D-對(duì)羥基苯甘氨酸合成酶重組菌的高密度發(fā)酵工藝*

陳科奇，朱 海，鄭夢(mèng)澤，李婷婷，史大華

(江蘇海洋大學(xué) a.藥學(xué)院；b.江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;c.江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 連云港 222005)

0 引言

具有光學(xué)活性的D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-HPG)是最重要的D-氨基酸之一，被廣泛用作β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(如半合成青霉素類(lèi)和頭孢類(lèi))的工業(yè)生產(chǎn)。D-HPG可由D，L-對(duì)羥基苯海因(D,L-HPH)通過(guò)雙酶法生產(chǎn)[1-3]。D,L-HPH在D-海因酶(DHD)的作用下催化生成中間產(chǎn)物D-氨基甲酰-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-CpHPG)，再經(jīng)過(guò)D-氨甲酰水解酶(DCB)的作用脫去氨甲酰基，得到產(chǎn)物D-對(duì)羥基苯甘氨酸(D-HPG)[4]。這種海因酶—氨甲酰水解酶的生物催化方法由于反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速率快，產(chǎn)率高，成為目前生產(chǎn)D-HPG的主要酶學(xué)方法[5]。然而，雙酶法工藝的低生產(chǎn)率和高生產(chǎn)成本大大限制了其工業(yè)應(yīng)用。

目前關(guān)于酶法催化生產(chǎn)D-HPG的研究主要集中于酶突變的篩選或優(yōu)化工藝來(lái)提高催化效率。如樊帥等[6]基于對(duì)海因酶底物結(jié)合通道的分析，篩選到了催化效率較高的突變體。Engineer等[7]報(bào)道了一種具有廣泛底物譜和高催化效率的海因酶。王勝鋒等[8]則在雙酶反應(yīng)體系中額外添加海因消旋酶，從而降低轉(zhuǎn)化溫度，也有利于降低生產(chǎn)的能耗。但是迄今為止，大部分重組菌構(gòu)建都選擇大腸桿菌作為宿主細(xì)胞[9-11]。重組菌的催化活性雖然能夠達(dá)到應(yīng)用要求，但在大規(guī)模培養(yǎng)方面存在技術(shù)困難，例如生產(chǎn)成本高、形成包涵體等問(wèn)題[12-13]，限制了其工業(yè)應(yīng)用。獲取規(guī)模大且廉價(jià)的可用于工業(yè)化生產(chǎn)的重組工程菌迫在眉睫，其中對(duì)重組菌發(fā)酵條件的優(yōu)化和成本的控制是一個(gè)必然選擇。

本研究首先構(gòu)建可溶性表達(dá)的DHD和DCB重組大腸桿菌，并分別通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種酶的誘導(dǎo)表達(dá)與發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，如誘導(dǎo)劑濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)pH等，然后針對(duì)雙酶體系中的限速酶DCB進(jìn)行進(jìn)一步發(fā)酵條件的篩選，通過(guò)響應(yīng)面法對(duì)其培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，從而為獲得高效低廉的工程菌提供技術(shù)支持，為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株與質(zhì)粒D-海因酶基因、D-氨甲酰基水解酶基因與相關(guān)引物，由安徽通用生物公司進(jìn)行合成；實(shí)驗(yàn)所用E.coliTOP10，E.coliBL21(DE3)菌株及表達(dá)載體pBAD均由作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基 限制性?xún)?nèi)切酶NcoⅠ和HindⅢ、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒以及瓊脂粉均購(gòu)自愚公生物科技有限公司；氨芐青霉素(ampicillin，Amp)購(gòu)自上海生物工程股份有限公司；酵母粉和蛋白胨購(gòu)自英國(guó)OXIOD公司；其他試劑均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB種子培養(yǎng)基配制：稱(chēng)取5 g酵母粉，10 g胰蛋白胨，10 g NaCl于900 mL去離子水中，定容至1 L，121 ℃高溫蒸汽滅菌。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基配制：稱(chēng)取24 g酵母提取物，12 g胰蛋白胨，4 mL甘油于900 mL去離子水中，121 ℃高溫蒸汽滅菌，待冷卻后，加入100 mL的磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液配置方法為：KH2PO42.31 g，K2HPO412.54 g，溶解定容于100 mL去離子水，抽濾滅菌。

1.1.3 主要儀器 恒溫金屬浴，杭州米歐儀器有限公司；恒溫振蕩搖床，上海一恒科技有限公司；GenoSens 1860凝膠成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司；JN-02細(xì)胞高壓破碎儀，廣州聚能生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；T 100梯度PCR儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Synteny Neo 2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Tek公司；六聯(lián)排玻璃發(fā)酵罐(1 L×6)和5 L發(fā)酵罐，上海百倫科技有限公司；高效液相色譜儀，日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工程菌DHD與DCB的構(gòu)建 采用PCR方法得到合成在PUC19載體上的海因酶(Genebank：X91070)與氨甲酰水解酶(Genebank：X91070)基因；使用HindⅢ和NcoⅠ內(nèi)切酶對(duì)pBAD載體進(jìn)行雙酶切；將得到的基因片段與載體分別使用無(wú)縫克隆的方法連接，驗(yàn)證，測(cè)序準(zhǔn)確后轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)菌株，得到DHD與DCB工程菌。

1.2.2 誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

(1)優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度。將種子液以1∶50的體積比例接種于50 mL含終質(zhì)量濃度0.05 g/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8左右，加入不同濃度的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，分別設(shè)置誘導(dǎo)誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度為2，4，6，8 g/L, 發(fā)酵12 h。通過(guò)50 mL菌液的總酶活高低選定最佳誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度。

(2)優(yōu)化誘導(dǎo)溫度。將種子液以1∶50的體積比例接種于50 mL含終質(zhì)量濃度0.05 g/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8左右，加入阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，分別設(shè)置誘導(dǎo)溫度為16，22，27，32，37 ℃，發(fā)酵12 h。通過(guò)50 mL菌液的總酶活高低選定最佳溫度條件。

(3)優(yōu)化pH條件。將種子液以1∶50的體積比例接種于500 mL含終質(zhì)量濃度0.05 g/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，在1 L發(fā)酵罐中以37 ℃，220 r/min條件培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.8左右，加入阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，分別設(shè)置發(fā)酵過(guò)程中pH為5，6，7，8，9,發(fā)酵12 h。通過(guò)50 mL菌液的總酶活高低選定最佳pH條件。

1.2.3 酶活定義 酶活定義方法參考李法彬等[14]，具體實(shí)施方式如下。

(1)D-海因酶活性的測(cè)定。取0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，13 000 r/min離心3 min，收集菌體；用50 mmol/L，pH為8.0的Tris-HCl緩沖液洗滌菌體兩次，用2 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的D,L-HPH(溶于Tris-HCl緩沖液)重懸，37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)60 min，加入10 μL 6 mol/L的HCl終止反應(yīng)，取上清液用HPLC定量測(cè)定D,L-HPH的減少量。1個(gè)D-海因酶催化活性單位(U)定義為：在1 min內(nèi)水解1 mmol/L的D,L-HPH生成D-CpHPG所需要的酶量。即

UDHD=V·ΔC·m菌體/mDHD。

其中：ΔC表示HPLC測(cè)得的D,L-HPH減少量，mmol/L；V表示反應(yīng)體系體積，L；m菌體表示DHD菌體質(zhì)量，g；mDHD表示反應(yīng)體系加入的DHD的質(zhì)量，g。

(2)D-氨甲酰水解酶活性的測(cè)定。取 0.5 mL細(xì)胞沉淀用等體積的15 mmol/L的D-CpHPG反應(yīng)液重懸，37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)60 min, 加入10 μL 6 mol/L的HCl終止反應(yīng), 取上清液用HPLC定量測(cè)定D-HPG的含量。1個(gè)D-氨甲酰水解酶催化活性單位(U)定義為：1 min內(nèi)水解D-CpHPG生成1 mmol/L的D-HPG所需要的酶量。即

UDCB= ΔC·V·m菌體/mDCB。

其中：ΔC表示HPLC測(cè)得的D-HPG生成量，mmol/L；V表示反應(yīng)體系體積，L；m菌體表示DCB菌體質(zhì)量，g；mDCB表示反應(yīng)體系加入的DCB的質(zhì)量，g。

1.2.4 活性測(cè)定方法 活性表征方法參考鈕利喜等[15]的HPLC法。HPLC條件為：V(A:50 mmol/L乙酸-乙酸鈉溶液，pH=4.2)∶V(B:甲醇)=9∶1，總流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫30 ℃。

1.2.5 菌體密度測(cè)定 測(cè)量菌液在600 nm下的吸光度，將菌液稀釋直至吸光度在0.3～1.0范圍內(nèi)。將測(cè)得的吸光度乘以稀釋倍數(shù)，即為菌體密度。

1.2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基 通過(guò)單因素法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源與氮源種類(lèi)進(jìn)行優(yōu)化，然后通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，使用Design Expert 12軟件設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組，篩選對(duì)菌體生長(zhǎng)影響顯著的培養(yǎng)基成分。然后根據(jù)central composite design(CCD)實(shí)驗(yàn)原理，對(duì)顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Design Expert 12軟件經(jīng)多項(xiàng)式回歸分析，并對(duì)擬合方程作顯著性檢驗(yàn)，其統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性由F檢驗(yàn)確定。

1.2.7 5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證 在通過(guò)上述優(yōu)化得到的條件后，使用5 L發(fā)酵罐進(jìn)行放大驗(yàn)證。將種子液以1∶50 的體積比例接種于含有3 L發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，37 ℃培養(yǎng)。全過(guò)程使用體積分?jǐn)?shù)50%的氨水與磷酸維持發(fā)酵過(guò)程中的pH，通過(guò)額外流加0.2 g/mL的葡萄糖與轉(zhuǎn)速調(diào)控維持體系溶氧在30%以下。待OD600達(dá)到約20時(shí)，使用阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵。

1.2.8 催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

(1)兩種酶的投放比例。在37 ℃，50 mmol/L Tris-HCl(pH=8)，5 g/L底物的條件下，固定DCB的加入量(細(xì)胞干質(zhì)量)為底物質(zhì)量的0.75%，取m(DHD)∶m(DCB)分別為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8和1∶10，反應(yīng)48 h，通過(guò)產(chǎn)率來(lái)確定最佳投放比例。

(2)兩種酶的投放量。在37 ℃，50 mmol/L的Tris-HCl(pH=8)，5 g/L底物的條件下，固定DHD與DCB的比例，取DCB(細(xì)胞干質(zhì)量)分別為底物質(zhì)量的0.25%，0.50%，0.75%，1.00%與1.25%進(jìn)行試驗(yàn)，反應(yīng)48 h，通過(guò)其產(chǎn)率來(lái)確定最佳投放量。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理與分析 如無(wú)特別說(shuō)明，實(shí)驗(yàn)部分所述實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)進(jìn)行3組平行試驗(yàn)，數(shù)據(jù)圖像使用GraphPad Prism 8進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 工程菌DHD與DCB的構(gòu)建

分別將D-海因酶和D-氨甲酰水解酶基因構(gòu)建在pBAD載體上，測(cè)序成功后轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中，得到工程菌。首先在37 ℃培養(yǎng)OD600約為0.6，然后加入終質(zhì)量濃度2 g/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)發(fā)酵4 h，使用SDS-PAGE電泳對(duì)蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖1所示，DHD蛋白約為53 kDa，DCB蛋白約為34 kDa，與預(yù)期一致，兩種蛋白成功表達(dá)。

圖1 工程菌DHD與DCB蛋白表達(dá)

2.2 工程菌DHD與DCB的誘導(dǎo)條件

在蛋白初步表達(dá)成功后，為達(dá)到最佳的蛋白表達(dá)效果，實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種工程菌的誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先是對(duì)誘導(dǎo)劑阿拉伯糖濃度進(jìn)行優(yōu)化。使用LB培養(yǎng)基分別搖瓶培養(yǎng)重組工程菌，當(dāng)OD600達(dá)到0.8時(shí)，分別使用不同終濃度的阿拉伯糖在16 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)[16-17]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

a DHD在不同濃度阿拉伯糖誘導(dǎo)下的OD600與50 mL菌液的酶活

從圖2可以看出，在阿拉伯糖的質(zhì)量濃度為6 g/L時(shí)，50 mL菌液的酶活達(dá)到最高，當(dāng)誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度進(jìn)一步升高時(shí)，酶活水平趨勢(shì)不變甚至降低。基于工業(yè)能耗方面的考慮，選擇兩種重組菌誘導(dǎo)劑質(zhì)量濃度為6 g/L。

溫度對(duì)于菌體生長(zhǎng)和活性影響顯著，因此對(duì)誘導(dǎo)溫度進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。兩種重組菌在37 ℃時(shí)酶活達(dá)到最高水平，并且大腸桿菌最佳培養(yǎng)溫度在37 ℃，進(jìn)一步升高溫度對(duì)大腸桿菌的培養(yǎng)及酶的穩(wěn)定性具有不利影響，因此選擇最佳誘導(dǎo)溫度為37 ℃。

a DHD在不同溫度下的OD600與50 mL菌液的酶活

使用六聯(lián)排發(fā)酵罐(6×1 L)進(jìn)行pH條件的篩選[18]?？刂婆囵B(yǎng)過(guò)程的pH進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4。當(dāng)pH為5和9時(shí)，兩種酶的總酶活明顯低于其他條件，即過(guò)酸或過(guò)堿的環(huán)境對(duì)于兩種工程菌的培養(yǎng)具有抑制作用。對(duì)于DHD而言，pH為6時(shí)酶活最高，而DCB在pH為7時(shí)表現(xiàn)更為優(yōu)越。

a DHD在不同pH下的OD600與50 mL菌液的酶活

2.3 工程菌DHD與DCB發(fā)酵碳氮源的選擇

在包含酵母粉24 g/L，胰蛋白胨12 g/L，K2HPO412.54 g/L，KH2PO42.31 g/L的培養(yǎng)基[19]中加入不同種類(lèi)的碳源(5 g/L)，在37 ℃下培養(yǎng)，并使用終質(zhì)量濃度6 g/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，以可溶性淀粉為DHD重組菌的碳源時(shí)，酶活要明顯高于其他種類(lèi)的碳源，因此優(yōu)選DHD的碳源為可溶性淀粉；以葡萄糖為DCB重組菌發(fā)酵碳源時(shí)，無(wú)論是菌體密度還是活性都要高于其他種類(lèi)的碳源，因此優(yōu)選DCB的碳源為葡萄糖。

固定其他成分，在培養(yǎng)基中加入不同種類(lèi)的氮源(12 g/L)，在37 ℃下培養(yǎng)，并使用終質(zhì)量濃度6 g/L 阿拉伯糖誘導(dǎo)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明大豆蛋白胨為兩種重組菌氮源時(shí)，兩種重組菌的酶活性皆?xún)?yōu)于其他種類(lèi)的氮源，且大豆蛋白胨具有成本優(yōu)勢(shì)，更利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此優(yōu)選兩種重組菌的氮源為大豆蛋白胨。

a 不同碳源對(duì)DHD的OD600與50 mL菌液酶活的影響

2.4 工程菌DCB的發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)可以看出，所得兩種工程菌DHD與DCB的活性較優(yōu)化前有了顯著提高，但催化反應(yīng)限速酶DCB的表達(dá)量達(dá)不到預(yù)期需求。為提高菌體量，使用響應(yīng)面法對(duì)限速酶DCB的培養(yǎng)基成分進(jìn)行優(yōu)化[20]。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)顯著性分析

由結(jié)果可知，只有兩種為顯著因素，因此使用Design Expert 12軟件對(duì)這兩種因素進(jìn)行二因素五水平的central composite design(CCD)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以DCB的菌體量為響應(yīng)值，通過(guò)回歸擬合及方差分析，得到預(yù)測(cè)的最佳培養(yǎng)基組分配方。實(shí)驗(yàn)的因素、水平設(shè)置見(jiàn)表4。

表4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平

根據(jù)二因素五水平的CCD響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，共設(shè)計(jì)13組實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)組及數(shù)據(jù)見(jiàn)表5。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二階回歸擬合，得到回歸方程為

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Y=0.098 6X1+0.492 2X2-0.080 6X1X2-

P=0.005 4<0.01。

其中，Y為DCB的OD600值，X1和X2分別為酵母粉和K3PO4濃度在[-α，α]上的比例映射。

由方差分析可知，該模型高度顯著，可靠性高。模型存在最優(yōu)極值條件，搖瓶發(fā)酵時(shí)，在響應(yīng)曲面最高點(diǎn)處有OD600極值(見(jiàn)圖6)，此時(shí)最優(yōu)條件為酵母粉28.24 g/L，K3PO4149.51 mmol/L(即3.88 g/L的KH2PO4與21.07 g/L的K2HPO4)。在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，其結(jié)果與模型方程預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，表明該模型方程能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵效果。

a 三維圖

2.5 工程菌DHD與DCB的5 L發(fā)酵罐發(fā)酵

基于上述“2.1”“2.2”“2.3”部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行DHD發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:酵母粉24 g/L，大豆蛋白胨12 g/L，可溶性淀粉5 g/L，K2HPO412.54 g/L，KH2PO42.31 g/L。控制溶解氧為30%，發(fā)酵pH為6，在37 ℃下進(jìn)行誘導(dǎo)發(fā)酵，分別發(fā)酵不同的時(shí)長(zhǎng)，研究不同發(fā)酵時(shí)間下菌體生長(zhǎng)狀態(tài)與活性表達(dá)情況，結(jié)果如圖7a所示。DHD工程菌隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，其菌體密度隨之增長(zhǎng)，所以總酶活呈上升趨勢(shì);發(fā)酵24 h后，隨著發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)，菌體可能出現(xiàn)自溶或死亡，總酶活下降，因此選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為24 h。3 L培養(yǎng)基得到了(160.3±2.25)g的DHD菌體，1 L菌液的總酶活為(939.4±4.80)U，為未優(yōu)化的LB培養(yǎng)基的14.4倍。

基于上述“2.1”“2.2”“2.3”“2.4”部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行DCB發(fā)酵驗(yàn)證，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為酵母粉28.24 g/L，大豆蛋白胨12 g/L，葡萄糖5 g/L，K2HPO421.07 g/L，KH2PO43.88 g/L?？刂瓢l(fā)酵罐中溶解氧為30%，發(fā)酵pH為7，在37 ℃下培養(yǎng)至OD600在20左右，加入6 g/L的阿拉伯糖進(jìn)行誘導(dǎo)，分別發(fā)酵不同的時(shí)長(zhǎng)，研究不同發(fā)酵時(shí)間下菌體生長(zhǎng)狀態(tài)與活性表達(dá)情況，結(jié)果如圖7b所示。DCB工程菌隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，總酶活呈上升趨勢(shì)，在24 h后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酶活趨于平穩(wěn)，因此選擇最佳發(fā)酵時(shí)間為24 h。3 L培養(yǎng)基得到了(140.1±2.87)g的DCB 菌體，1 L菌液總酶活為(385.5±3.88)U，為未優(yōu)化的LB培養(yǎng)基的33.85倍。

a 對(duì)DHD的OD600與50 mL菌液酶活的影響

2.6 催化反應(yīng)條件的優(yōu)化

基于兩種酶的活性差異,為了提高催化效率，降低工業(yè)能耗，需要進(jìn)一步對(duì)催化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

因?yàn)镈HD的酶活性強(qiáng)于DCB，所以首先通過(guò)增加反應(yīng)體系中的DCB含量來(lái)對(duì)兩種酶的投放比例進(jìn)行初步探索，然后在相同反應(yīng)條件下，固定上述比例投放不同量的全細(xì)胞反應(yīng)液，研究不同酶量對(duì)于反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖8所示。

a 投料比例的影響

由圖8a可知，隨著DCB與DHD投料比的增加，催化效率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)m(DCB)∶m(DHD)在8∶1之后，產(chǎn)率趨于平穩(wěn)，最后可以達(dá)到90%左右，故確定兩種酶的比例m(DCB)∶m(DHD)=8∶1。由圖8b可知，在m(DCB)∶m(DHD)=8∶1條件下，隨著DCB投放量的增加，催化反應(yīng)效率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而當(dāng)DCB投放量為1.00%時(shí)，產(chǎn)率趨于平緩,可以達(dá)到(92.43±3.76)%，因此確定兩種酶的添加量為DHD 0.125%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，DCB 1.00%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))。

3 結(jié)論

雖然目前酶法生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化，重組菌的催化活性也能夠達(dá)到應(yīng)用要求，但是，重組大腸桿菌在大規(guī)模培養(yǎng)方面存在的成本及技術(shù)困難，依然制約著其工業(yè)應(yīng)用。針對(duì)規(guī)?；a(chǎn)的困境，本研究以合成酶DHD和DCB的重組大腸桿菌為研究對(duì)象，進(jìn)行高密度發(fā)酵工藝的初步探索，以期得到規(guī)?；墓I(yè)用酶。

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)篩選了DHD與DCB工程菌的最佳誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、pH及誘導(dǎo)后發(fā)酵時(shí)間等多個(gè)條件，并通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到了限速工程菌DCB的最佳培養(yǎng)基組成為酵母粉28.24 g/L，大豆蛋白胨12 g/L，葡萄糖5 g/L，K2HPO421.07 g/L，KH2PO43.88 g/L。在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示：在碳源為葡萄糖，氮源為大豆蛋白胨，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，控制發(fā)酵體系pH為7，開(kāi)始發(fā)酵16 h，添加終質(zhì)量濃度為6 g/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)24 h時(shí)，DCB工程菌的菌體產(chǎn)量為(46.7±0.96)g/L，1 L菌液總酶活(385.5±3.88)U；在碳源為可溶性淀粉，氮源為大豆蛋白胨，誘導(dǎo)溫度為37 ℃，控制發(fā)酵體系pH為6，開(kāi)始發(fā)酵12 h，添加終質(zhì)量濃度為6 g/L的阿拉伯糖誘導(dǎo)24 h時(shí)，DHD工程菌的菌體產(chǎn)量為(53.4±0.75)g/L，1 L菌液總酶活為(939.4±4.80)U。在投料比為m(DCB)∶m(DHD)=8∶1，DCB的投放量為底物質(zhì)量的1.00%時(shí)，可以達(dá)到(92.43±3.76)%的轉(zhuǎn)化效率。

本研究通過(guò)重新構(gòu)建合成酶重組菌，進(jìn)行高密度發(fā)酵工藝的優(yōu)化，對(duì)反應(yīng)過(guò)程中存在的問(wèn)題進(jìn)行了探索和解決，降低了工藝成本，為酶法生產(chǎn)D-對(duì)羥基苯甘氨酸的大規(guī)模工業(yè)化提供了理論和技術(shù)支撐。