL反應(yīng)緩沖液替代乳桿菌發(fā)酵上清液作為無抑制劑組）。對-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)分析，加入250 mL 5.0 mmol/L pNPG溶液作為反應(yīng)底物，37 ℃靜置反應(yīng)10 min后，100 ℃水浴5 min終止反應(yīng)，于450 nm波長下測定各反應(yīng)體系吸光度；對胰脂肪酶的酶促反應(yīng)動力學(xué)分析，加入400 mL的2 mmol/L pNPP溶液作為反應(yīng)底物，37 ℃靜置反應(yīng)10 min后，100 ℃水浴5 min終止反應(yīng)，于405 nm波長下測定各反應(yīng)體系吸光度；以橫坐標(biāo)為酶液濃度，縱坐標(biāo)為反應(yīng)速率，繪制酶促反應(yīng)動力學(xué)曲線。在100 mL固定濃度的-葡萄糖苷酶溶液（2 IU/mL）或胰脂肪酶溶液（500 IU/mL）中分別加入100 mL發(fā)酵上清液（抑制劑組）或加入反應(yīng)緩沖液（無抑制劑組）混勻。對-葡萄糖苷酶的酶促反應(yīng)類型分析，上述-葡萄糖苷酶溶液與發(fā)酵上清液混合體系中分別加入200 mL不同濃度的pNPG溶液（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L）在37 ℃靜置反應(yīng)10 min，終止反應(yīng)后，于450 nm波長下測定各反應(yīng)體系的吸光度；對胰脂肪酶的酶促反應(yīng)類型分析，上述胰脂肪酶溶液與發(fā)酵上清液混合體系中分別加入200 mL不同濃度的pNPP溶液（0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L）在37 ℃靜置反應(yīng)10 min，終止反應(yīng)后，于405 nm波長處測定各反應(yīng)體系的吸光度。以橫坐標(biāo)為反應(yīng)底物（pNPG）濃度的倒數(shù)1/[]，縱坐標(biāo)設(shè)定為反應(yīng)速率的倒數(shù)（1/），繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，判斷酵壇上清液對-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制類型。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個實驗重復(fù)3 次獨立平行實驗，每個實驗做3 個平行（=3），實驗數(shù)據(jù)利用Microsoft Excel、MestReNova軟件處理后用Graphpad prism 8.0作圖，采用SPSS 17.0軟件進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜過程中發(fā)酵上清液總酚含量的變化

如圖1所示，在0～72 h連續(xù)發(fā)酵過程中，兩種乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液（LDFP與LPFP）和UNF中的總酚含量均隨著發(fā)酵時間的延長而顯著增加（＜0.05），并且在發(fā)酵開始后LDFP組與LPFP組中的總酚含量顯著高于UNF組（＜0.05）。另外，在發(fā)酵的12～36 h，LPFP組中的總酚含量顯著高于LDFP組。以上結(jié)果表明，德氏乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵均能夠顯著提高壇紫菜發(fā)酵上清液的總酚含量。

圖1 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜過程中上清液總酚含量的變化Fig.1 Changes in total polyphenols content in P.haitanensis during fermentation

2.2 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜過程中發(fā)酵上清液中總黃酮含量的變化

如圖2所示，在0～72 h連續(xù)發(fā)酵過程中，LDFP組與LPFP組的總黃酮含量隨著發(fā)酵時間的延長呈先增加后下降的趨勢，對照組UNF中總黃酮含量在整個發(fā)酵過程中無顯著變化。同時，在發(fā)酵的0～24 h，LPFP組中總黃酮含量顯著高于LDFP組（＜0.05），而在后續(xù)發(fā)酵的36～72 h則呈相反的趨勢，即LDFP組中總黃酮含量顯著高于LPFP組（＜0.05）。另外，研究發(fā)現(xiàn)不同乳桿菌菌種對發(fā)酵釋放總黃酮的能力具有差異；LDFP組中總黃酮增幅最大，當(dāng)發(fā)酵達到48 h其總黃酮質(zhì)量濃度達到（22.8±1.4）μg/mL，相比UNF組增加了（1.4±0.07）倍，而LPFP組中總黃酮質(zhì)量濃度在發(fā)酵24 h達到最大值為（21.9±1.3）μg/mL，相比于對照組增加了（1.3±0.1）倍。以上結(jié)果表明，德氏乳桿菌和植物乳桿菌發(fā)酵均能夠顯著提高壇紫菜發(fā)酵上清液的總黃酮含量，并且植物乳桿菌發(fā)酵相比德氏乳桿菌能更快促使總黃酮的釋放。

圖2 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜過程中上清液總黃酮含量的變化Fig.2 Changes in total flavonoids content in P.haitanensis during fermentation

2.3 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液中代謝產(chǎn)物的變化

NMR波譜分析具有高重現(xiàn)性、無偏向性和無損傷性等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于對代謝產(chǎn)物進行快速、準(zhǔn)確、高效的定性定量檢測。壇紫菜上清液中代謝組產(chǎn)物分析結(jié)果如圖3所示。根據(jù)H NMR數(shù)據(jù)和相關(guān)文獻，在UNF組上清液中鑒定出12 種化合物，如表1所示。乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液中含量最多的是半乳糖和葡萄糖，因為半乳糖和葡萄糖是紅藻細胞壁中主要成分。經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后，上清液中半乳糖和葡萄糖含量明顯減少是由于乳桿菌會將葡萄糖和半乳糖轉(zhuǎn)化成有機酸，同時需要消耗糖類為乳桿菌生長提供能量。另外，LDFP組的葡萄糖含量相比于UNF組分別減少53.7%，而LPFP組的葡萄糖含量只減28.9%，這可能是由于植物乳桿菌所產(chǎn)的-葡萄糖苷酶將紫菜纖維二糖分解成葡萄糖使LPFP組的葡萄糖含量相對增多。乳酸是乳桿菌利用葡萄糖為底物發(fā)酵的產(chǎn)物，LDFP組和LPFP組上清液中乳酸的含量相比于UNF組分別增加了1.1 倍和2.4 倍，表明植物乳桿菌對壇紫菜中糖類物質(zhì)的分解代謝能力更強?；贖 NMR分析，在UNF組上清液中鑒定出異亮氨酸、丙氨酸、谷氨酸、精氨酸、脯氨酸和?；撬岬任镔|(zhì)（表1）。丙氨酸是UNF組的主要氨基酸組分，其含量為3.14 mmol/L。經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后的LDFP組和LPFP組上清液中精氨酸和脯氨酸的含量明顯提高，這與王清爽等用乳桿菌發(fā)酵脫脂薏米精氨酸和脯氨酸含量增多的結(jié)果一致。同時，乳桿菌發(fā)酵對上清液中脯氨酸的含量影響最為明顯。相比UNF組，LDFP組中的脯氨酸含量增加了1.7 倍，LPFP組增加了3.4 倍。在NMR波譜分析中，沒有鑒定出多酚和黃酮類物質(zhì)，這可能是因為大部分酚酸類物質(zhì)在3.0～4.0區(qū)域，其化學(xué)信號被含量較多的半乳糖或葡萄糖覆蓋。

表1 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液中代謝產(chǎn)物的鑒定Table 1 Summary of metabolites identified in the supernatants of P.haitanensis

圖3 壇紫菜上清液的1H NMRFig.3 1H NMR spectra of fermented supernatants of P.haitanensis with different Lactobacillus species

2.4 乳桿菌對壇紫菜發(fā)酵上清液抗氧化活性的影響

過量的超氧化物自由基會加速機體的氧化衰老，因此清除自由基能力是評價抗氧化活性的重要指標(biāo)。由圖4A可知，UNF組上清液對DPPH自由基清除率為（48.5±2.8）%，LDFP組和LPFP組上清液的DPPH自由基清除能力顯著提升（＜0.05），并且LDFP組顯著高于LPFP組（＜0.05），表明德氏乳桿菌發(fā)酵相比于植物乳桿菌可更有效地提高壇紫菜發(fā)酵上清液的DPPH自由基清除能力。乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液對ABTS陽離子自由基和羥自由基的清除能力如圖4B所示。UNF組上清液對ABTS陽離子自由基的清除率為（66.3±3.9）%，低于對照組（200 μg/mL VC溶液）。通過乳桿菌發(fā)酵后，LDFP和LPFP組上清液對ABTS陽離子自由基的清除能力顯著高于UNF組，與陽性對照組無顯著差異，分別達到（71.8±2.1）%和（74.4±1.0）%。乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液對羥自由基清除能力的變化趨勢與其對ABTS陽離子自由基的清除能力相似。乳桿菌發(fā)酵后顯著提高LDFP組和LPFP組上清液對羥自由基的清除率（＜0.05），提高了2 2%～2 4%，但不同菌種之間無顯著差異（圖4C）。以上結(jié)果表明，乳桿菌發(fā)酵可顯著提高壇紫菜發(fā)酵上清液的抗氧化活性。

圖4 乳桿菌對壇紫菜發(fā)酵上清液抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of Lactobacillus on antioxidant activity of fermented supernatant of P.haitanensis

2.5 乳桿菌對壇紫菜發(fā)酵上清液抑制α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的影響

研究表明-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.20）能催化低聚糖類底物的-1,4-糖苷鍵水解生成葡萄糖，通過抑制腸道中-葡萄糖苷酶的酶活可阻斷碳水化合物分解成葡萄糖，降低餐后血糖水平，從而達到有效預(yù)防和輔助治療II型糖尿病。而胰脂肪酶能夠?qū)⒏视腿ニ夥殖尚》肿又舅岷透视蛦熙ビ欣谖?，過多吸收脂類物質(zhì)容易導(dǎo)致肥胖，會引起高血脂、糖尿病和心血管疾病等慢性疾病，所以抑制腸道中胰脂肪酶活性能夠有效抑制機體對脂肪吸收達到降脂效果。壇紫菜發(fā)酵上清液對-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的影響如圖5所示。UNF組上清液對-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力抑制率分別為（16.7±2.5）%和（48.7±1.4）%。經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后，上清液對-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制率顯著提高，其中對胰脂肪酶活力的抑制率提高幅度最大（＜0.05）。結(jié)果顯示，LDFP組和LPFP組的上清液對-葡萄糖苷酶活力的抑制率分別達到（51.6±0.8）%和（53.9±1.2）%；而LDFP組和LPFP組的上清液對胰脂肪酶活力的抑制率分別達到（95.3±1.3）%和（88.0±2.6）%，相比UNF組上清液的抑制活性提高了80.7%～95.7%。同時，在相同發(fā)酵條件下未添加壇紫菜的乳桿菌發(fā)酵上清液LDF組（pH 3.2）和LPF組（pH 3.1）上清液對-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制作用均分別顯著低于LDFP組和LPFP組上清液。以上結(jié)果表明，通過乳桿菌發(fā)酵能夠顯著強化壇紫菜發(fā)酵產(chǎn)物的抑制-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性，其中經(jīng)德氏乳桿菌發(fā)酵的壇紫菜上清液對胰脂肪酶活力抑制效果最好。

圖5 乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液對α-葡萄糖苷酶（A）和胰脂肪酶（B）的抑制活性Fig.5 Inhibitory activity of α-glucosidase (A) and pancreatic lipase (B)by fermentation supernatant of P.haitanensis

圖6A結(jié)果表明，3 組直線均通過原點，且添加不同發(fā)酵（LDFP和LPFP組）上清液后直線的斜率減小，表明兩種乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液對-葡萄糖苷酶的抑制類型均為可逆抑制。通過Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線作圖（圖6B）得到，在固定酶濃度的情況下，隨著底物濃度的不斷減少，酶促反應(yīng)的最大速率（）逐漸變小，酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)（）減??；同時，添加上清液和不添加上清液的曲線相交于第2象限，這是典型的非競爭與競爭混合型抑制。如圖6C所示，乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液對胰脂肪酶的抑制類型與其對-葡萄糖苷酶的抑制類型相同，為可逆抑制。進一步基于Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線作圖（圖6D）得到，添加不同發(fā)酵（LDFP和LPFP組）上清液后，酶促反應(yīng)最大速率（）變小，酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)（）增大，同時添加不同發(fā)酵（LDFP和LPFP組）上清液和不添加發(fā)酵上清液的曲線相交于第3象限，為典型的非競爭與反競爭混合型抑制。

圖6 酶濃度與酶促反應(yīng)速率的關(guān)系曲線（A、C）及酶促反應(yīng)速率與底物濃度的Lineweaver-Burk曲線（B、D）Fig.6 Relationship curve between enzyme concentration and enzymatic reaction rate (A,C) and Lineweaver-Burk curve between enzymatic reaction rate and substrate concentration (B,D)

3 討論

多酚類化合物是紫菜中重要的膳食營養(yǎng)元素之一，具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌等生理活性。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)不同乳桿菌發(fā)酵后的壇紫菜上清液中總酚、總黃酮含量顯著增多，與Gao He等報道的利用植物乳桿菌發(fā)酵苦瓜汁中總酚的變化趨勢一致。大量研究表明，乳桿菌可以將糖基化酚去糖基化繼而從植物細胞壁中釋放可溶性共軛或不溶性結(jié)合酚類化合物，且乳桿菌產(chǎn)生的微生物酶如還原酶、單寧酶和酚脫羧酶等能將酚苷類化合物水解成更簡單的相應(yīng)的苷元的形式。另外，乳桿菌能夠?qū)⒅参锘械纳锘钚晕镔|(zhì)轉(zhuǎn)化為其代謝物，從而產(chǎn)生新的酚類化合物。在發(fā)酵48 h后多酚增加速率減緩，是因為乳桿菌進入生長衰減期導(dǎo)致其發(fā)酵能力減弱。本研究發(fā)現(xiàn)兩種乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液中的總黃酮含量隨著發(fā)酵時間的延長呈先增后降的趨勢，但發(fā)酵上清液中總黃酮含量顯著高于未添加乳桿菌發(fā)酵的上清液。李垚等利用乳桿菌發(fā)酵紅甜菜過程中其總黃酮含量也呈先增后減的趨勢。在Kwaw和于金慧等的研究中也發(fā)現(xiàn)總黃酮含量出現(xiàn)相似的變化趨勢。研究表明，發(fā)酵過程中植物基中復(fù)雜的多酚被糖苷酶分解成更簡單的黃酮化合物導(dǎo)致總黃酮增加。同時，乳桿菌發(fā)酵可促使植物基的細胞壁破裂從而促進各種黃酮活性物的釋放。綜上，這些原因可能導(dǎo)致乳桿菌發(fā)酵后的壇紫菜上清液中總酚、總黃酮含量顯著增加。

乳桿菌發(fā)酵能夠促使植物基生物活性物質(zhì)的釋放，增強植物基的生物活性和營養(yǎng)特性。同時，乳桿菌自身及其代謝產(chǎn)物如胞外多糖、多酚和黃酮等具優(yōu)良的抗氧化活性。酚類化合物作為常見的抗氧化劑，其與黃酮類物質(zhì)可通過運輸氫原子或通過單電子螯合金屬離子破壞自由基的鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。Niccolai等報道了利用植物乳桿菌發(fā)酵螺旋藻顯著提高其總酚含量和抗氧化活性。另外，已有研究表明經(jīng)乳桿菌還原酶、酚脫羧酶等水解后的苷元形式的多酚具有更高的自由基清除能力。有研究表明脯氨酸也具有抗氧化活性。乳桿菌發(fā)酵能顯著提高壇紫菜發(fā)酵上清液的抗氧化活性，這與乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液中總酚、總黃酮和脯氨酸的含量增多有關(guān)。但是，LDFP組和LPFP組上清液中的脯氨酸含量與其抗氧化效果并未呈正相關(guān)，表明脯氨酸不是乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液中主要的抗氧化活性成分?？偡雍涂傸S酮的含量與自由基清除能力呈正相關(guān)。因此，在乳桿菌發(fā)酵壇紫菜上清液中總酚和總黃酮是主要的抗氧化活性成分。在研究中還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)乳桿菌發(fā)酵后兩種發(fā)酵上清液中精氨酸和脯氨酸的含量顯著升高，且LPFP組上清液中精氨酸和脯氨酸的含量高于LDFP組。文獻報道在發(fā)酵過程中乳桿菌代謝產(chǎn)生了大量有機酸能夠激活植物基發(fā)酵原料的內(nèi)源性蛋白酶的活性。在酸性環(huán)境、內(nèi)源酶和乳桿菌產(chǎn)生的外源酶的共同作用下，植物基原料的蛋白質(zhì)被降解，造成游離氨基酸的含量增加。因此，推測脯氨酸和精氨酸含量的增多是由于乳桿菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生的酸性環(huán)境激活了紫菜內(nèi)源性蛋白酶與乳桿菌外源蛋白酶共同作用所導(dǎo)致。李俊健等研究表明經(jīng)乳酸芽孢桿菌DU-106發(fā)酵柚皮泡菜的發(fā)酵液中氨基酸含量顯著高于自然發(fā)酵和植物乳桿菌發(fā)酵，推測是因為乳酸芽孢桿菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)蛋白酶較其他菌株豐富。與上述研究結(jié)果相似，LDFP和LPFP組中脯氨酸含量的差異可能是植物乳桿菌在發(fā)酵過程中所產(chǎn)蛋白酶比德氏乳桿菌更為豐富所致。兩種乳桿菌發(fā)酵所產(chǎn)生游離氨基酸差異的相關(guān)機制將在后續(xù)研究中進一步探討并闡明。

抑制-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活性是減少飲食中碳水化合物和脂肪類吸收的一種有效方法，用乳桿菌發(fā)酵工藝開發(fā)健康食品，預(yù)防和減緩糖尿病、肥胖等慢性疾病已經(jīng)在動物和人體模型中進行了廣泛研究。本研究表明乳桿菌發(fā)酵能顯著提高壇紫菜對-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶活力的抑制，特別是德氏乳桿菌發(fā)酵壇紫菜后其上清液對胰脂肪酶活性抑制率高達（95.3±1.3）%。同時，乳桿菌發(fā)酵后壇紫菜上清液中總酚和總黃酮含量與對其-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制率呈正相關(guān)，已有研究表明酚類化合物的酚羥基和總黃酮類化合物A環(huán)和B環(huán)上的羥基可以與酶活性位點的氨基酸殘基之間形成氫鍵使酶失活，因此推測發(fā)酵后總酚與總黃酮的增加是對相關(guān)酶活力抑制效果提升的重要原因。另外，本研究發(fā)現(xiàn)乳桿菌發(fā)酵壇紫菜產(chǎn)物對-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶的抑制類型存在差異，推測是由于不同乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的部分多酚和黃酮在結(jié)構(gòu)上存在差異導(dǎo)致。因此，后續(xù)研究將以此為切入點通過對上清液中多酚和黃酮進行定性和定量分析，闡明其量效關(guān)系。

4 結(jié)論

本研究探索了乳桿菌發(fā)酵對壇紫菜發(fā)酵上清液營養(yǎng)成分的變化及其抗氧化和抑制糖脂代謝關(guān)鍵酶活性的影響?；贖 NMR代謝組學(xué)分析、自由基清除能力實驗和-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶活力分析模型等，研究和評價發(fā)酵上清液中的主要代謝產(chǎn)物及其抗氧化活性和抑制-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶的活性。由結(jié)果可知，乳桿菌可有效提高壇紫菜發(fā)酵上清液中總酚和總黃酮的含量，增強其抗氧化活性和其對-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶的抑制活性，具有潛在的減緩和輔助治療糖尿病和肥胖等慢性疾病的潛在功效。本研究可豐富壇紫菜精深加工的食品營養(yǎng)學(xué)理論基礎(chǔ)，為研發(fā)壇紫菜高值健康食品提供科學(xué)依據(jù)。