傣藥龍血竭對腦缺血大鼠的腦保護作用

張曉燕，蔡宇宇，王玉瑤，孫海珍

（黑龍江中醫(yī)藥大學 藥學院，黑龍江 哈爾濱 150000）

龍血竭是一種紅色的樹脂，1972年在中國云南省發(fā)現的龍血竭（Longxue Jie）來源于百合目龍舌蘭科劍葉龍血樹 Dracaena cochinchinensis(Lour.)S.C.Chen 的樹脂提取物，亦稱“廣西血竭”，是民族傣藥“龍血竭”的主要來源。其藥理作用有抗炎作用：臨床上龍血竭合用美沙拉嗪能降低TNF-α、IL-6及CRP的水平，從而治療結腸炎[1]，龍血竭能抑制肺組織的炎癥程度和膠原過度沉積達到急性炎癥治療[2]；活血化瘀作用：研究表明PAI-1 能增加動靜脈血栓形成的風險，龍血素B能有效的阻止uPA/PAI-1復合物的形成，抑制PAI-1的活性，而產生活血化瘀作用[3-4]；抗肝/肺纖維化作用：龍血竭抑制 IL-2和上調 IL-5等炎癥因子，降低透明質酸和轉氨酶而產生降低肝/肺纖維化的作用[5-6]。降糖、降脂作用：龍血竭的有效成分總黃酮能降低三酰甘油、總膽固醇，降低 IL-6，提高胰島素產生降糖降脂的作用[7]。目前臨床應用于心血管疾病[8]，皮膚科疾病[9-11]，婦產科疾病[12-13]，消化系統(tǒng)疾病[14-15]和肛腸科疾病[16-17]等。

腦缺血（Cerebral Ischemia，CI）是微循環(huán)障礙性疾病。臨床顯示，老年人是缺血性腦卒中的易患人群，可能與并發(fā)癥高血壓，高血脂有關[18]。腦卒中具有較高發(fā)病率、致死率、致殘率、復發(fā)率特點[19]，中醫(yī)認為，腦和五臟具有密切的聯(lián)系，產生腦卒中病癥時，有害物質可運送到重要器官，導致器官損傷。中藥多成分，多靶點和良反應少[20]，因此在臨床生有著重要意義。本文研究中藥龍血竭抗腦缺血藥效作用，為今后龍血竭在心腦血管疾病和神經保護領域奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 藥品與試劑

龍血竭(龍血竭制成粉末，批號：20191106)：廣西中醫(yī)藥研究院；腦心通膠囊（規(guī)格0.4 g/粒，批號：1911166）：陜西步長制藥有限公司；2%TTC染液（批號 20190925）：北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號：20090514）：天津市光復精細化工研究所；GSH-Px（批號：A005-1）、SOD（批號：A001-3）、MDA（批號：A003-1）、CAT（批號：A007-1-1）試劑盒：南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅染液（HE，批號202105）：武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.1.2 試驗動物

Sprague-Dawley大鼠，SPF級，雌雄各半，9周歲，體質量（260±20） g，由黑龍江中醫(yī)藥大學試驗動物中心提供，合格證號：SCXK（黑）2018-007，飼養(yǎng)條件：溫度 25 ℃，濕度 50%，晝夜間隔12 h，自由飲水。

1.2 儀器與設備

XW-80A渦旋混合器：上海琪特分析儀器有限公司；CM-36型圓形水浴氮吹儀：北京成萌偉業(yè)科技有限公司；M200 PRO酶標儀：瑞士帝肯集團公司；YD1508R輪轉式病理切片機：德國徠卡公司；TB-P1自動包埋機：上海名元實業(yè)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 造模

大鼠術進食供水12 h，以10%水合氯醛溶液腹腔注射大鼠，將四肢和頭部固定在試驗臺上，頸正中剪開皮膚約2 cm切口，鈍性分離，暴露左側頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）。分離出CCA，找到動脈Y型分叉，取縫合線于左側CCA遠心端和近心端及ECA處掛線備用。用微動脈夾暫時夾閉 ICA，然后近心端結扎CCA、ECA。在CCA分叉處，近心端約4 mm處傾斜45度剪切口，將線栓（魚線剪成5 cm長的線段，5 mm以下蘸取石蠟）從切口處朝 ICA入顱方向插入，感到有輕微阻力即停止。扎緊，縫合，將魚線尾部露出體外。用燈照射保持肛溫為37 ℃，90 min后將魚線拔出約2 cm并剪去露出體外部分。假手術組僅將大鼠皮膚切開，剝離暴露CCA、ECA及ICA后縫合。

1.3.2 模型判斷指標

采用Zea Longa5 級評分標準評價（無神經功能損傷（0分），對側前肢伸展障礙（1分），向手術對側打圈（2分），行走時向手術對側傾倒（3分），意識昏迷（4分）），篩選成功模型（大于0分），未入選大鼠棄之。

1.3.3 動物分組與給藥

將有效造模大鼠隨機分為六組，分別為假手術組（Sham）、模型組（Model）、龍血竭組（高（DBH）、中（DBM）、低（DBL）組）和腦心通膠囊組（NXT），每組20只，灌胃劑量按照1 mL/100g計算，灌胃 1次/d，連續(xù)灌胃14 d。

假手術組（Sham）和模型組（Model）給予生理鹽水。

龍血竭組：將其分為高（DBH）、中（DBM）、低（DBL）組，是通過取適量龍血竭混懸于0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液中，配制成濃度的分別2.16、1.08、0.54 g/kg的混懸液。

腦心通膠囊組（NXT）：規(guī)格為每粒 0.4 g，根據劑量換算，用純水配制成濃度為54 mg/kg的混懸液。

1.3.4 檢測指標

1.3.4.1 神經功能評分 在術后第 1、4、7、14 d參照改良神經功能缺損評分（mNSS），神經功能評分在0～18分之間，0分為正常；1～6分為輕度神經功能缺損；7～12分為中度缺損；13～18分為重度缺損。具體評分標準見表1。

表1 神經功能評分標準Table 1 Nerve function scoring criteria

1.3.4.2 腦組織含水量（%）及腦梗死體積測定腦組織含水量：各組隨機選取6只大鼠，于第7 d灌胃給藥后進行斷頭取腦，精密稱濕重，后80 ℃干燥至恒重，稱三次取均值。

腦組織含水量（%）=（腦組織濕重–腦組織干重）/腦組織濕重×100%

腦梗死體積（%）=（非缺血側半球面積–缺血側半球未梗死面積）/全腦面積×100%

1.3.4.3 HE染色和 TTC染色 將各組大鼠在術后第 14 d行神經功能缺損評分后，隨機選取 12只，隨機取6只用水合氯醛腹腔麻醉，打開胸腔、暴露心臟，剪開右心耳，自左心尖灌注0.9%氯化鈉溶液，當右心耳流出無血色液體，斷頭取腦，大鼠的腦組織于–20 ℃冰箱中20 min后進行常規(guī)的TTC染色。其余6只進行相同步驟，通過氯化鈉處理后，用4%多聚甲醛從左心尖灌注，當全身僵硬，迅速斷頭，取腦，置于4%多聚甲醛固定液中，進行HE染色。

1.3.4.4 對血清中的氧化應激水平的影響 將各組大鼠禁食供水12 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，經腹主動脈采血，置于10 mLEP管室溫靜置1 h后，4 ℃，4 000 r/min離心10 min，合并同組大鼠血清。采用酶標儀對SOD、MDA、GSH-PX、CAT進行活性檢測。

1.4 數據分析

神經功能行為學評分和腦組織含水量采用單因素方差分析（ANOVA），用spss25.0進行計算，結果用均數±標準差（X±S）表示，作圖使用Graphpad Prism9，圖像分析采用Image Pro Plus 6.0，兩組間采用t檢驗，當P<0.05時，表示有顯著性差異，具有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 試驗結果

2.1.1 對神經功能的影響

Sham組大鼠的神經功能從輕微損傷恢復至正常；Model組的神經功能缺損明顯且損傷長期存在。給藥組與Model組相比，給藥組神經功能評分降低趨勢一致，均有顯著改善（P<0.01）；第14 d DBH/M組的神經受損恢復最好，且優(yōu)于NXT組，見表2。

表2 各組大鼠神經功能評分比較Table 2 Comparison of neurological function scores in rats

2.1.2 對腦組織含水量及腦梗死體積的影響

相比 Sham 組，Model組大鼠腦組織含水量顯著增加（P<0.01）。給藥組大鼠腦組織含水量較Model組均低，具有顯著的統(tǒng)計學差異（P<0.05或P<0.01），HBH與NXT兩者的含水量基本相同，表明龍血竭可降低腦組織含水量，見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量Table 3 Percentage of brain water content in rats

Sham組可見均勻紅色腦組織切片，腦組織切片未見梗死病灶（0.00%±0.00）,與Sham組相比，Model組大鼠術側腦組織梗死明顯且體積較大（45.13%±4.05，P<0.01）；與 Model組相比，各給藥組白色梗死區(qū)域均相對減少，尤其是 DBH（32.42%±2.57，P<0.01）和 DBM 組（34.84%±3.30，P<0.05）。治療效果優(yōu)于 NXT組。認為龍血竭能夠不同程度的改善腦組織供血不足，降低大鼠缺血側腦梗死體積，見圖1。

圖1 腦梗死體積Fig. 1 Cerebral infarction volume

2.1.3 對腦組織學的影響

Sham組細胞完整，分布均勻，細胞核居中，核仁清晰。Model組中有明顯組織結構異常，結構紊亂，細胞分布不均勻，可見大量細胞核移位及固縮，排列稀疏，血管周圍V-R腔增寬。相比Model組，各給藥組僅皮層少數細胞固縮，且DBH/M組可見異常變化較少，個別神經元固縮，皮層固縮細胞數量減少，小膠質細胞有顯著修復，見圖2。

圖2 腦組織HE染色切片圖Fig. 2 HE stained sections of brain tissue

2.1.4 對氧化應激的影響

與Sham組相比，Model組SOD活力下降顯著（P<0.01），GSH-PX及CAT活力有所下降（P<0.05），MDA含量上升不明顯（P>0.05）。與Model相比，龍血竭組SOD、GSH-PX活力均有顯著提高（P<0.05 或P<0.01），且 DBH組能顯著降低MDA含量（P<0.05）。其中，NXT組降低 MDA含量無統(tǒng)計學差異（P>0.05），提高 CAT、SOD活力作用有顯著差別（P<0.05），見表4。

表4 對CI大鼠氧化應激水平的影響Table 4 Effects on oxidative stress levels in CI rats

2.2 試驗分析

近年來大腦中動脈栓塞模型（MCAO廣泛應用于腦缺血動物模型，因為它與人腦缺血相似，不需要顱骨切除，損傷小。腦缺血再灌注能使腦部造成更大的損傷，更好地模擬腦缺血的行為改變和病理特征[21]，由于腦缺血復雜的發(fā)病機制，包括興奮毒性、離子失衡、氧化應激和炎性反應等[22]，防治腦缺血的問題也在更深層次的探索當中。腦缺血缺氧后，腦組織代謝異常、腦內氧化應激與自由基的過量產生，細胞膜通透性增加，低氧環(huán)境導致白細胞滲入低氧組織細胞水腫，引起血腦屏障滲漏和水腫，導致腫瘤壞死因子升高，從而引發(fā)細胞炎性因子釋放，損傷腦組織中內皮細胞、神經元、膠質細胞，引起細胞酸中毒，能量代謝障礙等。隨后導致神經細胞的凋亡，缺血再灌注期間神經功能的下降[23-26]。

當中樞神經系統(tǒng)被破壞，所產生的有害物質超出自生調節(jié)，由于腦部對缺血缺氧非常敏感，因此腦組織會產生微循環(huán)障礙，細胞膜通透性增加，引起腦組織含水量增加，細胞形態(tài)發(fā)生改變。HE染色法是組織學、胚胎學、病理學教學與科研中最基本，最廣泛的技術方法[27]。蘇木精染液為堿性，使細胞核內的染色質與胞質內的核酸顯紫藍色；伊紅為酸性染料，使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。由試驗[28]表明，頸動脈狹窄解除能夠降低腦組織含水量，也使血腦屏障的通透性降低含水量。本試驗中龍血竭組降低腦組織含水量，其可能是通過降低血腦屏障通透性而產生的效果。根據文獻[29]可知，給藥組多數神經細胞結構、形態(tài)改變相對較輕，核固縮少，排列整齊，這與本試驗的結果一致，可推斷出龍血竭能改善海馬體組織，從而達到腦保護作用。腦缺血再灌注后引起一系列的氧化應激反應[30-31]，并且氧化應激負荷時，自由基產生過量，導致有害產物丙二醛（MDA）等水平升高，病情加重。而SOD、CAT、GSH-Px能清除過氧化物，起到保護細胞膜結構和功能的完整性[32]的作用。由研究[33-34]表明，不同濃度羽扇豆醇，能使血清 SOD和 GSH水平升高，MDA水平降低，從而增加抗氧化物酶活性，有效減少氧化應激損傷，與本試驗結果一致，且DBH組降低MDA水平遠遠優(yōu)于NXT組，表明龍血竭組有較好的腦保護作用。

嚴重腦缺血能大面積腦梗塞，當達到四分之三梗阻會出現偏癱、偏身感覺障礙和嗜睡等現象[35]，TTC是脂溶性光敏感復合物，1958 年開始用來檢測哺乳動物組織的缺血梗塞[36]。正常組織中脫氫酶活性高可與TTC反應顯紅色，缺血組織顯白色。梁萍[37]研究中提到，腦梗死面積減小能恢復腦部神經和記憶，本試驗龍血竭組能減少腦阻塞面積，且治療效果優(yōu)于 NXT組，有顯著性差異（P<0.05），說明也有同樣的腦保護作用。

3 結論

龍血竭可降低腦組織含水量和血腦屏障通透性，減輕神經細胞形態(tài)和結構的改變，抑制海馬體組織的損傷，從而達到腦組織的保護作用；提高機體的氧化應激能力，增強人體的防御力和神經血管的結構和功能，改善腦缺血再灌注組織病理損傷；龍血竭還能縮小腦梗死面積，恢復大鼠的記憶和神經。說明龍血竭對大鼠腦缺血疾病有一定的保護作用。