• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同原料對醬香大曲微生物群落結構及多樣性的影響

    2022-06-02 08:42:48母應春王涵鈺
    食品科學 2022年10期
    關鍵詞:醬香大曲桿菌屬

    趙 馳,蘇 偉,*,母應春,鄭 璞,王涵鈺

    (1.貴州大學釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽 550025;2.貴州大學 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

    中國白酒被列為世界六大著名蒸餾酒之一。其中,茅臺酒是中國著名的傳統(tǒng)白酒,它以高度復雜、甘甜和清爽的風味而聞名,其特點主要來源于醬香大曲。醬香大曲以純小麥為主要原料,經(jīng)破碎、配料、成型、發(fā)酵、拆曲、貯存等步驟固態(tài)發(fā)酵而成。醬香大曲作為茅臺酒的糖化、發(fā)酵與生香劑,由多種微生物、功能酶和風味化合物組成。研究發(fā)現(xiàn)原料是影響發(fā)酵進程和產物品質的重要因素,不同原料營養(yǎng)成分的差異與發(fā)酵產物的品質和功能密切相關。然而,到目前為止,醬香大曲仍是基于純小麥在開放環(huán)境下自然發(fā)酵生產的,導致原料探索存在數(shù)據(jù)集缺陷。

    純小麥與青稞和紫小麥成分類似,但青稞(-葡聚糖、酚類化合物和蛋白質)和紫小麥(花色苷和微量元素)部分功能營養(yǎng)成分明顯高于純小麥。因此,通過原料的營養(yǎng)成分差異探究大曲微生物菌群結構和豐度對白酒風格和品質的多元參數(shù)具有重要意義。曾橋等利用不同原料在同一加工條件下發(fā)現(xiàn)茯磚茶活性成分和微生物多樣性呈顯著差異。江偉等發(fā)現(xiàn)以高粱、小麥、大米、糯米和玉米釀造的白酒風味各具特色,但以高粱為釀造白酒原料更具優(yōu)勢。隨著檢測技術的發(fā)展,對發(fā)酵產品微生物的研究越來越多?;诟咄繙y序技術揭示了貴州和四川主要釀酒企業(yè)采集的14 份醬香大曲樣品微生物、傳統(tǒng)與自動化制醬香大曲的微生物群落結構、茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)大曲細菌菌群結構和貴州傳統(tǒng)小曲微生物群落分布及代謝潛力。但對醬香大曲的研究主要集中在純小麥發(fā)酵制備酒曲的微生物,不同原料營養(yǎng)成分差異對發(fā)酵調控微生物菌群結構及多樣性卻鮮見報道。

    因此,本研究采用高通量測序技術,對同一加工條件下不同原料加工而成的醬香大曲樣品進行微生物群落結構和多樣性分析。并利用主成分分析(principal component analysis,PCA)、聚類分析(hierarchical cluster analysis,HCA)、正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)和線性判別差異貢獻分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)對組間分離情況和菌群關鍵生物標記進行探究,旨在為醬香大曲的品質研究提供新參數(shù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    醬香大曲:分別以青稞、紫小麥和純小麥為原料,按照傳統(tǒng)醬香大曲加工工藝(潤料、粉碎、拌曲、成型、發(fā)酵、拆曲、貯存)制成青稞曲(QKQ)、紫麥曲(ZMQ)和小麥曲(XMQ)(圖1)。樣本基于Zhang Chunlin等方法采集于2020年6月。收集后,這些樣本被迅速運送至實驗室,然后放入無菌袋儲存在-80 ℃待進一步分析。

    圖1 醬香大曲制備流程Fig.1 Preparation process of Jiang-flavor Daqu

    DNA提取試劑盒 美國MP Biomedicals公司;瓊脂糖 西班Biowest公司;FastPolymerase 中國sGen公司;正反引物 深圳市英俊生物技術有限公司;DNA純化磁珠 南京諾唯贊生物科技有限公司;MinElute PCR純化試劑盒 德國Qiagen公司。

    1.2 儀器與設備

    GeneAmp 9700 PCR儀 美國ABI公司;Nanodrop 2000超微量分光光度計、ST16R臺式高速冷凍離心機美國Thermo Fisher Scientific公司;Illumina HiSeq 2500測序儀 美國Illumina公司;FA1004N電子分析天平上海精密科學儀器有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 DNA提取和PCR擴增

    使用E.Z.N.A.土壤DNA 試劑盒(OMEGA)直接從樣本中提取總基因組DNA。然后使用正反引物(338F:5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’和806R:5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)結合適配器和條形碼序列對1 6 Sr RNA 基因的V3-V4高變區(qū)進行PCR擴增;真菌使用引物ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2R(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)在ITS1區(qū)進行PCR擴增。PCR使用下列程序進行:95 ℃預變性3 min,27 個循環(huán)(95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s),然后72 ℃穩(wěn)定延伸10 min,最后在4 ℃進行保存。

    1.3.2 高通量測序和數(shù)據(jù)處理

    擴增后的PCR產物純化參考文獻[19]。純化后的產物通過NanoDrop 2000分光光度計進行定量,隨即按照每個樣本的測序要求,進行相應比例的混合,并使用Low Sample Protocol進行建庫,最后在Illumina HiSeq 2500平臺上進行高通量測序。首先,使用FLASH v1.2.7軟件,通過Overlap對每個樣品的reads進行拼接;然后使用Trimmomatic v0.33軟件,對拼接得到的raw tags進行過濾,得到高質量的tags數(shù)據(jù);最后通過UCHIME v4.2軟件,鑒定并去除嵌合體序列,得到最終有效數(shù)據(jù)。此外,使用Usearch軟件對tags在97%的相似度水平下進行聚類獲得可操作分類單元(operational taxonomic unit,OTU),并基于Silva(細菌)和 UNITE(真菌)分類學數(shù)據(jù)庫對OTU進行分類學注釋。

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    所有統(tǒng)計分析均使用SPSS 25.0軟件進行?;讷@得的OTU表格,利用QIIME計算樣品的多樣性,包括豐富度指數(shù)(ACE指數(shù)和Chao1指數(shù))和多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù))。隨后使用R軟件可視化樣品間Venn圖、稀釋曲線圖和優(yōu)勢屬的堆疊柱狀圖。使用SIMCA 14.1軟件對微生物屬數(shù)據(jù)集進行PCA和OPLSDA,在OPLS-DA模型上,確定細菌和真菌的PCA得分圖。此外,通過R軟件進行了樣品間的HCA。最后,利用Python 2.0軟件進行LEfSe。每個樣品進行5 次實驗。

    2 結果與分析

    2.1 α多樣性分析

    XMQ、ZMQ和QKQ樣本質量控制后,在16S rRNA序列中分別得到(59 763±8 414)、(68 309±4 326)條和(57 368±12 272)條有效序列,ITS序列中分別得到(77 787±419)、(77 963±553)條和(77 364±12 220)條有效序列?;诩毦驼婢鶲TU 數(shù)的覆蓋率(表1)和稀釋曲線(圖2A)趨于平緩,表明本研究的測序深度足以代表樣品的微生物結構,說明測序數(shù)據(jù)足夠后續(xù)分析。此外,描述了不同樣品中微生物群落的豐富度和多樣性(表1)。通過計算樣品的豐富度指數(shù)發(fā)現(xiàn),QKQ的真菌和細菌ACE指數(shù)(79.6±15.3和139.9±7.9)和Chao1指數(shù)(76.9±18.2和142.7±9.7)最高,說明樣品中微生物群落的豐富度最高;相反地,ZMQ樣品中微生物群落的豐富度最低,其真菌和細菌的豐富度指數(shù)分別為ACE指數(shù)(39.0±19.3和103.1±16.5)和Chao1指數(shù)(37.0±18.3和100.9±16.0)。同時,通過多樣性指數(shù)發(fā)現(xiàn)XMQ中真菌和細菌的Simpson指數(shù)(0.3±0.1和0.2±0.1)和Shannon指數(shù)(1.6±0.3和2.2±0.3)分別為最高和最低,這表明樣品中微生物群落的多樣性最低。而真菌多樣性以QKQ最高,Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為0.2±0.1和1.8±0.3。

    表1 大曲樣品中微生物菌群的α多樣性Table 1 α Diversity of microflora in Daqu samples

    圖2 真菌和細菌的稀釋曲線(A)和Venn圖(B)Fig.2 Rarefaction curves (A) and Venn diagrams (B) of fungi and bacteria

    根據(jù)Venn圖(圖2B),3 份大曲樣品中細菌OTU總數(shù)和唯一數(shù)均為最高,但真菌OTU的唯一數(shù)在3 份大曲樣品中無明顯差異。此外,QKQ和XMQ樣品中細菌和真菌的OTU獨自共有數(shù)最多,分別為20和15。

    2.2 微生物群落結構分析

    根據(jù)OTU分析結果,對樣品數(shù)據(jù)在門和屬水平上進行分類學分析。如圖3所示,在門水平上,所有樣品共檢測到8 個門(相對豐度>0.1%),包括3 個真菌門(子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)和毛霉門(Mucoromycota))和5 個細菌門(厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍藻菌門(Cyanobacteria))。3 個大曲樣品中均以子囊菌門、厚壁菌門和放線菌門為絕對優(yōu)勢門(相對豐度>1%)。與之前研究結論一致,Gan Shuheng等在茅臺酒釀造使用的大曲中確定了子囊菌門為優(yōu)勢真菌群。同時,有研究表明茅臺鎮(zhèn)不同主釀區(qū)域醬香型白酒釀造大曲中優(yōu)勢細菌門為厚壁菌門和放線菌門。此外,擬桿菌門主要存在于ZMQ中。根據(jù)相關研究報道,擬桿菌門不僅是醬香大曲中優(yōu)勢門,同樣也是芝麻香型大曲和濃香型大曲等白酒糖化發(fā)酵劑中的主要細菌門。

    圖3 大曲樣品在門水平上細菌(A)和真菌(B)的相對豐度Fig.3 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at the phylum level in Daqu samples

    在屬水平上,圖4A、B分別顯示了9 個大曲樣品細菌屬和真菌屬的總體概況(相對豐度>1%),分別占總豐度的93.57%和96.25%。觀察到優(yōu)勢細菌屬為克羅彭斯特菌屬()、uncultured_bacterium_f_Bacillaceae、高溫放線菌屬()、魏斯氏菌屬()、枝芽孢菌屬()、乳桿菌屬()、芽孢桿菌屬()、鏈霉菌屬()、葡萄球菌屬()、火山渣芽孢桿菌屬()、棒狀桿菌屬(_1)、uncultured_bacterium_f_Pseudonocardiaceae、短桿菌屬()和鞘氨醇桿菌屬(),屬厚壁菌門、放線菌門和擬桿菌門。更具體地說,克羅彭斯特菌屬和枝芽孢菌屬在XMQ(33.40%和26.20%)、ZMQ(12.36%和5.28%)中表現(xiàn)出優(yōu)勢相對豐度,與Zou Qiancheng等對傳統(tǒng)與機械化制醬香大曲發(fā)酵過程中細菌多樣性和任愛榮等對茅臺鎮(zhèn)醬香型白酒釀造大曲及環(huán)境中可培養(yǎng)細菌多樣性及功能分析研究一致??肆_彭斯特菌屬有利于白酒發(fā)酵過程中醋酸、乳酸、蘋果酸和乙酸乙酯的增加。據(jù)報道,枝芽孢菌屬在白云邊白酒發(fā)酵劑及發(fā)酵過程、玉米黃酒和中國傳統(tǒng)魚露等發(fā)酵產品中發(fā)現(xiàn),具有較高的蛋白酶活性,且與十二酸乙酯、3-甲基-1-丁醇等風味化合物呈正相關關系。同樣,在QKQ和XMQ中,乳桿菌屬、魏斯氏菌屬的相對豐度分別為13.71%、25.37%和10.84%、11.92%。檢測到的這兩種屬均屬于乳酸菌,與自動與傳統(tǒng)法制醬香大曲微生物群落研究一致。簡而言之,乳酸菌作為功能微生物,在中國食品工業(yè)中發(fā)揮著至關重要的作用。已有報道,乳酸菌不僅通過發(fā)酵產生細菌素,而且通過消耗發(fā)酵糖積累有機酸,這表示乳酸菌可以提供一個較低的pH值條件,抑制病原菌在釀造過程中的繁殖,從而促進最終產品的感官和營養(yǎng)價值的提高。高溫放線菌屬39.86%僅存在于QKQ,有研究根據(jù)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)兩種方法報道了高溫放線菌屬大多存在于高溫發(fā)酵條件下。因此,在高溫大曲中檢測到高溫放線菌屬也不足為奇。此外,uncultured_bacterium_f_Bacillaceae 41.65%、芽孢桿菌屬11.11%和火山渣芽孢桿菌屬6.09%僅作為ZMQ的主要優(yōu)勢屬。芽孢桿菌屬是一種廣泛存在于各種發(fā)酵食品中的需氧菌,已被鑒定為大曲中的功能性微生物,能代謝產生蛋白酶、淀粉酶和其他水解酶,也能產生吡嗪、揮發(fā)酸、芳香和酚類化合物,這些物質對茅香型白酒的風味形成和品質具有重要貢獻。有研究報道,火山渣芽孢桿菌屬存在于高溫大曲中,細胞具有需氧、不活動、革蘭氏染色陽性、氧化酶陰性和過氧化氫酶陽性等特點。然而,uncultured_bacterium_f_Bacillaceae在本研究中被首次報道。

    圖4 大曲樣品在屬水平上細菌(A)和真菌(B)的相對豐度Fig.4 Relative abundance of bacteria (A) and fungi (B) at the genera level in Daqu samples

    鑒定出的優(yōu)勢真菌屬(相對豐度>1%)為熱子囊菌屬()、紅曲霉屬()、絲衣霉屬()、嗜熱真菌屬()、哈薩克斯坦酵母屬()、孢圓酵母屬()、德巴利氏酵母屬()、、曲霉屬()和,屬于子囊菌門。其中,在3 個大曲中以熱子囊菌屬和德巴利氏酵母屬為主,而嗜熱真菌屬和絲衣霉屬分別為QKQ和XMQ的絕對優(yōu)勢屬。熱子囊菌屬和嗜熱真菌屬是高溫大曲中常見的兩種真菌,在高溫下生長繁殖,產生多種耐熱水解酶幫助白酒堆積糖化發(fā)酵,從而對醬香風味的形成起重要作用。絲衣霉屬具有耐熱、耐低氧、耐酸和產果膠酶等特性,且與己酸乙酯、辛酸乙酯等醬香型白酒主體香氣成分密切相關。紅曲霉屬主要存在于XMQ和ZMQ,而哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬則以XMQ和QKQ為主。紅曲霉屬能分泌大量酯酶,對碳酸十四乙酯和苯乙醇的形成有促進作用。哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬作為非釀酒酵母菌,通過其獨特的次生代謝物產生對酒的感官特性作出積極貢獻。其中,哈薩克斯坦酵母屬代謝物主要具有果香和花香的特征,與釀酒酵母相比,能產生大量乙酸異戊酯等酯類化合物。有研究報道,孢圓酵母屬對糖的利用速度優(yōu)于哈薩克斯坦酵母屬。此外,曲霉屬和主要存在于ZMQ。曲霉屬能產生水解酶作用于淀粉糖化、蛋白質水解和類黃酮的生成,從而促進芳香類化合物的形成。有報道稱,是中溫大曲和普洱茶風味形成的潛在功能微生物。綜上所述,大曲樣品中檢測到的微生物在結構和多樣性上存在較大差異,主要由原料營養(yǎng)成分差異所致。

    2.3 PCA、OPLS-DA和HCA

    通過對樣品數(shù)據(jù)的多元統(tǒng)計分析,較為客觀地反映樣品的微小變化及分類?;诓煌现苽涞尼u香大曲微生物屬的相對含量數(shù)據(jù),利用SIMCA 14.1軟件進行PCA、OPLS-DA和HCA(圖5)。PCA得分圖表明組間分離明顯、信度較高,在細菌分析中變量得分圖顯示PC1和PC2的方差貢獻率分別為43.39%和40.24%(圖5A),真菌中的變量得分圖顯示PC1為52.43%,PC2為33.69%(圖5A)。此外,為了更好地了樣品組間差異的微生物屬,進行了OPLS-DA,以濾除與微生物屬中分類變量無關的正交變量,并分別分析非正交變量和正交變量,以獲得更可靠的模型信息。根據(jù)OPLS-DA得分圖的結果,樣本均在95% Hotelling的平方橢圓內,說明分析樣本中不存在異常值(圖5B)。模型中細菌和真菌的R和值非常接近1,表明它們可以有效地解釋樣本之間的差異。同時,通過HCA結果發(fā)現(xiàn),在細菌屬的聚類分析中ZMQ和XMQ聚為一簇,而QKQ獨為一簇(圖5C)。然而,在真菌屬的聚類分析中QKQ和ZMQ為一簇,XMQ單獨為一簇(圖5C)。上述結果表明,不同原料制備的醬香大曲由于原料成分差異導致最終產品在微生物間存在較大差異。

    圖5 大曲樣品中微生物屬的PCA(A)、OPLS-DA(B)和HCA(C)Fig.5 PCA (A),OPLS-DA (B),and HCA (C) of microbial genera in Daqu samples

    2.4 樣品組間微生物群落顯著性差異及標記物分析

    為進一步探究不同原料加工制備醬香大曲中的微生物群落標記物,基于LEfSe方法對3 組大曲樣品間菌群豐度差異特征進行分析。微生物各分類水平上的分類等級樹如圖6A和圖6B所示,由內圈到外圈分別表現(xiàn)為微生物群落從界到屬分類單元的等級關系,節(jié)點大小表示分類單元的豐度高低,黃色節(jié)點代表組間無顯著差異的分類單元,其他顏色的節(jié)點表示該分類單元在對應樣品中豐度較高且組間具有顯著差異,線性判別分析值(LDA score)設定為4.0。

    基于LEfSe,3 組大曲樣品優(yōu)勢屬中共發(fā)現(xiàn)10 種顯著差異細菌屬(圖6A)和9 種顯著差異真菌屬(圖6B)(LDA score>4,<0.05)。其中,ZMQ樣品占9 種,分別為5 種細菌屬(棒狀桿菌屬_1、鞘氨醇桿菌屬、芽孢桿菌屬、火山渣芽孢桿菌屬和uncultured_bacterium_f_Bacillaceae)和4 種真菌屬(曲霉屬、紅曲霉屬、熱子囊菌屬和)。XMQ樣品含4 種顯著差異屬,細菌屬(枝芽孢菌屬和克羅彭斯特菌屬)和真菌屬(絲衣霉屬和)分別占兩種。同時,QKQ顯著差異細菌屬(高溫放線菌屬、乳酸菌屬和魏斯氏菌屬)和真菌屬(嗜熱真菌屬、哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬)分別為3 種。此外,柱狀圖的優(yōu)勢屬中4 種細菌屬(葡萄球菌屬、鏈霉菌屬、短桿菌屬和uncultured_bacterium_f_Pseudonocardiaceae)和1 種真菌屬(德巴利氏酵母屬)未能體現(xiàn),可認為它們的組間差異性不明顯。

    圖6 大曲樣品中細菌(A)和真菌(B)的LEfSe分析Fig.6 LEfSe analysis of bacteria (A) and fungi (B) in Daqu samples

    3 結論

    分別以青稞、紫小麥和純小麥為原料,以相同條件下加工而成的醬香大曲為樣品,采用高通量測序技術對微生物群落結構和多樣性進行分析,并基于多元統(tǒng)計分析揭示了組間分離情況及標記微生物。結果表明:在細菌屬中,XMQ以克羅彭斯特菌屬、枝芽孢菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬為主;ZMQ以克羅彭斯特菌屬、枝芽孢菌屬、uncultured_bacterium_f_Bacillaceae、芽孢桿菌屬和火山渣芽孢桿菌屬為主;QKQ以乳桿菌屬、魏斯氏菌屬和高溫放線菌屬為主。在真菌屬中,樣品均以熱子囊菌屬和德巴利氏酵母屬為優(yōu)勢屬;此外,XMQ以絲衣霉屬、紅曲霉屬、哈薩克斯坦酵母屬和孢圓酵母屬為主;ZMQ以紅曲霉屬、曲霉屬和為主;QKQ以哈薩克斯坦酵母屬、孢圓酵母屬、嗜熱真菌屬為主。多元分析表明組間分離明顯,且從優(yōu)勢屬中共獲得了10 種顯著差異細菌屬和9 種顯著差異真菌屬。目前,對不同原料酒曲微生物的代謝機制不明確,后續(xù)研究需進一步利用代謝組學、轉錄組學和蛋白質組學方法研究酒曲的功能菌株及發(fā)酵機制。本研究結果為生產醬香大曲時選擇原料提供了指導。

    猜你喜歡
    醬香大曲桿菌屬
    潰瘍性結腸炎患者腸道菌群分布特征分析
    兩宋大曲異同考
    戲曲研究(2020年2期)2020-11-16 01:21:10
    唐雅樂大曲存辭考略
    中華戲曲(2020年1期)2020-02-12 02:28:10
    養(yǎng)豬微生物發(fā)酵床芽胞桿菌空間生態(tài)位特性
    論茅臺鎮(zhèn)醬香酒發(fā)展前景及投資分析報告
    科學與財富(2018年8期)2018-05-09 01:30:10
    中脈名酒事業(yè)部 領航醬香白酒之旅
    醬香永存
    貴州大曲
    遵義(2017年1期)2017-07-12 17:57:38
    貴州大曲
    遵義(2017年5期)2017-07-05 13:50:16
    醬香大鯢皮膚泡制酒對腸道微生物的影響
    中國釀造(2016年12期)2016-03-01 03:08:18
    只有这里有精品99| 欧美人与善性xxx| a级一级毛片免费在线观看| 精品日产1卡2卡| 亚洲国产精品国产精品| 干丝袜人妻中文字幕| 国产真实乱freesex| 高清毛片免费观看视频网站| 嫩草影院入口| 一本久久中文字幕| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一进一出抽搐动态| 成人二区视频| 九九爱精品视频在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲在线观看片| 中文资源天堂在线| .国产精品久久| 3wmmmm亚洲av在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 又爽又黄无遮挡网站| 国产成人午夜福利电影在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久午夜福利片| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久久久国产网址| 国产不卡一卡二| 天美传媒精品一区二区| 国产精品伦人一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| av天堂在线播放| 一级毛片电影观看 | 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲三级黄色毛片| 两个人的视频大全免费| 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 97超视频在线观看视频| 免费观看的影片在线观看| 国产综合懂色| 亚洲电影在线观看av| 亚洲综合色惰| 禁无遮挡网站| 国产高清三级在线| 成人毛片60女人毛片免费| 国产精品一区二区三区四区久久| 久久国内精品自在自线图片| 日本一本二区三区精品| 国产高潮美女av| АⅤ资源中文在线天堂| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久久久久久久中文| 亚洲精品自拍成人| 我要看日韩黄色一级片| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 午夜视频国产福利| 久久99精品国语久久久| 国产黄色小视频在线观看| 女人被狂操c到高潮| 国产成人一区二区在线| 亚洲国产精品sss在线观看| 午夜亚洲福利在线播放| 特大巨黑吊av在线直播| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲av二区三区四区| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 日日啪夜夜撸| 日韩中字成人| 久久精品影院6| 亚洲无线在线观看| 国产精品三级大全| 国产精品三级大全| 嫩草影院入口| 99热6这里只有精品| av黄色大香蕉| 尾随美女入室| 永久网站在线| www日本黄色视频网| 变态另类丝袜制服| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 麻豆成人午夜福利视频| 午夜精品国产一区二区电影 | 大型黄色视频在线免费观看| 一级二级三级毛片免费看| 99九九线精品视频在线观看视频| 国产伦一二天堂av在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 中国美白少妇内射xxxbb| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 神马国产精品三级电影在线观看| 有码 亚洲区| 亚洲欧美清纯卡通| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品人妻久久久久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99热只有精品国产| 亚洲av熟女| 日本黄色片子视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 成人亚洲欧美一区二区av| 中文欧美无线码| 九色成人免费人妻av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 韩国av在线不卡| 美女被艹到高潮喷水动态| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 亚洲内射少妇av| 99国产精品一区二区蜜桃av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久久久久久久久丰满| av在线亚洲专区| 午夜福利高清视频| av免费在线看不卡| 一区二区三区四区激情视频 | 日韩一本色道免费dvd| 久久久久久伊人网av| 我要搜黄色片| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 中国美白少妇内射xxxbb| eeuss影院久久| 午夜福利在线观看吧| 精品久久久噜噜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日韩成人av中文字幕在线观看| 校园春色视频在线观看| 日本-黄色视频高清免费观看| 国产av不卡久久| 韩国av在线不卡| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久国内精品自在自线图片| 国产精品人妻久久久久久| 亚洲精品成人久久久久久| 成人无遮挡网站| 国内精品久久久久精免费| 亚洲av中文av极速乱| 国产高清有码在线观看视频| 老女人水多毛片| ponron亚洲| 超碰av人人做人人爽久久| 99热这里只有精品一区| 两个人的视频大全免费| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久久久久久久久久丰满| 麻豆久久精品国产亚洲av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 人妻久久中文字幕网| 高清午夜精品一区二区三区 | 欧美激情久久久久久爽电影| av又黄又爽大尺度在线免费看 | 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 精品熟女少妇av免费看| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲人成网站在线播| 久久精品91蜜桃| 久久久精品欧美日韩精品| 中文字幕免费在线视频6| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线 | 免费av毛片视频| 在线免费十八禁| 久久久久久久久久成人| 黑人高潮一二区| 韩国av在线不卡| 亚洲经典国产精华液单| 精品久久久久久久久av| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 寂寞人妻少妇视频99o| 我要看日韩黄色一级片| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美+亚洲+日韩+国产| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日本一本二区三区精品| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精华一区二区三区| 国产伦一二天堂av在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 如何舔出高潮| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 亚洲av成人精品一区久久| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 在线播放无遮挡| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 成人av在线播放网站| 国产免费男女视频| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产成人精品久久久久久| 听说在线观看完整版免费高清| 久久精品国产亚洲av天美| 国产爱豆传媒在线观看| 97热精品久久久久久| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| .国产精品久久| 久久久久久大精品| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲精品自拍成人| 免费观看的影片在线观看| 麻豆成人av视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久久性生活片| 寂寞人妻少妇视频99o| 日本av手机在线免费观看| 天堂网av新在线| 国产一区二区三区av在线 | 最好的美女福利视频网| 男插女下体视频免费在线播放| av在线亚洲专区| 97超视频在线观看视频| 久久草成人影院| 日韩欧美 国产精品| 欧美zozozo另类| 成人欧美大片| 久久亚洲国产成人精品v| 久久久久久久久大av| 99热全是精品| 国产熟女欧美一区二区| 两个人视频免费观看高清| 成人综合一区亚洲| 国产不卡一卡二| 国产成人aa在线观看| 伦理电影大哥的女人| 亚洲欧洲日产国产| 男女那种视频在线观看| av国产免费在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| .国产精品久久| 黄色视频,在线免费观看| 老女人水多毛片| 成人三级黄色视频| 午夜激情福利司机影院| 寂寞人妻少妇视频99o| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 久久这里有精品视频免费| 草草在线视频免费看| 精品人妻熟女av久视频| 国产熟女欧美一区二区| 久久韩国三级中文字幕| 欧美激情国产日韩精品一区| 色综合站精品国产| 99热这里只有是精品50| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 村上凉子中文字幕在线| 国产美女午夜福利| 天堂中文最新版在线下载 | 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 日韩大尺度精品在线看网址| 大香蕉久久网| www日本黄色视频网| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 久久精品国产清高在天天线| 99热这里只有精品一区| av免费观看日本| 能在线免费观看的黄片| 在线a可以看的网站| 综合色丁香网| 亚洲欧美成人精品一区二区| 久久久久久国产a免费观看| av黄色大香蕉| 国产精品av视频在线免费观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av在线蜜桃| 国产精品久久视频播放| 免费无遮挡裸体视频| 中文字幕熟女人妻在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲成人久久性| 能在线免费看毛片的网站| 看免费成人av毛片| 国产黄色小视频在线观看| 午夜视频国产福利| 男女边吃奶边做爰视频| 免费人成在线观看视频色| 99久久中文字幕三级久久日本| 91精品国产九色| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲最大成人手机在线| 欧美最新免费一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 成人永久免费在线观看视频| 九九热线精品视视频播放| 国内精品久久久久精免费| 色综合亚洲欧美另类图片| 欧美成人免费av一区二区三区| 欧美又色又爽又黄视频| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 一本久久中文字幕| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产高潮美女av| 男人的好看免费观看在线视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 91久久精品国产一区二区成人| 国产午夜精品论理片| 国产成人福利小说| 精品久久久久久久久久免费视频| 久久久成人免费电影| 女人被狂操c到高潮| 久久欧美精品欧美久久欧美| 一进一出抽搐动态| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产淫片久久久久久久久| 亚洲国产高清在线一区二区三| 亚洲五月天丁香| 久久久久国产网址| 日日摸夜夜添夜夜爱| 搞女人的毛片| 日韩成人av中文字幕在线观看| 在线播放无遮挡| 欧美一区二区国产精品久久精品| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲丝袜综合中文字幕| 国产成人福利小说| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久人人精品亚洲av| 美女 人体艺术 gogo| 两个人的视频大全免费| 国产精品一区www在线观看| 精品熟女少妇av免费看| 精品欧美国产一区二区三| 中文亚洲av片在线观看爽| 天天躁日日操中文字幕| 一级黄色大片毛片| 最近手机中文字幕大全| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 在线观看午夜福利视频| 全区人妻精品视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品久久久久久久末码| 亚洲成人av在线免费| 一个人观看的视频www高清免费观看| 不卡视频在线观看欧美| 日本免费a在线| 国产午夜精品论理片| 天堂√8在线中文| 亚洲av不卡在线观看| 黄色一级大片看看| 久久精品国产清高在天天线| 男插女下体视频免费在线播放| 18+在线观看网站| 亚洲精品色激情综合| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲国产欧美在线一区| 99精品在免费线老司机午夜| 色综合站精品国产| 91狼人影院| 久久久精品欧美日韩精品| 欧美高清成人免费视频www| 97在线视频观看| 赤兔流量卡办理| 欧美性猛交黑人性爽| 国产激情偷乱视频一区二区| 中国国产av一级| 亚洲欧美成人精品一区二区| 日本av手机在线免费观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 欧美日韩综合久久久久久| 午夜老司机福利剧场| 在线观看66精品国产| 午夜老司机福利剧场| 熟女电影av网| 老司机影院成人| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产一区亚洲一区在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文字幕av在线有码专区| 久久久精品欧美日韩精品| 特大巨黑吊av在线直播| 久久这里只有精品中国| 日本一本二区三区精品| 亚洲欧洲日产国产| 尾随美女入室| 欧美在线一区亚洲| 小说图片视频综合网站| 老司机影院成人| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产真实乱freesex| 大型黄色视频在线免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲欧洲国产日韩| 丝袜喷水一区| 精品久久国产蜜桃| 亚洲性久久影院| 日本免费a在线| 黄色一级大片看看| 一本久久中文字幕| 22中文网久久字幕| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲自拍偷在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲av男天堂| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲欧洲日产国产| 伦精品一区二区三区| 岛国在线免费视频观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产真实乱freesex| 久久欧美精品欧美久久欧美| 晚上一个人看的免费电影| 午夜a级毛片| 国产在视频线在精品| 爱豆传媒免费全集在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 一级黄色大片毛片| 亚洲国产精品成人久久小说 | 亚洲久久久久久中文字幕| 丰满的人妻完整版| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产一区二区激情短视频| kizo精华| 久久韩国三级中文字幕| 永久网站在线| 国产日本99.免费观看| 哪个播放器可以免费观看大片| 精品日产1卡2卡| 美女国产视频在线观看| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲av一区综合| 色综合色国产| 毛片女人毛片| 亚洲av中文av极速乱| 一级av片app| 日韩制服骚丝袜av| 青春草视频在线免费观看| 丰满乱子伦码专区| 国产成人freesex在线| 性插视频无遮挡在线免费观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 成人av在线播放网站| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 亚洲人成网站高清观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 天堂√8在线中文| 国产精品不卡视频一区二区| 日韩av在线大香蕉| 精品一区二区三区人妻视频| 久久精品久久久久久久性| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产综合懂色| 国产精品爽爽va在线观看网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 最近手机中文字幕大全| 此物有八面人人有两片| 中文字幕免费在线视频6| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产伦精品一区二区三区四那| 免费大片18禁| 小说图片视频综合网站| 久久精品夜色国产| 日韩精品有码人妻一区| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 听说在线观看完整版免费高清| 看十八女毛片水多多多| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 男女做爰动态图高潮gif福利片| 日本一本二区三区精品| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 久久久久久久久久久免费av| 国产淫片久久久久久久久| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| a级毛片a级免费在线| 少妇熟女aⅴ在线视频| 插阴视频在线观看视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说 | 国内精品久久久久精免费| 我要看日韩黄色一级片| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产真实乱freesex| 美女大奶头视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国国产精品蜜臀av免费| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品久久久久久精品电影小说 | www.色视频.com| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久6这里有精品| 寂寞人妻少妇视频99o| 美女高潮的动态| 国产精品一及| 在线国产一区二区在线| 久久午夜福利片| 久久精品人妻少妇| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产男人的电影天堂91| 日本熟妇午夜| 国产精品嫩草影院av在线观看| 亚洲欧美精品专区久久| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产综合懂色| 欧美一区二区亚洲| 久久精品91蜜桃| 国产亚洲欧美98| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 欧美激情在线99| 日韩欧美 国产精品| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 99在线人妻在线中文字幕| 日本熟妇午夜| av女优亚洲男人天堂| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久久精品大字幕| 观看美女的网站| 高清午夜精品一区二区三区 | 国产成人91sexporn| 国产在线男女| 97热精品久久久久久| 午夜福利在线在线| 乱码一卡2卡4卡精品| 成人漫画全彩无遮挡| 在线观看免费视频日本深夜| 夜夜夜夜夜久久久久| 在线免费观看的www视频| 中国美白少妇内射xxxbb| 高清毛片免费观看视频网站| 久久人人精品亚洲av| 十八禁国产超污无遮挡网站| 青青草视频在线视频观看| 日本黄色视频三级网站网址| 日本黄色片子视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 国产伦在线观看视频一区| 高清毛片免费观看视频网站| 又粗又爽又猛毛片免费看| 夜夜夜夜夜久久久久| 五月伊人婷婷丁香| 99精品在免费线老司机午夜| 久久韩国三级中文字幕| 欧美三级亚洲精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日本一本二区三区精品| 69人妻影院| 国产精品综合久久久久久久免费| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久久久国产a免费观看| 波野结衣二区三区在线| 久久人人爽人人片av| 色吧在线观看| 不卡视频在线观看欧美| 国产精品一区www在线观看| 草草在线视频免费看| 在线播放无遮挡| 毛片女人毛片| 26uuu在线亚洲综合色| 国产av麻豆久久久久久久| 欧美成人a在线观看| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 中文在线观看免费www的网站| 免费观看人在逋| 亚洲一区二区三区色噜噜| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 亚洲无线在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品蜜桃在线观看 | 亚洲人成网站高清观看| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲av中文av极速乱| 丝袜喷水一区| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲人成网站在线播| 舔av片在线| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲激情五月婷婷啪啪| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 日韩欧美 国产精品| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久综合国产亚洲精品| 欧美精品一区二区大全| 久久精品国产亚洲av天美| 偷拍熟女少妇极品色| 1000部很黄的大片| 在线播放国产精品三级| 免费大片18禁| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产综合懂色| 日日摸夜夜添夜夜爱| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 青春草国产在线视频 | 高清在线视频一区二区三区 | 一本一本综合久久| 热99在线观看视频| av在线亚洲专区| 国产精品一区www在线观看| 久久久久久伊人网av| 久久鲁丝午夜福利片| 99热全是精品| 久久精品影院6| 在线观看免费视频日本深夜|